專利名稱：多肽和抗原的穩(wěn)定稀釋劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于穩(wěn)定多肽和抗原的含水組合物。在分析方法中例如抗原專一性檢測中，和其他將多肽和抗原穩(wěn)定在水溶液中有好處的制藥上的用途中，穩(wěn)定的多肽和抗原是有用的。
背景技術：
下面是對此處公開的本發(fā)明具有潛在相關性的文獻的討論。但是，此處討論中的參考文獻無一被承認為在先技術。
在水溶液中穩(wěn)定多肽和抗原通常是困難的。例如，室溫下長期存放這種溶液會導致水溶液中的多肽或抗原的變質。特別是，已經記錄到當細菌、病毒和其他微生物抗原儲存在水溶液介質中時是不穩(wěn)定的。一個實例是有包膜病毒，例如正粘病毒科的流感病毒含有在溶液中廣譜溫度下隨時間而降解的抗原。本技術領域的一般技術人員明白多種細菌抗原，例如一些毒素在溶液中的穩(wěn)定也是困難的。為了避免水溶液中的變質，本技術領域的技術人員已經采用了冷凍干燥法和冷凍法作為保存多肽和抗原的方法。實際上，廣泛使用冷凍干燥法和冷凍法表明了在水溶液中保存這種成分的缺點和困難。
無數(shù)本技術領域的出版物公開了增加冷凍干燥試劑穩(wěn)定性的方法以及甚至本技術的工藝水平的內在困難。例如，美國專利5,955,448、4,496,537和PCT申請WO97/04801均公開了冷凍干燥技術上的改進。但是，對生產者和終端使用者而言，冷凍干燥蛋白包括溶液帶來了高成本和不便，同時引入了復原錯誤和污染的新增風險。并且，溶液的冷凍需要特定設備，而且發(fā)生重復周期性變化時，最終會導致蛋白降解。就商業(yè)用途而言，水溶液中多肽和抗原的變質損失慘重，因為那樣的溶液在僅僅很短的儲存周期后就需要更換。
本發(fā)明涉及一種能增加溶液中的多肽和其他非蛋白類化合物穩(wěn)定性的水溶性穩(wěn)定試劑或稀釋劑?？乖缣妓衔?、蛋白質、脂蛋白、脂多糖、多糖、核酸、核蛋白以及與蛋白質、脂類和其他化合物復合的碳水化合物是可用本發(fā)明穩(wěn)定的抗原類型的說明性實例。通過使用新的試劑成分，本發(fā)明提高了多肽和抗原在當前商業(yè)化的稀釋劑或本技術領域所述稀釋劑中的穩(wěn)定性。本發(fā)明特別適用于穩(wěn)定用作診斷或其他用途的對照試劑的抗原和多肽，因為這些用途中需要這些成分的穩(wěn)定水溶液。本發(fā)明所述的穩(wěn)定稀釋劑用于在2-8℃、室溫和約45℃下穩(wěn)定多肽和抗原儲存更長的時間。
PCT申請WO99/15901公開了一種用于穩(wěn)定抗原的的稀釋劑，特別是丙型肝炎病毒抗原。該丙型肝炎病毒抗原稀釋劑包括一種還原性試劑，使丙型肝炎病毒抗原保持在還原狀態(tài)。該出版物報道在稀釋劑中包含還原性試劑將丙型肝炎病毒抗原的免疫反應性保持長達7天。報道的稀釋劑還包括磷酸鈉，pH6.5(或其他緩沖液)，EDTA(或其螯合劑)，DTT(或其他還原劑)，明膠(或其他蛋白封閉源)，硫氰酸銨(或其他離液劑)，疊氮化鈉(或其他防腐劑)和SDS(或其他去垢劑)。但是，稀釋劑中包含還原劑可能對來自其他微生物的許多的抗原的穩(wěn)定性無效或有害。
美國專利4,956,274涉及對用于互補分析的來自β-半乳糖苷酶的抗體片段的穩(wěn)定技術。其中公開的溶液中含有來自糖殘基的離子型表面活性劑或表面活性劑，以便減緩β-半乳糖苷酶的抗體片段的降解。但是，表面活性劑也使酶片段變性，所以不得不除去或使其失效，以便酶片段恢復它們的正確構象、恢復酶活性，這表明該溶液不能穩(wěn)定蛋白的天然形態(tài)。表面活性劑恰在分析前用環(huán)化糊精使其失效。表面活性劑的作用也可以高濃度血清掩蔽。公開試劑的附加成分包括螯合劑，緩沖液，殺菌劑，鎂或其他離子，還原劑，增溶劑例如溶劑乙二醇，和非離子型去垢劑。正如本技術領域的技術人員所覺察到那樣，蛋白或酶片段的變性或復性可能損壞一些抗原決定簇，使它們失活。
美國專利5,459,033描述了一種用于防止病毒聚集的溶液。報道的溶液中含有N-月桂肌氨酸或其他陰離子表面活性劑。據(jù)說該溶液加強了穩(wěn)定性，其基于病毒體粒子，特別是肝炎病毒和皰疹病毒由于疏水吸引發(fā)生聚集從而降低了敏感性。未報道該稀釋劑改良或保護了抗原的酶活性或免疫源性，但報導該稀釋劑阻止了聚集。而且，報道說，在使用該溶液前，必須在2-35℃中溫育15小時到10天，以確保相容的穩(wěn)定性，這就對終產品的生產增加了一個重要的限定性。
美國專利5,660,978公開了一種通過將其攙入到抗原(例如血清)、抗原專一性抗體或抗體片段(特別是Fab)的濃縮溶液中來穩(wěn)定一種抗原以便防止蛋白水解或氧化，特別是一種不穩(wěn)定蛋白抗原，尤其是一種酶。引入血清或非專一性的IgG將不會提供期望的保護或是對這種稀釋劑的專一性的保護。而且，穩(wěn)定是在將抗原置于稀釋劑中之前完成的。相反，本發(fā)明是由稀釋劑本身穩(wěn)定的。并且，本發(fā)明從一開始就對一種相對稀釋的溶液進行穩(wěn)定，而不是象已經獲得專利的所述發(fā)明那樣顯示在一定階段。使用抗體結構化穩(wěn)定抗原是成問題的，特別在一個或幾個抗原位點是免疫分析的靶標時。并且，本技術領域的技術人員將在制備如同5,660,978專利所公布的稀釋劑方面存在困難，其中這些稀釋劑保護抗原構型，但是不抑制專一性酶活性。由于該發(fā)明本質上使用抗體部分作為固定劑，而不是化學固定劑，所以，沒有真正描述一種穩(wěn)定稀釋劑。
Landi，S和Held，HR(Tubercle59(1978)121-133)報道了將去垢劑土溫-80(Tween-80)加入到稀釋的溶液中，表明結核菌素PPD的穩(wěn)定性由于加入這種去垢劑得以加強，因為去垢劑的抗吸附性能。由Connaught Laboratories，LTD生產的結核菌素制備液包括結核菌素PPD，0.3％苯酚(報道用作防腐劑)和0.0005％溶于PBS緩沖液中的Tween-80。苯酚是一種有害物質，本發(fā)明將不接受，并且可能使一些蛋白質變性。
盡管在稀釋劑配方和冷凍干燥儲存技術上取得了進步，但是仍然存在對這種稀釋劑的需求，即，充分地提高了儲存在溶液中的多種多肽和抗原的長期穩(wěn)定性，特別是來自微生物的抗原。
發(fā)明概述本發(fā)明主要涉及一種穩(wěn)定多肽和抗原的試劑。該試劑特別適用于穩(wěn)定分析過程中用到的對照或參考抗原的穩(wěn)定。抗原例如碳水化合物，蛋白質，多肽，多肽片段，脂蛋白，脂多糖，多糖，核酸，核蛋白和與多肽、脂類或其他化合物復合的碳水化合物是這種類型的抗原的說明性的實例，它們可以使用本發(fā)明穩(wěn)定。
該公開的試劑在低溫或高溫下均超過了以前用于多肽和抗原的配方。多肽和抗原在該試劑中以可溶性方式保存，在從約0.5℃到高于50℃的多種溫度情況下均可延長保存期，優(yōu)選2-8℃，室溫附近(一般是約23℃到約28℃，而25℃特別優(yōu)選)和約42℃到約43℃，特別是45℃。45℃的穩(wěn)定性預示了該試劑能提供長期抗原穩(wěn)定性。并且，該公開的試劑具有作為用于穩(wěn)定多肽和抗原的單一水溶液的優(yōu)勢。
首先，本發(fā)明涉及一種用于增強多肽或抗原穩(wěn)定性的水溶性的試劑組合物。在某些優(yōu)選實施方案中，該試劑包括下述一種或幾種成分緩沖液，溶劑，鹽，螯合劑，去污劑和防腐劑。優(yōu)選地，該試劑不含有N-十二酰-N-甲基甘氨酸或癸酰基-N-甲基葡糖酸酰胺。該試劑也可包括例如組織培養(yǎng)基質或商品化稀釋劑成分。
在此所用，術語“緩沖液”是指技術人員熟知的用于減少溶液pH變化的組合物。優(yōu)選的緩沖液具有在pH值7到9間提供有效緩沖的pKa。優(yōu)選緩沖液是ACES、ADA、BES、N-二(羥乙基)甘氨酸、bis-tris、CAPS、CHES、丙二酸二乙酯、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰胺HCl、HEPES、HEPPS、咪唑、MES、MOPS、PIPES、POPSO、TAPSO、TES、N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸、三(羥甲基)氨基甲烷、碳酸氫鹽和硼酸鹽。特別優(yōu)選地是磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選的緩沖試劑的濃度小于2M；最優(yōu)選的濃度是0.2M、0.1M、0.05M、0.02M、0.01M、0.005M、0.001M和0.0001M，具有的pH值是7、7.25、7.5、7.75、8、8.25、8.5、8.75和9。
在此所用，術語“封閉劑”是指一種富含蛋白質的材料，其含有蛋白質和/或多肽的混合物，并且可能含有一種或多種添加成分，例如脂類、碳水化合物、鹽和輔因子如血紅素。術語“富含蛋白質”在此予以定義。該封閉劑可被用于穩(wěn)定一種或多種此處所述的組合物和方法中的蛋白質、多肽和/或抗原。優(yōu)選的封閉劑的pH值介于約6.5到約8.0之間，和/或重量摩爾滲透壓濃度在約250到約350mOsm/Kg H2O之間。特別優(yōu)選的封閉劑是血清，例如馬血清、新生小牛血清、小牛血清、成體牛血清、人血清、兔血清、綿羊血清等，和技術人員所知的血清取代物。最優(yōu)選用作封閉劑的是胎牛血清。
在此所用，術語“富含蛋白質”是指含有蛋白質和/或多肽混合物的溶液，其中總蛋白的濃度的質量百分比在約1％到約50％之間，最優(yōu)選地在3％到10％之間。例如，胎牛血清的總蛋白含量在約3％到約4.5％之間，而成體牛血清的總蛋白含量在約4.5％到約8.5％之間。
在此所用，術語“溶劑”和“增溶劑”是指具有分散該組合物的其他成分的能力的液體物質。優(yōu)選的溶劑是水，甘油，二甲基亞砜，如乙醇、甲醇等醇類，丙酮，有蛋白質和/或多肽混合物的溶液，二甲基亞砜、乙腈和二甲基甲酰胺。
在此所用，術語“鹽”是指用金屬或功能象金屬的元素代替了酸中的部分或全部酸性氫形成的一種或多種化合物。優(yōu)選鹽是KCl、NaCl、MgCl2、MgSO4和CaCl2。優(yōu)選的鹽濃度在4M到0.1mM之間，最優(yōu)選是在2M到50mM之間。
在此所用，術語“螯合劑”是指與金屬離子結合的分子，通常結合到該分子內的兩個或多個配位基上。螯合劑是本技術領域熟知物，包括某些蛋白和多肽，以及小分子物質，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)。優(yōu)選的螯合劑濃度在100mM到0.01mM之間，最優(yōu)選是在20mM到1mM之間。
在此所用，術語“去垢劑”是指本領域熟知的、能夠乳化油作為濕潤劑的化合物。優(yōu)選的去垢劑包括CHAPS、脫氧膽酸、毛地黃皂苷、n-十二烷基-β-D-麥芽糖化合物、甘氨脫氧膽酸、n-月桂酰肌氨酸、十二烷基硫酸、皂草苷、土溫20(Tween20)和曲通X-100(Triton X-100)。優(yōu)選的去垢劑濃度在約0.001％到約5％之間，最優(yōu)選地，組合物中包括約0.01％，0.02％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.07％，0.08％，0.09％，0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％1.0％和2％。
在此所用，術語“防腐劑”是指技術人員熟知的、防止微生物生長的化合物。優(yōu)選的防腐劑包括硫柳汞、山梨酸、BHA、丁基化羥基甲苯、小殺菌素II(溴化三甲基四癸基銨)和慶大霉素、青霉素、鏈霉素等抗生素。優(yōu)選的防腐劑濃度在10％到0.001mM之間，最優(yōu)選是在1％到0.1％之間。
在此所用，術語“多肽”是指氨基酸的多聚物，但不是指特定長度的產品，所以，肽、寡肽、蛋白質及其片段均包含在該定義之內。術語“多肽”不排除多肽的翻譯后修飾，例如，糖基化作用，乙酰基化作用，磷酸化作用和類似作用。
在此所用，術語“抗原”包括碳水化合物，蛋白質，多肽，脂蛋白，脂多糖，核酸和與多肽、脂類和其他化合物復合的碳水化合物?？乖哂性诰邆涔δ苊庖呦到y(tǒng)的動物體內誘導免疫反應的能力。在一個優(yōu)選的實施方案中，穩(wěn)定的多肽是核蛋白抗原。核蛋白抗原可以有多種來源，可以是單獨的或與其他分子締合的。
“核蛋白抗原”是指任何與核復合體締合或吸附的多肽。
一種特別優(yōu)選的核蛋白體是來自流感病毒，特別是流感病毒B型的核蛋白體。
“抗原穩(wěn)定性”是指在試劑在一個給定的溫度下儲存給定的時間后，在一個分析或分析方法中，特別是診斷分析或免疫分析中，同一種試劑產生的信號保持一致的能力。一般的儲存溫度是從約2℃到約30℃。抗原穩(wěn)定性也可以通過在高溫下較短時間里測定抗原變質進行評價。用于加速穩(wěn)定性測試的典型溫度是從約30℃到60℃。
“微生物”是指原核生物，真核生物例如酵母，病毒，朊病毒或其他感染粒子。
“分析方法”是指任何允許進行一種或多種抗原檢測的技術。分析方法包括任何形式的免疫分析和核酸雜交分析，這在本技術領域存在無數(shù)的實例。一種特別優(yōu)選的光學免疫分析方法在美國專利5,550,063；5,955,377和5,541,057中進行了描述。
其次，本發(fā)明主要涉及一種具有穩(wěn)定抗原或多肽的水溶性試劑組合物，其中抗原來自一種微生物。在一個優(yōu)選的實施方案中，微生物包括病毒和/或細菌。本發(fā)明特別優(yōu)選用于病毒分析物。在一個最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明主要涉及一種穩(wěn)定來自流感病毒的抗原和多肽，特別是來自流感病毒B型的多肽和抗原。
再次，本發(fā)明主要涉及一種具有穩(wěn)定流感病毒核蛋白，特別是來自流感病毒B的核蛋白的試劑組合物。
再者，本發(fā)明主要涉及一種用于穩(wěn)定分析方法中用作對照或參比試劑的抗原制劑的水溶性試劑組合物。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，該試劑包括一種緩沖液，一種封閉劑，一種鹽，一種螯合劑，一種增溶劑，一種非離子去污劑，和一種防腐劑。最優(yōu)選地，本試劑不含有N-十二酰-N-甲基甘氨酸或癸酰基-N-甲基葡糖酸酰胺。
在進一步的優(yōu)選實施方案中，該試劑也可以包括組織培養(yǎng)基質，Stabilcoat緩沖液(BSI，Inc.)和含有福爾馬林滅活的含病毒細胞培養(yǎng)基質。
在另外的優(yōu)選的實施方案中，本試劑包括磷酸鈉緩沖液、胎牛血清、甘油、氯化鈉、EDTA、Tween-20去垢劑(聚氧乙烯失水山梨糖醇單月桂酸酯)、Microcide II防腐劑(一種四胺化合物，Amresco，E423)、硫酸慶大霉素，也可能含蔗糖、組織培養(yǎng)液和Stabilcoat緩沖液(BSI，Inc)。溶液的pH值在7-9之間，最優(yōu)選的是7.5-8.5。本技術領域的技術人員理解到可用類似試劑替代以上所列的試劑，如可用EGTA替代EDTA，用其它抗菌劑替代Microcide II或慶大霉素。以上所列試劑的優(yōu)選濃度如下磷酸納0.1mM至1000mM，更優(yōu)選的是1mM至200mM，最優(yōu)選的是50mM至100mM；胎牛血清0.1％到40％v/v，最優(yōu)選的是2％到20％v/v；甘油0.1％到30％v/v，最優(yōu)選的是2.5％到10％v/v；氯化鈉0.1mM至4M，最優(yōu)選的是50mM至2M；EDTA0.01mM至100mM，更優(yōu)選的是1mM至20mM，最優(yōu)選的是10mM至15mM；Tween-200.001％到1％，更優(yōu)選的是0.01％到0.1％，最優(yōu)選的是0.5％；MicrocideII0.001％到1％w/v，最優(yōu)選的是0.002％到0.1％w/v；硫酸慶大霉素0.01％到10％w/v，更優(yōu)選的是0.％到2.5％w/v，最優(yōu)選的是0.25％到0.1％w/v；蔗糖0.01％到5％w/v，最優(yōu)選的是0.1％到0.5％w/v。
在特別優(yōu)選的實施方案中，該稀釋劑含有含量大于或等于50mM磷酸鈉；2％v/v胎牛血清；10％v/v甘油；50mM氯化鈉；10mM EDTA；0.05％v/v Tween-20去垢劑；0.01％w/v Microcide II防腐劑；0.5％w/v硫酸慶大霉素。該試劑也可能含高達0.5％的蔗糖，15％的Stabilcoat緩沖液，和20％從抗原制備物中得到或另外添加的組織培養(yǎng)液，溶液的優(yōu)選pH值是7.5-8.5。也可以用一定濃度預先配制的組織培養(yǎng)液[如BioWhittaker公司的Eagle基本培養(yǎng)基(EMEM)或Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)]來替代緩沖液和/或鹽。
最后，本發(fā)明主要涉及用于穩(wěn)定微生物來源的多肽和抗原的方法。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的方法用來穩(wěn)定一種來源于微生物的抗原，該抗原在分析方法中用作對照或參照試劑，或在其它藥學制備中使用。
附圖簡述


圖1顯示本發(fā)明所述稀釋劑在穩(wěn)定滅活的B型流感病毒中的優(yōu)越性。
圖2顯示組織培養(yǎng)液可進一步加強本發(fā)明稀釋劑穩(wěn)定性的能力。
優(yōu)選實施方案的詳細描述A引言為了容易地理解本發(fā)明，描述了適用特定應用的本試劑組合物的制備過程，即穩(wěn)定流感病毒來源的抗原。然而，通過進行類似的實驗，可以證實所述穩(wěn)定性試劑組合物對于其他抗原或多肽具有普通效用。
在研制應用于診斷化驗組分或其它應用的試劑中，對試劑長期穩(wěn)定性的測定是必要的。最初，在測定該試劑的實時穩(wěn)定性之前，需通過快速穩(wěn)定性驗證來估計該試劑的保存限期?？焖俜€(wěn)定性驗證可以很快進行，常被本技術領域的技術人員用于預測試劑的穩(wěn)定性。進行驗證的方法之一是將試劑在高溫下孵育并在相對短時間間隔內進行測定。例如，在37℃、45℃和其它高溫條件下孵育3-7天進行分析，并通過阿倫尼烏斯方程式預測試劑是否可在約2℃-8℃保持長時間的穩(wěn)定性。該方法是現(xiàn)今被認為是最準確的預測試劑失效的方法。如果某試劑不能接受高溫的挑戰(zhàn)，就不可能在正常貯存條件下長期保持穩(wěn)定性。高溫穩(wěn)定性在預測長期穩(wěn)定性時稍差，這是由于它不能精確預測衰變率，但它確實可通過表明試劑失效期給出了穩(wěn)定性的一個表征。由于在高溫下其穩(wěn)定性損失降低了，所以真正失效的可能性也是一樣的。
除了高溫驗證之外，有必要對某試劑進行實時、長時間的研究來估計它在穩(wěn)定多肽或抗原方面的潛能。本技術領域的技術人員熟知實時評估條件。例如，實時評估條件可能包括將該試劑在正常貯存溫度(2℃-8℃)或室溫(18℃-30℃)下保存該試劑，直到達到試劑的失效期。
在將流感病毒作為免疫實驗中陽性對照試劑的研制中，同時對在以蛋白質為主的稀釋液中經福爾馬林滅活的A型和B型流感病毒的穩(wěn)定性進行了評價。其中分析中檢測到的抗原決定基來自病毒核蛋白，滅活的A型流感病毒較滅活的B型流感病毒在單純稀釋劑及市售的稀釋劑中均具更高的穩(wěn)定性。為確?？捎糜跈z測A型和B型流感病毒的一種新產品的市售存活力，必需有穩(wěn)定滅活的B型流感病毒的方法。配制了一種可保持兩種類型滅活的流感病毒懸液的穩(wěn)定性的稀釋劑。這種稀釋劑與以前的稀釋劑配方相比較，更具增加溶液中滅活的B型流感病毒穩(wěn)定性的能力，其保存期更長。
A型流感病毒在以單純蛋白質為主的稀釋劑中很穩(wěn)定。一種該類稀釋劑包括牛血清白蛋白(BSA)和溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中的Tween-20去垢劑，也稱為PBT。第二種配方是一種市售產品，稱為Stabilcoat緩沖液(BSI，Inc)，顯示也可穩(wěn)定A型流感病毒。然而，這兩種溶液均不能穩(wěn)定B型流感病毒。這可能是由于在化驗時，單克隆抗體對不同毒株的檢測是通過識別兩種核蛋白上的不同抗原決定基而實現(xiàn)的。這些抗原決定基可能受不同的滅活和保存條件的影響。另外，對用于制備化驗用的單克隆抗體的免疫原的最初制備方法不同，因此可能有利于產生識別不同相容抗原決定基的單克隆抗體。我們相信這里描述的稀釋劑配方對滅活的A型和B型流感病毒的核蛋白具有類似的穩(wěn)定效果。另外，認為對其它病毒和細菌蛋白具有同樣的穩(wěn)定效果。
應當指出的是，在病毒滅活及稀釋于每種不同稀釋劑的過程中固有存在滅活病毒貯存懸液成分的摻合過程。滅活病毒貯存懸液由50％含福爾馬林滅活病毒的細胞培養(yǎng)液(ICC)和50％StabilcoatR緩沖液組成。每種所檢測的陽性對照成分均含一定體積的貯存懸液。
B.新稀釋劑的制成一種新的稀釋劑的配制開始于一種單純蛋白質稀釋劑PBT，包括BSA、Tween-20和PBS緩沖液溶液。每種組分在能維持或增強滅活的A型流感病毒穩(wěn)定性的同時，需檢測其穩(wěn)定B型流感病毒的能力。由以下方法評估所制備抗原的穩(wěn)定性的增加。將滅活的病毒原料稀釋成分析檢測法中所需的信號強度，即對照試劑出售的信號強度。一般來講，在相應的分析方法中，對照試劑選用從低到中的信號強度。不同試劑成分在制成所選的抗原稀釋度后，即刻用合適的分析方法進行測定。各種試劑成分(含抗原)放置于不同的貯存條件，然后在該分析方法中周期性的重復檢測。試劑成分在貯存條件下能保持原有信號或其原有信號強度只有少量降低時，可確定其能提供增強的穩(wěn)定性?？啥ㄐ缘?、定量地、視力判定或用儀器估測信號強度。在組分的篩選過程中，對PBT稀釋劑做了幾個修改。首先，用一種不同的封閉劑，如胎牛血清代替BSA。其次，加入增溶劑如甘油和螯合劑，如EDTA或EGTA，以增強穩(wěn)定性。另外，證實包含一種非離子型去垢劑，如Tween-20去垢劑對穩(wěn)定性是必需的。防腐劑如Microcide II和硫酸慶大霉素的聯(lián)合使用作為抗微生物試劑包含于其中。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的稀釋劑含有大于或等于50mM磷酸鈉；2％v/v胎牛血清；1％v/v甘油；50mM氯化鈉；5mMEDTA；0.05％v/v吐溫-20去垢劑；0.01％w/v四胺化合物，0.5％w/v硫酸慶大霉素。該試劑也可能含高達15％的Stabilcoat緩沖液，和20％從抗原制備物中得到或另外添加的組織培養(yǎng)液。溶液的優(yōu)選pH值是7.5-8.5。也可以用預先配制的組織培養(yǎng)液(如BioWhittaker公司的EMEM或DMEM培養(yǎng)液)來替代緩沖液和/或鹽。
不希望受任何特定理論的限制，對原有稀釋劑所作的修改可能通過以下機制增強多肽或抗原的穩(wěn)定性。胎牛血清可能較BSA提供更豐富的蛋白質來源，這是由于胎牛血清是一種全血清產品而不是純化的蛋白質。它可能含有其它穩(wěn)定性物質。甘油可能通過氫鍵結合增加抗原的水化作用。螯合劑可能通過去除陽離子來增加穩(wěn)定性，陽離子對多肽或抗原本身可能有負面影響，或者，陽離子對于某種能破壞抗原或多肽的降解酶的活性所必需或可能抑制抗原上的催化部位。去垢劑可能維持抗原或多肽的二級結構以及輔助締合，并破壞不重要的或降解性的結構/相互作用。
本發(fā)明用在如上描述的一種單純BSA蛋白質稀釋劑(PBT)中的第一標準抗原穩(wěn)定性進行了評定。一般地，在試劑研制中，如果在45℃使陽性保持約3天則足以用來評定其在較低溫度時具有長期穩(wěn)定性。那些本技術領域的技術人員相信，高溫下的穩(wěn)定性長達約14天表明該抗原是一種得到很好穩(wěn)定的抗原。另外，某抗原在45℃保持活性的時間越長，越有可能在低溫如2℃-8℃以及室溫時穩(wěn)定時間越長。首先，將福爾馬林滅活的流感病毒貯存懸液以本技術領域公知的方式制備，并在下面的實施例1中進行了描述。然后，A型和B型流感病毒的滅活貯存液分別以1∶2和1∶4的比例摻入單純蛋白質稀釋劑中。在這種稀釋度，在整個測試用稀釋劑中，含有50％稀釋劑，25％ICC，25％Stabilcoat緩沖液，或75％稀釋劑，12.5％ICC，12.5％Stabilcoat緩沖液。所選的抗原稀釋度提供在反應檢測儀中可肉眼判定的中等陽性信號強度。兩種終溶液用FLU OLA檢測試劑盒(Biostar，Inc.)于4℃時在第0天、第3天和45℃時在第3天檢測其陽性程度。按照每份包裝中的文字說明進行測試。滅活的B型流感病毒于45℃時第3天失去了全部陽性，而滅活的A型流感病毒失去了部分陽性。由于試劑的失活，對以后的時間點未進行檢測。PBT蛋白質稀釋劑不能維持所需程度的抗原穩(wěn)定性。
另外，一種用作保護和穩(wěn)定抗體包被表面的市售稀釋劑，Stabilcoat緩沖液(BSI，Inc)也用以上所述的抗原稀釋物進行了檢測。由Stabilcoat得到的對照試劑的穩(wěn)定性按以上方法進行測定，只是檢測的時間點是第0天和第4天(4℃和45℃的保存條件)。在這些條件下，稀釋劑的全部組成包括75％的Stabilcoat緩沖液和25％的ICC。即使在組織培養(yǎng)液存在時，Stabilcoat緩沖液不能保持滅活的B型流感病毒的穩(wěn)定性超過4天，顯示其缺乏長期保存的潛能。
接著，對本發(fā)明的試劑組合物按如上所述方法進行了檢測，以便確定其性能。這種情況下，用于滅活的A型流感病毒時，稀釋劑的全部成分包括50％稀釋劑，25％ICC，和25％Stabilcoat緩沖液；用于滅活的B型流感病毒時，包括75％稀釋劑，12.5％ICC和12.5％Stabilcoat緩沖液。在45℃的第3天，A型和B型的滅活流感病毒均失去部分陽性，但仍明顯呈陽性。滅活的B型流感病毒試劑在第7、14和21天進行了測定。最終，在45℃保存21天后，滅活的B型流感病毒失去全部陽性。以前的研究表明，滅活的A型流感病毒到第21天，也失去了相當大比例的陽性。滅活的A型流感病毒在這種特定條件下增強的數(shù)據(jù)未顯示，是因為其已失效而沒有檢測。然而，滅活的A型流感病毒在這種條件下的穩(wěn)定性可能非常高，而且時間超過了檢測的時間點。如果檢測出在這種或其它分析條件下的失效，本發(fā)明的稀釋劑應該也能增加A型流感病毒抗原的穩(wěn)定性。因此，與單純的PBT蛋白稀釋劑和Stabilcoat比較，本發(fā)明的組合物用于保存時，具有更好的穩(wěn)定溶液中抗原的能力。
在對本發(fā)明進行的另一個測定中，本發(fā)明的穩(wěn)定稀釋劑用于一個更敏感的光學分析方法中。該方法中的陽性對照使用福爾馬林滅活的A型和B型流感病毒抗原1∶10稀釋后的稀釋液，以達到這種對照溶液所需的中等信號。該檢測中所用抗體的選擇是根據(jù)所用包被表面類型的最適分析性能而定。檢測表面的反應區(qū)域用一種優(yōu)選的方法制備，即將抗A型和B型流感病毒的單克隆抗體在表面上劃條紋，以使每個測試表面含一個A型流感病毒和一個B型流感病毒的反應區(qū)域。將反應表面干燥并在室溫用一種防腐劑溶液再包被?？贵w表面用一種熱樁設備進行熱封，以形成一個聚苯乙烯環(huán)，可使溶液透過或圍繞滲水性表面。這種塑料環(huán)為方便操作提供一種支撐，并可提供一種將滲水性表面裝到真空源上以幫助去除液體并干燥滲水性表面的方法。為達到本實驗的目的，檢測以直通型方式進行。直通型是指在檢測過程中，樣品與分析表面接觸并可流過、保持在其上或周圍。
該實驗檢測了作為本發(fā)明的穩(wěn)定稀釋劑的一種成分的細胞培養(yǎng)液(EMEM，BioWhittaker，CAT，#12 136Q)增加抗原穩(wěn)定性的能力。制備了四種檢測溶液(A)75％發(fā)明稀釋劑，12.5％EMEM和12.5％Stabilcoat緩沖液，(B)溶液A，其中EMEM另外含有2％FCS，1％L-谷氨酰胺和0.5％PenStrep/Fungizone(一種抗微生物溶液，BioWhittaker Cat.#17-745H)，(C)75％發(fā)明稀釋劑和25％Stabilcoat緩沖液，(D)單純的發(fā)明稀釋劑。分別用四種稀釋劑對滅活的B型流感病毒貯存懸液進行了1∶10的稀釋。這是通過首先用各種檢測稀釋劑進行1∶4稀釋，然后再進行1∶2.5稀釋而得到的。每種溶液在4℃和45℃于第3天進行測定。在45℃的第3天，溶液A具最佳穩(wěn)定性，其次是溶液B、D和C。結果表明在增加抗原稀釋度的條件下，在稀釋劑中滲入細胞培養(yǎng)液/Stabilcoat可增加抗原的穩(wěn)定性(比較溶液A和D中的穩(wěn)定性)。用高濃度的Stabilcoat緩沖液作為唯一的其它組成成分(溶液C)，證實不利于抗原的穩(wěn)定性(相對于溶液A)。
因此，這些結果清楚地表明，本發(fā)明在水溶液介質中穩(wěn)定蛋白質抗原的能力方面明顯超過其它同類型的稀釋劑，特別是針對流感病毒。
以下的實施例是為了說明而不是為了限定而提供的，用于進一步說明本發(fā)明的各個方面和各種實施方案。實施例決不限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1測定抗原穩(wěn)定性是在一種單純蛋白質稀釋劑(PBT)中進行的，該稀釋劑含1XDulbecco氏PBS，0.05％吐溫-20去垢劑，2％BSA，0.01％小殺菌素II防腐劑，和0.5％硫酸慶大霉素。首先，由以下方法制備滅活的流感病毒貯存懸液。用A型流感病毒(每瓶以1∶10000稀釋A/HongKong68)或B型流感病毒(每瓶以1∶1000稀釋B/Panama45/90)感染鋪滿的MDCK p83細胞，并培養(yǎng)于Eagle氏MEM維持培養(yǎng)基中(含2％熱滅活的FCS，1％L-谷氨酰胺和0.5％Pen/Strep/Fungizone)，直到觀察到90-100％的CPE(致細胞病變效應)。通過震蕩并對細胞懸液離心來收集病毒。所得的上清液通過加入37％福爾馬林溶液(SigmaChemical生產，F(xiàn)-1268)至總體積的0.2％(2μ1/ml)，并在室溫孵育1小時而滅活。然后，將含病毒溶液與等體積的Stabilcoat緩沖液(BSI，INC)混勻、分裝，使用或立即冷凍。
將滅活的A型和B型流感病毒貯存懸液分別以1∶2和1∶4的比例摻入到單純BSA稀釋劑中，即將1ml滅活的A型流感病毒貯存液加到1ml單純稀釋劑，以及在另一個容器中將0.5ml滅活的B型流感病毒貯存液加到1.5ml單純稀釋劑中。在這些稀釋度，在整個測試稀釋劑中分別含有50％稀釋劑，25％ICC和25％Stabilcoat緩沖液，或含有75％稀釋劑，12.5％ICC和12.5％Stabilcoat緩沖液。然后，每種配制好溶液用FLU OIA檢測試劑盒(Biostar，Inc.)在第0天測定其陽性程度。檢測按照每個包裝內的說明進行，信號質量或陽性程度通過如下所述分類對FLU OLA反應檢測儀以肉眼判定(0)陰性；(1)模糊；(2)極弱陽性；(3)極弱和弱之間陽性；(4)弱陽性；(5)弱和中等之間陽性；(6)中等陽性；(7)中等和強之間陽性；(8)強陽性結果。信號在2-8之間，被認為是陽性。
稀釋后每種溶液被分為兩部分，一部分在4℃、另一部分在45℃保存3天。所有四種溶液均在第3天以與第0天同樣的方式進行重復檢測。4℃的第0天對照結果是預料的中等陽性信號。滅活的B型流感病毒在45℃的第3天失去全部陽性，而滅活的A型流感病毒失去一部分陽性。由于試劑已失效，因此對以后的時間點未進行測定。典型地，在試劑研制中，在45℃陽性能保持到第3天足以估計較低溫度下具有長期穩(wěn)定性。一種試劑在45℃活性保持越久，與在低溫如2-8℃和室溫下的穩(wěn)定性相關。因此，這種單純PBT配方不能將抗原的穩(wěn)定性維持在所需的程度。
實施例2Stabilcoat緩沖液(BSI，Inc)，一種市售的用于保護和穩(wěn)定抗體包被表面的稀釋劑，用如實施例1中所述方法進行檢測，不同的是試劑的測定是在第0天和第4天(4℃和45℃的貯存條件)進行。注意稀釋劑的完全成分是75％Stabilcoat緩沖液和25％ICC。Stabilcoat也不能將滅活的B型流感病毒抗原的穩(wěn)定性保持4天以上，表明它缺乏長期保存的潛力。
實施例3接著，對本發(fā)明的試劑組合物按實施例1中所描述的類似實驗進行檢測，稀釋劑總體積20ml，配制如下在一個圓錐管中，加入2ml 1M磷酸鈉緩沖液和8ml水(100mM)，混勻，調PH值為7.5。然后加入0.175g氯化鈉(150mM)，混勻。接著加入0.1ml 10％吐溫-20溶液(0.05％)并混勻。然后，在管中加入0.2ml 1％Microcide II防腐劑貯存液(0.01％)和0.1ml硫酸慶大霉素(0.5％)并混勻。接著，加入2ml甘油(10％)和1ml胎牛血清(5％)，混勻。再加入0.4ml 500mM的EDTA/H2O(10mm)貯存液，混勻，調PH值為7.5。加水使總體積為20ml。
病毒檢測試劑的制備是在5ml滅活的A型流感病毒貯存液中加入5ml稀釋劑(1∶2稀釋)，或在2.5ml滅活的B型流感病毒貯存液中加入7.5ml稀釋劑(1∶4稀釋)并混勻。在這種情況時，A型流感病毒稀釋液的完全成分包括50％稀釋劑，25％ICC，和25％Stabilcoat緩沖液，B型流感病毒的完全成分包括75％稀釋劑，12.5％ICC，和12.5％Stabilcoat緩沖液。在每個實驗的全過程中，F(xiàn)LU OIA檢測按照每個包裝中的說明進行。由于抗原穩(wěn)定性的增加，這個實驗一直做到第21天。在45℃的第3天，A、B兩型滅活的流感病毒均失去了部分陽性，但仍清晰地呈現(xiàn)陽性。滅活的B型流感病毒試劑在第7、14和21天進行了檢測。最后，在45℃的第21天，滅活的B型流感病毒失去了全部陽性。其它研究顯示，滅活的A型流感病毒在同樣長的時間后，也失去了相當比例的陽性。檢測結果經肉眼判斷，根據(jù)下述的0-8級主觀分級標準(0)陰性；(1)模糊；(2)極弱陽性；(3)極弱和弱之間的陽性；(4)弱陽性；(5)弱和中等之間的陽性；(6)中等陽性；(7)中等和強之間的陽性；(8)強陽性結果。信號在2-8之間被認為是陽性。B型流感病毒在本發(fā)明的稀釋劑中穩(wěn)定性的提高如
圖1所示。
實施例4對本發(fā)明做的另一個檢測中，穩(wěn)定性稀釋劑用于一個不同的分析中，其中陽性對照采用將福爾馬林滅活的A、B兩型流感病毒抗原以1∶10的比例稀釋于稀釋劑中，以達到對這種對照溶液所要求的中等信號。滅活的流感病毒貯存懸液的制備如實施例1，穩(wěn)定性稀釋劑的制備如實施例3?？贵w被選擇用于包被由光學法制備的可滲水性表面，其中該表面是包被一層提供反射性的光學硅膠層、一層抗反射性的Si3N4層和一層依據(jù)WO/98/18962的類鉆石碳附著層的軌跡蝕刻聚碳酸酯膜。這項檢測所用抗體的選擇是基于對其所用表面類型具有最佳的分析效果。分析用表面上反應區(qū)域的制備采用一種優(yōu)選的方法，即在表面上用抗A型流感病毒的單克隆抗體(40μg/ml溶解在0.1M HEPES，pH8.0，1％蔗糖中)或抗B型流感病毒的單克隆抗體(40μg/ml溶解在0.1M HEPES，pH8.0，1％蔗糖，150mM氯化鈉中)劃條紋，使每個分析表面也因此包含了一個A型流感病毒的反應區(qū)和一個B型流感病毒的反應區(qū)。表面劃線采用一種BioJet(BioDot，Inc.)儀器，在室溫下將反應表面干燥并用一種防腐劑溶液再包被?？贵w表面用一種熱樁設備進行熱封，以形成一個聚碳酸酯環(huán)，可使溶液透過或圍繞滲水性表面。這種塑料環(huán)為方便操作提供一種支撐，并可提供一種將滲水性表面裝到真空源上以幫助去除液體并干燥滲水性表面的方法。使用前，包被的表面儲存在2-8℃的條件下。為達到本實驗的目的，檢測以直通型方式進行。直通型是指在檢測過程中，樣品與分析表面接觸并可流過、保持在其上或周圍。
該實驗檢測了細胞培養(yǎng)液(EMEM)作為本發(fā)明的穩(wěn)定稀釋劑的一種成分，增加抗原穩(wěn)定性的能力。制備了四種檢測溶液(A)75％發(fā)明稀釋劑，12.5％EMEM和12.5％Stabilcoat緩沖液，(B)溶液A，其中 EMEM另外含有2％FCS，1％L-谷氨酸鹽和0.5％PenStrep/Fungizone，(C)75％發(fā)明稀釋劑和25％Stabilcoat緩沖液，(D)單純的發(fā)明稀釋劑。分別用四種稀釋劑對滅活的B型流感病毒貯存懸液進行了1∶10的稀釋，即先進行1∶4稀釋，然后再進行1∶2.5的稀釋。以上四種溶液各取30μl分別加入到含有165μl提取試劑的試管中，孵育1分鐘。然后，將全部樣本轉移到上述的表面上，孵育3分鐘。接著，將100μl偶聯(lián)物(偶合辣根過氧化物酶(HRP)的抗A型流感病毒抗體與偶合辣根過氧化物酶的抗B型流感病毒抗體混合)加到表面上再放3分鐘。下一步，將真空泵加到表面底部，從表面上將樣本/偶聯(lián)物的混合物吸過或吸走。之后，在真空壓力下，將含水洗滌溶液加到表面上并使溶液滲過表面流走，直至表面干燥，這樣洗滌三次。關掉真空泵后，將75μl沉淀TMB的底物放在分析表面上并孵育6分鐘。底物被吸過表面，再采用以上所述的方法將表面沖洗一次并晾干。然后對這種分析信號用實施例3所述方法進行解釋。
每種溶液在4℃和45℃于第3天進行測定。在45℃的第3天，溶液A具最佳穩(wěn)定性，其次是溶液B、D和C。結果表明在增加抗原稀釋度的條件下，在稀釋劑中滲入細胞培養(yǎng)液/Stabilcoat可增加抗原的穩(wěn)定性(比較溶液A和D中的穩(wěn)定性)。用高濃度的Stabilcoat緩沖液作為唯一的其它組成成分(溶液C)，經證實不利于抗原的穩(wěn)定性。圖2顯示前述實驗結果。
這些結果清楚地提示，本發(fā)明在穩(wěn)定水溶液中蛋白質抗原的能力上明顯超過其它的稀釋劑，特別是針對流感病毒的蛋白質抗原。以上所參考的各種參考文獻、專利或專利申請書在此匯編，以其整體進行參考。
雖然已經描述了本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，但是本技術領域的技術人員應該理解由此所做的多種可能的變動、改編和修正并不背離本發(fā)明的精神和所附權利要求的范圍。
權利要求
1.一種水溶性試劑組合物，其中包括緩沖液、封閉劑、增溶劑、鹽、螯合劑、去垢劑和防腐劑，并且其最終pH值是7.5-8.5。
2.如權利要求1所述的水溶性試劑，其中所述的封閉劑是一種血清。
3.如權利要求2所述的水溶性試劑，其中所述的封閉劑是胎牛血清。
4.如權利要求1所述的水溶性試劑，其中所述的增溶劑是甘油。
5.如權利要求1所述的水溶性試劑，其中所述的鹽是氯化鈉。
6.如權利要求1所述的水溶性試劑，其中所述的螯合劑是乙二胺四乙酸(EDTA)。
7.如權利要求1所述的水溶性試劑，其中所述的去垢劑是吐溫-20(Tween-20)。
8.如權利要求1所述的水溶性試劑，其中所述的防腐劑是溴化三甲基十四烷基銨和慶大霉素。
9.如按權利要求1所述的水溶性試劑，其中所述的緩沖液是磷酸鈉。
10.如權利要求1所述的水溶性試劑，其中所述的緩沖液是磷酸鈉，所述的封閉劑是胎牛血清，所述的增溶劑是甘油，所述的鹽是氯化鈉，所述的螯合劑是EDTA，所述的去垢劑是吐溫-20，且所述的防腐劑是溴化三甲基十四烷基銨和慶大霉素。
11.如權利要求1所述的水溶性試劑，進一步包括一種組織培養(yǎng)液，或幾種組織培養(yǎng)液和Stabilcoat緩沖液。
12.如權利要求10所述的水溶性試劑，其中所述的組織培養(yǎng)液是Eagle氏基本必需培養(yǎng)基。
13.如權利要求1所述的水溶性試劑，其中水溶性試劑包括50mM到100mM間的磷酸鈉，2％到20％v/v間的胎牛血清，2.5％到10％v/v間的甘油，50mM到2M間的氯化鈉，10mM到15mM間的EDTA，0.05％到0.1％v/v間的吐溫-20去垢劑，0.01％w/v的溴化三甲基十四烷基銨，和0.5％w/v的硫酸慶大霉素，并且其終pH值是7.5-8.5。
14.一種穩(wěn)定溶液中抗原或多肽的方法，其中包括將該抗原或多肽放置在一種水溶性試劑中，該水溶性試劑包含緩沖液、封閉劑、增溶劑、鹽、螯合劑、去垢劑和防腐劑，其最終pH值是7.5-8.5。
15.如權利要求14所述的水溶性試劑，其中所述的封閉劑是一種血清。
16.如權利要求15所述的水溶性試劑，其中所述的封閉劑是胎牛血清。
17.如權利要求14所述的方法，其中所述的抗原或多肽來源于一種微生物。
18.如權利要求17所述的方法，其中所述的微生物是一種病毒。
19.如權利要求17所述的方法，其中所述的微生物是一種細菌。
20.如權利要求18所述的方法，其中所述的病毒是流感病毒。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述的流感病毒是B型流感病毒。
22.如權利要求14所述的方法，其中所述的抗原是多肽。
23.如權利要求22所述的方法，其中所述的多肽是核蛋白。
24.如權利要求14所述的方法，其中所述的水溶性試劑進一步包括一種組織培養(yǎng)基或幾種組織培養(yǎng)基。
25.如權利要求24所述的方法，其中所述的組織培養(yǎng)液是一種基本必需培養(yǎng)基。
26.一種檢測穩(wěn)定于水溶液中的抗原或多肽的方法，該方法包括a)在一種水溶性試劑中放置抗原或多肽，該水溶性試劑包含緩沖液、封閉劑、增容劑、鹽、螯合劑、去垢劑和防腐劑，其最終pH值是7.5-8.5；b)用一種分析方法檢測所述的抗原或多肽。
27.如權利要求26所述的水溶性試劑，其中所述的封閉劑是一種血清。
28.如權利要求27所述的水溶性試劑，其中所述的封閉劑是胎牛血清。
29.如權利要求26所述的方法，其中所述的分析方法是一種免疫分析方法。
30.如權利要求29所述的方法，其中所述的免疫分析是一種酶免疫分析方法。
31.如權利要求26所述的方法，其中所述的免疫分析是一種光學免疫分析方法。
32.如權利要求26所述的方法，其中所述的分析方法是一種核酸雜交方法。
33.一種用于穩(wěn)定其中某種抗原或多肽的水溶性試劑組合物，其中包含緩沖液、封閉劑、增溶劑、鹽、螯合劑、去垢劑和防腐劑，其最終pH值是7.5-8.5；其中所述的抗原或多肽用一種分析方法檢測。
34.如權利要求33所述的水溶性試劑，其中所述的封閉劑是一種血清。
35.如權利要求34所述的水溶性試劑，其中所述的封閉劑是胎牛血清。
36.如權利要求33所述的水溶性試劑進一步包括所述的抗原或多肽。
37.如權利要求36所述的水溶性試劑，其中所述的抗原或多肽來源于一種微生物。
38.如權利要求37所述的水溶性試劑，其中所述的微生物是一種病毒。
39.如權利要求37所述的水溶性試劑，其中所述的微生物是一種細菌。
40.如權利要求38所述的水溶性試劑，其中所述的病毒是流感病毒。
41.如權利要求40所述的水溶性試劑，其中所述的流感病毒是B型流感病毒。
42.如權利要求36所述的水溶性試劑，其中所述的抗原是一種核蛋白。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于穩(wěn)定多肽或抗原的組合物。這些組合物用于穩(wěn)定儲存在水溶性配方中的多肽或抗原。這種配方可以用于多種分析或其他方法中。
文檔編號C12N5/02GK1409758SQ00817003
公開日2003年4月9日 申請日期2000年12月7日 優(yōu)先權日1999年12月14日
發(fā)明者J·W·斯蒂費恩斯, L·潘扎雷拉 申請人:熱生物之星公司, 旭化成株式會社