專利名稱：：一種桑葉多酚的制備方法及其微膠囊和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種桑葉多酚的制備方法，本發(fā)明還涉及以該方法制成的桑葉多酚為原料制備的微膠囊，以及該微膠囊在制備具有抗氧化和護(hù)肝功能食品方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：桑樹屬于?？?Moraceae)，桑屬(MorusL)。桑樹自然分布范圍廣，亞洲、歐洲、大洋洲、美洲和非洲都有桑樹生長，其中以亞洲最多。我國是世界蠶絲業(yè)的發(fā)源地，栽桑養(yǎng)蠶已有4600多年的歷史，同時也是桑樹的重要起源中心之一，因此我國桑樹資源極為豐富，據(jù)《中國桑樹品種志》載，目前我國有15個桑種及其4個變種，是世界上桑種最多的國家。研究發(fā)現(xiàn)，桑葉中的主要多酚類物質(zhì)包括綠原酸、戸丁、兒茶素、丁香酸、龍膽酸、表兒茶素、4-甲基鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、槲皮素、山奈素等，動物實驗結(jié)果表明攝入多酚類化合物如矢車菊素-3-葡萄糖苷(C3G)可以降低大鼠血清脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量，增強(qiáng)血清對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抵抗性。除上述直接的抗氧化作用外，多酚類化合物還改變了許多氧化應(yīng)激有關(guān)的病理生理過程。Bendia等發(fā)現(xiàn)C3G可以調(diào)節(jié)肝星形細(xì)胞增生和I型膠原蛋白的合成，對預(yù)防肝臟慢性纖維化有一定作用。Tsuda等觀察到C3G的抗氧化作用可以減少肝臟缺血-再灌注后白細(xì)胞趨化因子的生成，從而減輕了肝臟的損傷程度。同樣將從黑豆皮中提取的花色苷喂給大鼠后，可以減輕缺血-再灌注對心臟的損傷。桑葉多酚的抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，如桑葉多酚的重要組成部分的一類化合物一桑黃酮，其基本結(jié)構(gòu)是由兩個苯環(huán)(A-與B-環(huán))通過中央三碳鏈(C-環(huán))相互聯(lián)結(jié)而成的一系列CVC3-C6化合物，具有2苯基-苯并吡喃陽離子結(jié)構(gòu)。由于共軛效應(yīng)，桑黃酮氧原子上的不成對電子并不固定于氧原子，而是靠近苯環(huán)，從而削弱氫氧鍵，使羥基上氫原子活性提高，易于脫去而成為氫供體。桑黃酮化合物清除自由基和抗氧化的作用機(jī)理在于它阻止了自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的3個階段即與02—。反應(yīng)阻止自由基引發(fā)；與金屬離子螯合阻止OH，生成;與脂質(zhì)過氧基(ROO-)反應(yīng)阻止脂質(zhì)過氧化過程。桑黃酮化合物的抗氧化、清除自由基的性質(zhì)，是其具有某些生理活性的基礎(chǔ)。從桑葉中提取桑葉多酚目前采用的方法主要有溶劑萃取法、重金屬鹽沉淀法、超臨界流體萃取法、超聲法、微波法和樹脂吸附法等，傳統(tǒng)提取工藝不論是使用水或有機(jī)溶劑，提取時間都較長，在溫度較高情況下桑葉多酚還易發(fā)生氧化，造成品質(zhì)下降，得率降低；溶劑萃取法需用氯仿等有機(jī)溶劑脫除色素和咖啡因，沉淀法需采用重金屬離子沉淀濾液中的多酚類化合物，這兩種方法易導(dǎo)致植物多酚產(chǎn)品中有機(jī)溶劑或重金屬殘留，而且桑葉多酚得率不高，單獨(dú)的超聲法、微波法和樹脂吸附法等也存在桑葉多酚的得率不高的問題。桑葉多酚粉末的穩(wěn)定性較差，在潮濕、陽光、高溫等條件下極易發(fā)生氧化、聚合、縮合等反應(yīng)，使其分子結(jié)構(gòu)中有生理活性的酚羥基變成醌，在模擬腸液和胃液經(jīng)過腸胃消化，結(jié)構(gòu)會遭到破壞，影響了其保健效果。另外，由于桑葉多酚自身存在的異味，同樣影響了其進(jìn)一步的應(yīng)用。圓此，尋找避免多酚類化合物等自動氧化的方法以期提高其活性一直是醫(yī)學(xué)界和食品營養(yǎng)界關(guān)注的課題。此外，還存在外觀品質(zhì)方面發(fā)生諸多不良變化，桑葉多酚中的兒茶素等物質(zhì)在非保護(hù)狀態(tài)下生物利用率不高等問題。微膠囊技術(shù)(Microencapsul-ationtechnology),是將固、液、氣態(tài)物質(zhì)包埋到微小、半透性或封閉的膠囊內(nèi)，使內(nèi)容物在特定的條件下以可控的速度釋放的技術(shù)。這一微小封閉的膠囊即微膠囊.其大小通常在l1000^im之間。微膠囊的結(jié)構(gòu)可分為芯材和壁材，所謂芯材即被包埋的物質(zhì)，所謂壁材即用于包埋的物質(zhì)。無論物質(zhì)是具有親水性還是具有親油性.大多數(shù)氣體、液體和同體均可以被包囊。微膠囊化的主要目的包括可控制釋放，極大提高有效成分的生物利用度；改變藥物的物理性質(zhì)，增加藥物的穩(wěn)定性；避免首過效應(yīng)，減少毒副作用；改變藥物的性狀，減少復(fù)方制劑中藥物之間的配伍禁忌；掩蓋不良異味與刺激性；藥物的靶向性等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個目的在于提供一種桑葉多酚的制備方法。本發(fā)明的第二個目的在于提供以桑葉多酚為原料制成的微膠囊。本發(fā)明的目的還在于提供該桑葉多酚微膠囊在制備具有抗氧化和護(hù)肝作用的功能食品中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案以桑葉多酚含量為跟蹤目標(biāo)，集成超聲-微波協(xié)同萃取、超濾、大孔吸附樹脂純化等多項提取分離純化工藝，獲得高純度桑葉多酚，采用微膠囊技術(shù)制備得桑葉多酚微膠囊，同時使其應(yīng)用于具有抗氧化和護(hù)肝功效作用的功能食品。為實現(xiàn)本發(fā)明的第一個目的，本發(fā)明提供的桑葉多酚的制備方法，它包括以下步驟(1)取桑葉粉末，加入其8~10倍重量的乙醇磷酸溶液，超聲-微波協(xié)同萃取2~3次，合并提取液，過濾，濃縮至原體積1/10~2/5的濃縮液，得桑葉多酚粗提液；(2)取桑葉多酚粗提液經(jīng)截留分子量為5萬和8萬Da的膜分離，得截留分子量為5~8萬Da之間的桑葉多酚溶液；(3)取桑葉多酚溶液，進(jìn)行大孔吸附樹脂柱層析得到洗脫液，將洗脫液在455(TC濃縮至原體積的1/4~1/2后，冷凍干燥后得桑葉多酚粉末。在上述桑葉多酚的制備方法中步驟(l)中乙醇磷酸溶液的濃度為60~80%。步驟(1)中超聲-微波協(xié)同萃取的pH為3~4，溫度為45~55°C。步驟(l)中超聲波頻率30-40kHz，微波功率為50~100W。步驟(3)中的大孔吸附樹脂柱層析包括以下步驟a.吸附調(diào)節(jié)桑葉多酚溶液pH2.0~4.0，濃度為3.0~5.0mg/mL，流速為3.5~5.5柱體積/h，體積為5.0~7.0柱體積，過柱；b.洗脫選擇濃度為70~80%的乙醇溶液作為洗脫液，洗脫速率為23柱體積/h，洗脫液的體積為34柱體積，收集洗脫液。本發(fā)明提供的由上述方法制備的桑葉多酚為原料制成的微膠囊，它包括芯材，壁材和乳化劑，所述芯材為桑葉多酚，壁材經(jīng)預(yù)處理后，加入桑葉多酚芯材，同時加入占芯材和壁材總重量3~5%的乳化劑進(jìn)行乳化，調(diào)節(jié)總固形物的重量含量為5~8%，混勻，干燥后即得桑葉多酚微膠囊。在上述微膠囊的制備方法中步驟(4)中所述芯材和壁材的重量份比為1.5~3:1。步驟(4)中所述壁材為羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、乙基纖維素、麥芽糊精、明膠中的一種或幾種組成的復(fù)合壁材。本發(fā)明所述壁材均為生物可降解高分子材料，是重要的壁材填充劑和基質(zhì)形成劑，具有溶膠及凝膠的可逆轉(zhuǎn)化、成膜性能好等特點(diǎn)。步驟(4)中所述乳化劑為大豆卵磷脂、十二烷基硫酸鈉、聚乙烯醇中的一種。本發(fā)明所述乳化劑可分散在分散質(zhì)的表面時，形成薄膜或雙電層，可使分散相帶有電荷，能阻止分散相的小液滴互相凝結(jié)，使形成的乳濁液比較穩(wěn)定。本發(fā)明提供的桑葉多酚的微膠囊，可與一種或多種食品學(xué)上所能接受的載體，制備成膠囊、片劑、沖劑或飲料等劑型。本發(fā)明以桑葉多酚微膠囊粉為主要原料，與桑椹花青素提取物、黑米花色苷提取物或黑大豆花色苷提取物中的一種或幾種混合配制成具有抗氧化作用的膠囊產(chǎn)品，各組分的重量含量為桑葉多酚微膠囊粉40~60%，桑椹花青素提取物20~30%，黑米花色苷提取物10~20%，黑大豆花色苷提取物1020%。本發(fā)明還能以桑葉多酚微膠囊粉為主要原料，與e-環(huán)糊精、麥芽糊精、蔗糖或葡萄糖中的一種或幾種混合均勻后經(jīng)高效制粒機(jī)制粒及干燥后獲得具有護(hù)肝作用的桑葉多酚護(hù)肝顆粒產(chǎn)品，各組分的重量含量為桑葉多酚微膠囊粉20~40%，6-環(huán)糊精0~2%，麥芽糊精20~30%，蔗糖20~30%，葡萄糖20~30°/0。藥學(xué)試驗表明，本發(fā)明提供的桑葉多酚微膠囊，可研制成對抗氧化和護(hù)肝有保健作用的功能食品，如復(fù)合多酚膠囊和桑葉多酚顆粒。本發(fā)明提供的桑葉多酚微膠囊的制備方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)采用超聲-微波協(xié)同低溫萃取技術(shù)提取桑葉多酚克服了傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，可在低溫短時間內(nèi)有效浸提桑葉多酚，具有提取時間短、溫度低、提取率高等優(yōu)點(diǎn)。(2)通過大孔吸附樹脂對桑葉多酚的富集和純化，桑葉多酚樹脂吸附前桑葉多酚純度為15.33%,樹脂吸附后純度為95.21%。(3)通過桑葉多酚微膠囊化，解決了桑葉多酚粉末的穩(wěn)定性較差的問題，同時還解決了桑葉多酚自身存在的異味和桑葉多酚中的兒茶素等物質(zhì)在非保護(hù)狀態(tài)下生物利用率不高問題。(4)本發(fā)明桑葉多酚微膠囊與其它載體合用，可制備成具有抗氧化和護(hù)肝有保健作用的功能食品，附加值高，為桑葉的深加工提供了方向，有重大的經(jīng)濟(jì)效圖1是不同組別小鼠體重變化圖2是小鼠肝組織形態(tài)圖2a是小鼠肝組織正常對照組肝組織形態(tài)圖2b是小鼠肝組織模型對照組肝組織形態(tài)圖2c是小鼠肝組織低劑量組肝組織形態(tài)圖2d是小鼠肝組織中劑量組肝組織形態(tài)圖2e是小鼠肝組織高劑量組肝組織形態(tài)圖。具體實施例方式以下實施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于以下實施例，所述
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開的內(nèi)容，均可實現(xiàn)本發(fā)明的目的。(一)桑葉多酚的制備方法實施例1(1)取桑葉粉末，加入其8倍重量的體積濃度為60%乙醇磷酸溶液，調(diào)節(jié)pH為3，溫度為45'C，超聲-微波協(xié)同萃取2次，調(diào)節(jié)超聲波頻率30kHz，微波功率為50W，合并提取液，過濾，濃縮至原體積1/10的濃縮液，得桑葉多酚粗提液。(2)取桑葉多酚粗提液經(jīng)截留分子量為5萬和8萬Da的膜分離，得截留分子量為5~8萬Da之間的桑葉多酚溶液。(3)取桑葉多酚溶液，進(jìn)行大孔吸附樹脂柱層析，柱層析包括以下步驟a.吸附調(diào)節(jié)桑葉多酚溶液pH2.0，濃度為3.0mg/mL，流速為3.5柱體積/h，體積為5.0柱體積，過柱；b.洗脫選擇濃度為70%的乙醇溶液作為洗脫液，洗脫速率為2.0柱體積/h，洗脫液的體積為3.0柱體積，收集洗脫液，將洗脫液在45'C濃縮至原體積的l/4后，冷凍干燥后得桑葉多酚粉末。實施例2(l)取桑葉粉末，加入其9倍重量的體積濃度為70%乙醇磷酸溶液，調(diào)節(jié)pH為3.5，溫度為5(TC，超聲-微波協(xié)同萃取3次，調(diào)節(jié)超聲波頻率35kHz，微波功率為70W，合并提取液，過濾，濃縮至原體積1/4的濃縮液，得桑葉多酚粗提液。(2)取桑葉多酚粗提液經(jīng)截留分子量為5萬和8萬Da的膜分離，得截留分子量為5~8萬Da之間的桑葉多酚溶液。(3)取桑葉多酚溶液，進(jìn)行大孔吸附樹脂柱層析，柱層析包括以下步驟a.吸附調(diào)節(jié)桑葉多酚溶液pH3.0，濃度為4.0mg/mL，流速為4.0柱體積/h，體積為6.0柱體積，過柱；b.洗脫選擇濃度為75%的乙醇溶液作為洗脫液，洗脫速率為2.5柱體積/h，洗脫液的體積為3.5柱體積，收集洗脫液，將洗脫液在48'C濃縮至原體積的2/5后，冷凍干燥后得桑葉多酚粉末。實施例3(1)取桑葉粉末，加入其IO倍重量的體積濃度為80%乙醇磷酸溶液，調(diào)節(jié)pH為4，溫度為55"C，超聲-微波協(xié)同萃取3次，調(diào)節(jié)超聲波頻率40kHz，微波功率為IOOW，合并提取液，過濾，濃縮至原體積2/5的濃縮液，得桑葉多酚粗提液。(2)取桑葉多酚粗提液經(jīng)截留分子量為5萬和8萬Da的膜分離，得截留分子量為5~8萬Da之間的桑葉多酚溶液。(3)取桑葉多酚溶液，進(jìn)行大孔吸附樹脂柱層析，柱層析包括以下步驟a.吸附調(diào)節(jié)桑葉多酚溶液pH4.0，濃度為5.0mg/mL，流速為5.5柱體積/h，體積為7.0柱體積，過柱；b.洗脫選擇濃度為80%的乙醇溶液作為洗脫液，洗脫速率為3.0柱體積/h,洗脫液的體積為4.0柱體積，收集洗脫液，將洗脫液在5(TC濃縮至原體積的l/2后，冷凍干燥后得桑葉多酚粉末。(二)以上述方法制成的桑葉多酚為原料制備的微膠囊實施例4將羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯(HPMCP)溶于體積濃度為80%的乙醇溶液中，高速分散器分散，混合均勻后得微膠囊壁材，按桑葉多酚和HPMCP的重量份比1.5:1加入桑葉多酚，并加入占芯壁材總重量3%的十二垸基硫酸鈉，調(diào)節(jié)總固形物的重量含量為5%，用高速分散器持續(xù)處理30min，混勻，將所得溶液進(jìn)行噴霧干燥，可得到桑葉多酚微膠囊產(chǎn)品。實施例5取重量份比為1:1的明膠和麥芽糊精溶于7(TC熱水中，混均后得明膠和麥芽糊精復(fù)合壁材，按桑葉多酚明膠和麥芽糊精復(fù)合壁材的重量份比2:1加入桑葉多酚，并加入占芯壁材總重量4%的大豆卵磷脂，調(diào)節(jié)總固形物的重量含量為6%，調(diào)節(jié)高速分散器的轉(zhuǎn)速為10000r/min，持續(xù)處理l2min，高壓均質(zhì)兩次后進(jìn)行噴霧干燥，即得到桑葉多酚微膠囊產(chǎn)品。實施例6將乙基纖維素、聚乙烯醇加入到有機(jī)溶劑環(huán)己烷中，用玻棒攪拌，同時將聚乙烯醇、乙基纖維素和環(huán)己烷組成的混合體系進(jìn)行水浴加熱至7080。C，使乙基纖維素和聚乙烯醇在環(huán)己垸中完全溶解，并加入芯材桑葉多酚，滿足芯材和壁材的重量份比為3:1，同時滿足聚乙烯醇占芯壁材總重量的5%，調(diào)節(jié)總固形物的重量含量為8%，繼續(xù)攪拌15min，使桑葉多酚微細(xì)顆粒均勻分散于乙基纖維素、聚乙烯醇的環(huán)己烷溶液中，然后緩慢降溫，使乙基纖維素溶解度下降而以黃酮物質(zhì)微細(xì)顆粒為核凝聚析出，形成桑葉多酚微膠囊，分離微膠囊，水洗后真空干燥。實施例7取桑葉多酚微膠囊粉與桑葚花青素提取物，按2:1重量份的配比，混合配制成膠囊，體重5070kg的成人每日參考用量35g，可達(dá)到抗氧化的目的。實施例8取桑葉多酚微膠囊粉與黑米花色苷提取物或黑大豆花色苷提取物，按4:1的重量份配比，混合配制成沖劑，體重5070kg的成人每日參考用量35g，可達(dá)到抗氧化的目的。實施例9取桑葉多酚微膠囊粉與桑葚花青素提取物和黑米花色苷提取物或黑大豆花色苷提取物，按3:1:1的重量含量配比，混合配制成沖劑，體重5070kg的成人每日參考用量35g，可達(dá)到抗氧化的目的。實施例10取桑葉多酚微膠囊粉、桑椹花青素提取物、黑米花色苷提取物和黑大豆花色苷提取物，各組分按2:1:1:1的重量含量配比混合配制成具有抗氧化作用的膠囊產(chǎn)品，體重5070kg的成人每日參考用量35g，可達(dá)到抗氧化的目的。實施例11取桑葉多酚微膠囊粉和麥芽糖精或蔗糖或葡萄糖，按1:1的重量含量配比，混合均勻后經(jīng)高效制粒機(jī)制粒及干燥后得桑葉多酚護(hù)肝顆粒產(chǎn)品，體重50~70kg的成人每日參考用量35g，可達(dá)到護(hù)肝的目的。實施例12取桑葉多酚微膠囊粉和麥芽糖精或蔗糖或葡萄糖以及e-環(huán)糊精，按10:15:1的重量含量混合均勻后，經(jīng)高效制粒機(jī)制粒及千燥后得桑葉多酚護(hù)肝顆粒產(chǎn)品，體重5070kg的成人每日參考用量35g，可達(dá)到護(hù)肝的目的。實施例13取桑葉多酚微膠囊粉、麥芽糊精、蔗糖、葡萄糖和e-環(huán)糊精，按25:2:25:25:23的重量含量混合均勻后，經(jīng)高效制粒機(jī)制粒及干燥后獲得具有護(hù)肝作用的桑葉多酚護(hù)肝顆粒產(chǎn)品，體重5070kg的成人每日參考用量35g,可達(dá)到護(hù)肝的目的。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍。(三)桑葉多酚微膠囊粉的藥學(xué)試驗桑葉作為傳統(tǒng)中藥，有許多清肝明目作用的記載，桑葉多船類化合物具有很強(qiáng)清除自由基的能力，以下通過桑葉多酚微膠囊的動物藥效試驗來說明其抗氧化和護(hù)肝作用。CCl4是肝臟毒理中研究較多的親肝性毒物，對肝臟具有較強(qiáng)的損傷作用，本試驗采用ccu腹腔注射誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型。試驗材料1、樣品本藥效試驗的樣品桑葉多酚微膠囊由上述方法制備。2、試劑超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測定試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測定試劑盒，考馬斯亮藍(lán)G-250,牛血清白蛋白，四氯化碳(CCU)。3、器材高速離心機(jī)，UV-1700分光光度計，真空冷凍干燥機(jī)，漩渦混合器，F(xiàn)J-200高速分散均質(zhì)機(jī)，電子天平，DM2500光學(xué)顯微鏡。4、試驗動物NIH級小鼠，雄性，體重1822g，小鼠50只，每組10只。試驗方法1、動物分組將經(jīng)SPSS檢驗無顯著差異的小鼠按體重隨機(jī)分為5組空白對照組、模型對照組、桑葉多酚低劑量組、桑葉多酚中劑量組和桑葉多酚高劑量組。2、造模及給藥-適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，開始灌胃桑葉多酚微膠囊，劑量為桑葉多酚低劑量組給藥量100mg/kg乂bw);桑葉多酚中劑量組給藥量200mg/kg'(bw);桑葉多酚高劑量組給藥量400mg/kg'(bw);正常對照和模型對照組每次給予等體積的生理鹽水，每天經(jīng)口灌胃l次，連續(xù)30天，期間自由攝食飲水，每3天稱量一次體重。各組小鼠給藥第30天后，造模?？瞻讓φ战M空白對照組腹腔注射生理鹽水0.01ml/g;模型對照組腹腔注射0.3。/。四氯化碳(CCl4)食用油溶液0.01ml/g;低劑量組腹腔注射0.3。/。四氯化碳(CCL0食用油溶液0.01ml/g;中劑量組腹腔注射0.3y。四氯化碳(CCU)食用油溶液0.01ml/g;高劑量組腹腔注射0.3%四氯化碳(0314)食用油溶液0.01ml/g。禁食12小時，摘眼球取血，頸椎脫臼處死動物，解剖分離心、肝、脾、腎等臟器。數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析采用SPSS14.0軟件包，結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差G士"表示，各組間的比較采用最小顯著差異法(LeastSignificantDifference,LSD)。試驗結(jié)果1、小鼠體重變化各桑葉多酚劑量組和對照組小鼠整個喂養(yǎng)期間的體重變化如附圖1所示，從圖1和下表1中可以看出，在喂養(yǎng)過程中，各組小鼠初始體重組間無顯著差異CP>0.05)，試驗期間各組體重都有大幅的增長，其中空白對照組和模型對照組體重增長大于各劑量組，對小鼠終體重分析，對照對照組和模型對照組體重與低劑量和中劑量體重存在顯著性差異CP0.05)，與高劑量組無顯著性差異(P>0.05)。說明灌胃桑葉多酚對小鼠體重有一定的影響，可能是桑葉多酚對小鼠的味覺取食欲有影響，或者桑葉多酚加速了小鼠體內(nèi)物質(zhì)代謝。2、對小鼠臟體比值的影響解剖小鼠，剝離各臟器，吸干表面污物，稱重，臟體比值=臟器重量^)/體重(100g)。表l不同組別的小鼠臟體比<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注a、b、c、d表示模型對照組、各劑量組與空白對照組比較P《.05。試驗結(jié)果表明在肝臟/體重比方面，空白對照組與其它各組均有顯著性差異，各劑量組與模型組之間無顯著差異；其它臟體比各組間均無顯著性差異，表明腹腔注射CCU主要造成小鼠肝臟損傷。3、對CCU引起的急性肝損傷小鼠血清和肝勻漿中抗氧化能力影響超氧化物歧化酶(SOD)對機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，它能清除超氧陰離子，保護(hù)細(xì)胞免受損傷；丙二醛(MDA)的含量常常反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞受損傷程度；MDA的測定常與SOD的測定相互配合，SOD活性的高低間接反映出機(jī)體清除自由基的能力，而MDA的高低又反映了細(xì)胞受自由基攻擊的程度。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，它特異的催化還原型谷胱甘肽(GSH)對過氧化氫的還原反應(yīng)，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用，從而起到抗氧化作用。SOD活力的測定通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，可用于比色。當(dāng)被測樣品中含SOD時，則對超氧陰離子自由基有專一的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，通過比色可以計算亞硝酸鹽的減少量，從而推算SOD活力。小鼠肝勻漿的制備將小鼠肝臟組織塊置于冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，以滅菌生理鹽水作為勻漿介質(zhì)(生理鹽水的量為肝組織重量的9倍)，用組織搗碎機(jī)研磨制成肝勻漿懸液，然后離心分離上清液即得10y。(w/v)肝勻漿。蛋白質(zhì)含量的測定:采用Bradford測定法(Bradford，1976)。表2對CCLt引起的急性肝損傷小鼠血清SOD、MDA和GSH-PX的影響(:c土s，n,組SODMDAGSH-PX別(U/mL)(nmol/mL)(活力單位)空白對照組127,76±50.187.26±1.06847.29±175.00模型對照組89.95士35.26a10.26士4.95a870.00±278.10低劑量組123.26±40.427.68±1.661025.67±385.44中劑量組131.15土45.75c8.38±2.96949.46±168.67高劑量組135.94土31.21d7.33土2.72d958.37±358.12注a表示模型對照組與空白對照組比較P0.05，c、d表示劑量組與模型組比較P0.05。試驗結(jié)果表明(1)模型對照組與空白對照組相比血清中SOD活力顯著下降，MDA含量顯著升高，GSH-PX活力無顯著變化，表明腹腔注射CCU引起小鼠血清抗氧化能力下降；(2)SOD活力中劑量組和高劑量組比模型組明顯升高，達(dá)到顯著水平(尸<0.05)，低劑量組比模型組也有升高，但差異不顯著；(3)MDA含量高劑量組比模型組明顯降低，達(dá)到顯著水平(尸<0.05)，中劑量組和低計量組比模型組也有降低，但差異不顯著；(4)GSH-PX活力各給藥劑量組比模型組均有一定的升高，但沒有顯著差異(尸>0,05)。表3對CC14引起的急性肝損傷小鼠肝勻漿SOD、MDA和GSH-PX的影響n=10)組SODMDAGSH-PX別(U/mgprot)(nmol/mgprot)(活力單位)空白對照組252.37±67.9912.43±5.69412.76±跳53模型對照組165.74土48.25a42.27士17.43a236.94土94.48a低劑量組180.64±44.9732.98±11.04312.55±104.64中劑量組29Ul士41.63c35.18±15.64406.84土129.65c高劑量組320.40士148.69d22.49士12.99d311.65±184.29注a表示模型對照組與空白對照組比較P0.05，c、d表示劑量組與模型組比較P0.05。試驗結(jié)果表明(1)模型對照組與空白對照組相比肝勻漿中SOD活力顯著下降，MDA含量顯著升高，GSH-PX活力顯著下降，表明腹腔注射CCl4引起小鼠肝勻漿抗氧化能力下降；(2)SOD的活力中劑量組和高劑量組比模型組明顯升高，達(dá)到顯著水平(戶<0.05)，低劑量組比模型組也有升高，但差異不顯著；(3)MDA含量高劑量組比模型組明顯降低，達(dá)到顯著水平(尸<0.05)，中劑量組和低計量組比模型組也有降低，但差異不顯著；(4)GSH-PX活力中劑量組比模型組有明顯提高，達(dá)到顯著水平(尸0.05)，低劑量組和高劑量組比模型組有所提高，但沒有顯著差異(PX).05)。4、對CC14引起的急性肝損傷小鼠血清和肝勻漿中ALT、AST的影響谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)是肝功能檢測的重要指標(biāo)，通過測定ALT和AST可以客觀地推測肝臟的損害程度。采用賴氏法，測定按照試劑盒測定步驟進(jìn)行，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)的活力單位。表4對CCU引起的急性肝損傷小鼠血清和肝勻漿中ALT、AST影響G±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注3*表示模型對照組與空白對照組比較？<0.01，a表示模型對照組與空白對照組比較P<0.05，d表示各劑量組與模型組比較P<0.05。試驗結(jié)果表明(1)模型對照組與空白對照組相比，血清中ALT和AST活力顯著升高，達(dá)到極顯著水平(i50.01)，肝勻漿中ALT和AST活力顯著升高，達(dá)到顯著水平(PO.05),表明腹腔注射CCU導(dǎo)致了小鼠肝臟嚴(yán)重?fù)p傷。(2)小鼠血清中ALT和AST活力高劑量組比模型組明顯降低，達(dá)到顯著水平(尸<0.05)，中劑量組比模型組也有所降低，但差異不顯著，低劑量反而比模型組有所升高，但沒有顯著差異；小鼠肝勻漿中ALT活力高劑量組比模型組明顯降低，達(dá)到顯著水平(尸<0.05)，中劑量組和低劑量比模型組也有所降低，但差異不顯著，小鼠肝勻漿中各給藥劑量組AST活力均比模型組有所降低，但差異不顯著。5、對CCLt引起的急性肝損傷小鼠肝組織形態(tài)的影響試驗動物處死后，立刻取小鼠肝臟左葉同一部位組織，10%福爾馬林試劑固定，石蠟包埋，切片，H.E.染色，光鏡下觀察組織形態(tài)及變化。在光鏡下觀察各組小鼠肝組織形態(tài)及變化見圖l，從圖中可以看出.-(1)空白對照組(圖2a)光鏡下肝細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞無水腫、無脂肪變性；(2)模型組(圖2b)小鼠肝細(xì)胞有明顯的大范圍脂肪變性，細(xì)胞內(nèi)形成大量脂滴，胞衆(zhòng)疏松，呈氣球樣變，并有核固縮現(xiàn)象，局部可見細(xì)胞嗜酸性改變和點(diǎn)狀壞死灶；(3)低劑量組(圖2c)也有明顯的脂肪變性，但相對于模型組范圍減小，細(xì)胞氣球樣變程度和范圍均較模型組有所減輕；(4)中劑量組(圖2d)肝細(xì)胞呈彌散性脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)有大量小脂滴形成，未見明顯氣球樣變和核固縮；(5)高劑量組(圖2e)僅在中央靜脈周圍有小范圍的脂肪變性，肝細(xì)胞水腫，胞漿疏松，未見明顯氣球樣變和脂滴沉積。綜上試驗可知-(1)空白對照組和模型對照組體重與低劑量和中劑量體重存在顯著性差異(P<0.05)，與高劑量組無顯著性差異(PX).05);(2)在肝臟/體重比方面，各劑量組與模型組之間無顯著差異，與空白對照組有顯著性差異(PO.05);其它臟體比各組間均無顯著性差異，表明腹腔注射CCW主要造成小鼠肝臟損傷；(3)桑葉多酚高劑量組能顯著提高小鼠血清和肝勻漿的SOD活力，顯著降低MDA含量；中劑量組能顯著提高小鼠血清SOD活力和肝勻漿SOD、GSH-PX活力；低劑量組無顯著差異；(4)桑葉多酚高劑量組能顯著降低小鼠血清和肝勻漿的ALT活力和血清的AST活力；中低劑量組無顯著差異；(5)小鼠肝組織形態(tài)觀察表明腹腔注射CC14造成小鼠急性肝損傷，肝細(xì)胞受損嚴(yán)重，桑葉多酚各劑量組均能降低小鼠的肝損傷程度，其中高、中劑量作用效果明顯。權(quán)利要求1、一種桑葉多酚的制備方法，其特征在于，它包括以下步驟(1)取桑葉粉末，加入其8～10倍重量的乙醇磷酸溶液，超聲-微波協(xié)同萃取2～3次，合并提取液，過濾，濃縮至原體積1/10～2/5的濃縮液，得桑葉多酚粗提液；(2)取桑葉多酚粗提液經(jīng)截留分子量為5萬和8萬Da的膜分離，得截留分子量為5～8萬Da之間的桑葉多酚溶液；(3)取桑葉多酚溶液，進(jìn)行大孔吸附樹脂柱層析得到洗脫液，將洗脫液在45～50℃濃縮至原體積的1/4～1/2后，冷凍干燥后得桑葉多酚粉末。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述桑葉多酚的制備方法，其特征在于，步驟(l)中乙醇磷酸溶液的體積濃度為60~80%。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述桑葉多酚的制備方法，其特征在于，步驟(l)中超聲-微波協(xié)同萃取的pH為3~4，溫度為45~55°C。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述桑葉多酚的制備方法，其特征在于，步驟(l)中超聲波頻率為3040kHz，微波功率為50100W。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述桑葉多酚的制備方法，其特征在于，步驟(3)中的大孔吸附樹脂柱層析包括以下步驟a.吸附調(diào)節(jié)桑葉多鼢溶液pH2.0-4.0，濃度為3.05.0mg/mL，流速為3.5~5.5柱體積/h，體積為5.0~7.0柱體積，過柱；b.洗脫選擇濃度為70~80%的乙醇溶液作為洗脫液，洗脫速率為2~3柱體積/h，洗脫液的體積為34柱體積，收集洗脫液。6、一種用權(quán)利要求1所述方法制備的桑葉多酚制成的微膠囊，其特征在于，它包括芯材，壁材和乳化劑，所述芯材為桑葉多酚，壁材經(jīng)預(yù)處理后，加入桑葉多酚芯材，同時加入占芯材和壁材總重量3~5%的乳化劑進(jìn)行乳化，調(diào)節(jié)總固形物的重量含量為5~8%，混勻，干燥后即得桑葉多酚微膠囊。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述微膠囊，其特征在于，所述芯材和壁材的重量份比為1,53:1。8、根據(jù)權(quán)利要求6所述微膠囊，其特征在于，所述壁材為羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、乙基纖維素、麥芽糊精、明膠中的一種或幾種組成的復(fù)合壁材。9、根據(jù)權(quán)利要求6所述微膠囊，其特征在于，所述乳化劑為大豆卵磷脂、十二垸基硫酸鈉、聚乙烯醇中的一種。10、權(quán)利要求6制成的微膠囊在制備具有抗氧化及護(hù)肝作用的功能食品中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種桑葉多酚的制備方法及其微膠囊和應(yīng)用，本發(fā)明桑葉多酚的制備過程為集成超聲-微波協(xié)同萃取、超濾、大孔吸附樹脂純化等多項提取分離純化工藝，獲得高純度桑葉多酚，采用微膠囊技術(shù)制備得桑葉多酚微膠囊，同時使其應(yīng)用于具有抗氧化和護(hù)肝功效作用的功能食品。本發(fā)明方法具有提取時間短、溫度低、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，該方法制備的桑葉多酚純度高，且可應(yīng)用于具有抗氧化和護(hù)肝功能食品方面。文檔編號A61K47/36GK101428069SQ200810219728公開日2009年5月13日申請日期2008年12月8日優(yōu)先權(quán)日2008年12月8日發(fā)明者劉學(xué)銘,吳娛明,吳繼軍,唐翠明,廖森泰,徐玉娟,英施,肖更生,鄒宇曉,陳智毅申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所;廣東寶桑園健康食品研究發(fā)展中心