專利名稱：雜交冬油料種子油菜及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及冬油料種子油菜(winter oilseed rape；WOSR)植物，更具體地涉及一對(duì)尤其適于產(chǎn)生雜交種子的冬油料種子油菜植物。更具體地，一種植物的特征為 雄性不育，因?yàn)樵谄浠蚪M中存在雄性不育基因，而另一種植物的特征為攜帶可阻止雄性不育基因活性的育性恢復(fù)基因。本發(fā)明的這對(duì)WOSR植物將形成雜交種子的能力與最佳總體農(nóng)學(xué)性能、遺傳穩(wěn)定性以及對(duì)不同遺傳背景的適應(yīng)性相結(jié)合。
此處引用的所有文獻(xiàn)皆列入本文作為參考。
油料種子油菜(Oilseed rape，OSR)(歐洲油菜(Brassica napus)，AACC，2n＝38)為天然雜交產(chǎn)物，其來(lái)自油菜(甘藍(lán)(Brassica Oleracea)，CC，2n＝18)和蕪菁(蕓苔，AA，2n＝20)的種間雜交。冬油料種子油菜在八月的最后10天及九月的前10天播種，并在來(lái)年七月收獲，其需要一段氣候溫和的時(shí)期進(jìn)行春化作用。較快生長(zhǎng)的春油菜在三月末和四月初播種，并在八月中至九月收獲。目前生長(zhǎng)的OSR主要類型為低芥酸和高芥酸品種。雙低(00)品種含低(通常少于1％)水平的芥酸(發(fā)現(xiàn)人類對(duì)其難于消化)和低水平的芥子油甙(其使油渣副產(chǎn)品難于被動(dòng)物消化)。目前“00”品種的用途包括用于人類消耗的油及用于喂養(yǎng)動(dòng)物的高蛋白質(zhì)飼料。工業(yè)用途包括藥物及液壓油供給原料。高芥酸油菜(HEAR)品種因?yàn)槠浣嫠岷俊谟椭械暮恳话銥?0-60％油而被專門種植。HEAR主要的最終用途為產(chǎn)生芥酸酰胺，后者為聚乙烷生產(chǎn)中使用的“增滑劑”。小部分用于產(chǎn)生山萮醇，將其加至蠟樣的粗礦物油中以提高后者的流動(dòng)性。
油料種子油菜植物為兩性的，一般60-70％為自花傳粉。作為選擇基礎(chǔ)，雜交體的產(chǎn)生和遺傳變異的導(dǎo)入通常依賴于對(duì)自然發(fā)生現(xiàn)象(例如自身不相容性和細(xì)胞質(zhì)雄性不育)的適應(yīng)。在OSR育種中未廣泛使用人工授粉控制法例如手工去雄或使用殺配子劑，分別是因?yàn)樗鼈冇邢薜膶?shí)用性和高成本。
已開(kāi)發(fā)了用于產(chǎn)生雄性或雌性不育植物的轉(zhuǎn)基因方法，它們提供了有意義的常規(guī)技術(shù)替代方法。
EP0,344,029描述了用于獲得核雄性不育的體系，其中將植物用雄性不育基因轉(zhuǎn)化，所述雄性不育基因包含例如在絨氈層特異啟動(dòng)子PTA29控制下的編碼芽孢桿菌RNA酶的DNA，當(dāng)該基因摻入植物中后，可選擇性破壞絨氈層細(xì)胞。用此嵌合基因轉(zhuǎn)化煙草及油料種子油菜植物可導(dǎo)致花粉形成完全受阻的植物(Mariani等，1990，自然(Nature)347737-741)。
為恢復(fù)雄性不育植物之子代的育性，開(kāi)發(fā)了這樣的體系，其中雄性不育植物與攜帶育性恢復(fù)基因的轉(zhuǎn)基因植物雜交，當(dāng)育性恢復(fù)基因表達(dá)時(shí)可抑制或阻止雄性不育基因的活性(US5,689,041；US5,792,929)。此育性恢復(fù)基因被置于指導(dǎo)其至少在表達(dá)雄性不育基因的細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子的控制下。Mariani等(1992，自然357384-387)表明由pTA29芽孢桿菌RNA酶基因編碼的不育性可被油料種子油菜中嵌合的pTA29芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因恢復(fù)。
De Block和De Brouwer(1993，Planta 189218-225)描述了歐洲油菜植物花藥發(fā)育之細(xì)胞化學(xué)和組織化學(xué)分析，其中所述植物只包含嵌合pTA29芽孢桿菌RNA酶基因或包含pTA29芽孢桿菌RNA酶基因和pTA29芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因。
已通過(guò)一些方法獲得了對(duì)蕓苔屬種的成功轉(zhuǎn)化，包括農(nóng)桿菌感染(其描述見(jiàn)例如EP0,116,718和EP0,270,882)、微粒轟擊法(其描述于例如Chen等，1994，理論與應(yīng)用遺傳學(xué)(Theor.Appl.Genet.)88187-192)及直接的DNA攝入(其描述于例如De Block等，1989，植物生理學(xué)(PlantPhysiol.)914694-701；Poulsen，1996，植物育種(Plant Breeding)115209-225)。
但前述文獻(xiàn)對(duì)本發(fā)明未起到教導(dǎo)及提示作用。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第一種WOSR植物或其種子、細(xì)胞或組織包含pTHW107表達(dá)盒。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種WOSR植物或其種子、細(xì)胞或組織包含事件MS-BN1。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，第二種WOSR植物或其種子、細(xì)胞或組織包含pTHW1118表達(dá)盒。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，該WOSR植物或其種子、細(xì)胞或組織包含事件RF-BN1。在本發(fā)明的一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一種WOSR植物包含事件MS-BN1，且第二種WOSR植物包含事件RF-BN1，且由它們獲得的雜交種子包含事件MS-BN1和RF-BN1或只包含RF-BN1。
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因WOSR種子或可由此類種子生長(zhǎng)出的植物，其基因組DNA具有下列一個(gè)或兩種特征a)基因組DNA可產(chǎn)生選自以下限制性片段組中的至少兩組，優(yōu)選地至少三組，更優(yōu)選地至少四組，最優(yōu)選地五組限制性片段組i)含兩條EcoRI片段的組，一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2266bp，且一條的長(zhǎng)度大于14kbp；ii)含兩條EcoRV片段的組，其中一條的長(zhǎng)度在1159和1700bp之間，優(yōu)選地約1.4kbp，且另一條的長(zhǎng)度大于14kbp；
iii)含兩條Hpal片段的組，一條的長(zhǎng)度在1986和2140bp之間，優(yōu)選地長(zhǎng)度約1990bp，且一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2229bp；iv)含三條AflIII片段的組，一條的長(zhǎng)度在514和805bp之間，優(yōu)選地長(zhǎng)度約522bp，且一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2250bp，且一條的長(zhǎng)度在2450和2838bp之間，優(yōu)選地約2477bp；v)含兩條NdeI片段的組，兩者的長(zhǎng)度均在5077和14057bp之間，優(yōu)選地一條約為6500bp，且另一條約為10kbp；其中每一條限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊條件下可與包含PTA29-芽孢桿菌RNA酶序列的3942bp長(zhǎng)的片段雜交，其中所述3942bp長(zhǎng)的片段可通過(guò)用HindIII消化此處描述的質(zhì)粒pTHW107獲得；和/或b)基因組DNA可產(chǎn)生選自以下限制性片段組中的至少兩組，優(yōu)選地至少三組，更優(yōu)選地至少四組限制性片段組i)含三條BamHI片段的組，其中一條長(zhǎng)度在805和1099bp之間，優(yōu)選地約為814bp，一條長(zhǎng)度在1700和1986bp之間，優(yōu)選地約為1849bp，一條長(zhǎng)度在2450和2838bp之間，優(yōu)選地約為2607bp，且一條長(zhǎng)度在5077和14057bp之間，優(yōu)選地約為6500bp；ii)含四條EcoRI片段的組，一條片段在805和1159bp之間，優(yōu)選地約為1094bp，一條長(zhǎng)度在1986和2450bp之間，優(yōu)選地約為2149bp，以及兩條長(zhǎng)度在5077和14057bp之間，優(yōu)選地一條約為7000bp，且一條長(zhǎng)度約為10kbp；iii)含兩條EcoRV片段的組，其中兩者長(zhǎng)度均在5077和14057bp之間，優(yōu)選地一條長(zhǎng)度約為5.4kbp，且另一條長(zhǎng)度約為8kbp；iv)含三條HindIII片段的組，其中一條片段的長(zhǎng)度在1700和2140bp之間，優(yōu)選地約為1969bp，且兩條長(zhǎng)度在2450和2838bp之間，優(yōu)選地一條長(zhǎng)度約為2565bp，且一條長(zhǎng)度約為2635bp；其中每一條限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊條件下可與包含PTA29-芽孢桿菌RNA酶抑制劑序列的2182bp長(zhǎng)的片段雜交，其中所述2182bp長(zhǎng)的片段可通過(guò)用HpaI消化此處描述的質(zhì)粒pTHW118獲得。
本發(fā)明涉及WOSR植物的種子或可由此類種子生長(zhǎng)出的植物、或其細(xì)胞或組織，其基因組DNA具有下列一個(gè)或兩個(gè)特征a)基因組DNA可產(chǎn)生至少兩組，優(yōu)選地至少三組，例如至少四組，更優(yōu)選五組限制性片段組，所述片段組選自在上述a)中描述的、包含在上述a)i)，ii)，iii)，iv)和v)中的限制性片段組，因而選擇可包括上述a)中描述的i)，ii)，iii)，iv)和v)的任一組合；和/或b)基因組DNA可產(chǎn)生至少兩組，優(yōu)選地至少三組，最優(yōu)選地四組限制性片段組，所述片段組選自在上述b)中描述的、包含在上述b)i)，ii)，iii)和iv)中的限制性片段組，因而選擇可包括在上述b)中描述的i)，ii)，iii)和iv)的任一組合。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及WOSR種子或可由此類種子生長(zhǎng)出的植物，其基因組DNA具有下列一個(gè)或兩個(gè)特征c)可以使用基因組DNA，經(jīng)用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度在260和300bp之間，優(yōu)選地約為280bp的DNA片段，兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No12和SEQ ID No19，和/或d)可以使用基因組DNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度在195和235bp之間，優(yōu)選地約為215bp的DNA片段，兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No23和SEQ ID No41。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及WOSR種子或可由此類種子生長(zhǎng)的植物，其基因組DNA具有上述a)和c)中的特征和/或上述b)和d)中的特征。
本發(fā)明涉及WOSR植物的種子或可由此類種子生長(zhǎng)出的植物，其基因組DNA具有下列一個(gè)或兩個(gè)特征a)基因組DNA可產(chǎn)生選自以下限制性片段組中的至少兩組，優(yōu)選地至少三組，更優(yōu)選地至少四組，最優(yōu)選地五組限制性片段組i)含兩條EcoRI片段的組，一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2266bp，且一條的長(zhǎng)度大于14kbp；ii)含兩條EcoRV片段的組，其中一條的長(zhǎng)度在1159和1700bp之間，優(yōu)選地約1.4kbp，且另一條的長(zhǎng)度大于14kbp；iii)含兩條Hpal片段的組，一條的長(zhǎng)度在1986和2140bp之間，優(yōu)選地長(zhǎng)度約1990bp，且一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2229bp；iv)含三條AflIII片段的組，一條的長(zhǎng)度在514和805bp之間，優(yōu)選地長(zhǎng)度約522bp，且一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2250bp，且一條的長(zhǎng)度在2450和2838bp之間，優(yōu)選地約2477bp；v)含兩條NdeI片段的組，兩者的長(zhǎng)度均在5077和14057bp之間，優(yōu)選地一條約為6500bp，且另一條約為10kbp；其中每一條限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊條件下可與包含PTA29-芽孢桿菌RNA酶序列的3942bp長(zhǎng)的片段雜交，其中所述3942bp長(zhǎng)的片段可通過(guò)用HindIII消化此處描述的質(zhì)粒pTHW107獲得；和/或c)可使用基因組DNA，經(jīng)用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度在260和300bp之間，優(yōu)選地約為280bp的DNA片段，兩條引物分別具有SEQ ID No12和SEQ ID No19的核苷酸序列。
本發(fā)明涉及WOSR植物，優(yōu)選為雄性不育植物的種子，或可由此類種子生長(zhǎng)出的植物，或其細(xì)胞或組織，其基因組DNA具有可產(chǎn)生至少兩組，優(yōu)選地至少三組，更優(yōu)選地五組限制性片段組，所述片段組選自上述的、包含在上述i)，ii)，iii)，iv)和v)中的限制性片段組，因而選擇可包括上述i)，ii)，iii)，iv)和v)的任一組合。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及WOSR植物的種子，或可由此類種子生長(zhǎng)出的植物，其基因組DNA具有下列一個(gè)或兩個(gè)特征b)基因組DNA可產(chǎn)生選自以下限制性片段組中的至少兩組，優(yōu)選地至少三組，更優(yōu)選地四組限制性片段組i)含三條BamHI片段的組，其中一條長(zhǎng)度在805和1099bp之間，優(yōu)選地約為814bp，一條長(zhǎng)度在1700和1986bp之間，優(yōu)選地約為1849bp，一條長(zhǎng)度在2450和2838bp之間，優(yōu)選地約為2607bp，且一條長(zhǎng)度在5077和14057bp之間，優(yōu)選地約為6500bp；ii) 含四條EcoRI片段的組，一條片段在805和1159bp之間，優(yōu)選地約為1094bp，一條長(zhǎng)度在1986和2450bp之間，優(yōu)選地約為2149bp，以及兩條長(zhǎng)度在5077和14057bp之間，優(yōu)選地一條約為7000bp，且一條長(zhǎng)度約為10kbp；iii)含兩條EcoRV片段的組，其中兩者長(zhǎng)度均在5077和14057bp之間，優(yōu)選地一條長(zhǎng)度約為5.4kbp，且另一條長(zhǎng)度約為8kbp；iv)含三條HindIII片段的組，其中一條片段的長(zhǎng)度在1700和2140bp之間，優(yōu)選地約為1969bp，且兩條長(zhǎng)度在2450和2838bp之間，優(yōu)選地一條長(zhǎng)度約為2565bp，且一條長(zhǎng)度約為2635bp；其中每一條限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊條件下可與包含PTA29-芽孢桿菌RNA酶抑制劑序列的2182bp長(zhǎng)的片段雜交，其中所述2182bp長(zhǎng)的片段可通過(guò)用HpaI消化此處描述的質(zhì)粒pTHW118獲得；和/或d)可使用基因組DNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度在195和235bp之間，優(yōu)選地約為215bp的DNA片段，兩條引物分別具有SEQ ID No23和SEQ ID No41的核苷酸序列。
本發(fā)明涉及WOSR植物，優(yōu)選為育性恢復(fù)植物的種子，或可由此類種子生長(zhǎng)出的植物、或其細(xì)胞或組織，其基因組DNA可產(chǎn)生選自上述的、包含在上述b)i)，ii)，iii)和iv)中的限制性片段組中的至少兩組，優(yōu)選地至少三組，最優(yōu)選地四組限制性片段組，因而選擇可包括上述b)中描述的i)，ii)，iii)和iv)的任一組合。
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因WOSR植物、細(xì)胞、組織或種子，其優(yōu)選地分別具有上述b)和/或d)這兩者的特性。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及轉(zhuǎn)基因植物，優(yōu)選為雜交的育性得以恢復(fù)的WOSR植物、細(xì)胞、組織或種子，它們是通過(guò)將雄性不育植物與具有上述特征的、本發(fā)明的育性恢復(fù)植物雜交而獲得的，因而育性得以恢復(fù)的植物、細(xì)胞組織或種子具有雄性不育的分子特征和上述育性恢復(fù)WOSR植物的特征。本發(fā)明進(jìn)一步涉及轉(zhuǎn)基因植物，優(yōu)選為雜交WOSR植物、細(xì)胞、組織或種子，它們是通過(guò)將雄性不育植物與具有上述分子特征的、本發(fā)明之育性恢復(fù)植物雜交而獲得的，因而雜交植物、細(xì)胞組織或種子具有上述育性恢復(fù)WOSR植物的分子特征。
本發(fā)明也涉及保藏于ATCC保藏號(hào)為PTA-730的種子、由該種子生長(zhǎng)出的植物以及該種子長(zhǎng)出的植物之細(xì)胞或組織。本發(fā)明進(jìn)一步涉及可通過(guò)由保藏于ATCC保藏號(hào)為PTA-730的種子長(zhǎng)出的WOSR植物的繁殖和/或育種而獲得的植物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生雜交WOSR種子的方法，其包括將本發(fā)明的雄性不育WOSR植物與本發(fā)明的育性恢復(fù)植物雜交。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含重組DNA的WOSR植物、植物細(xì)胞、植物組織或種子，其中所述重組DNA含有整合入部分染色體DNA的至少一種序列為SEQ ID No22的轉(zhuǎn)基因和/或至少一種序列為SEQ ID No34的轉(zhuǎn)基因。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了產(chǎn)生WOSR植物的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或由其獲得的植物的方法，該方法包括將序列特征為SEQ ID No22的重組DNA分子插入WOSR細(xì)胞的部分染色體DNA，并且任選地，由轉(zhuǎn)化的WOSR細(xì)胞再生WOSR植物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了產(chǎn)生WOSR植物的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或由其獲得的植物的方法，該方法包括將序列特征為SEQ ID No34的重組DNA分子插入WOSR細(xì)胞的部分染色體DNA，并且任選地，由轉(zhuǎn)化的WOSR細(xì)胞再生WOSR植物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定包含本發(fā)明之原種事件MS-BN1的轉(zhuǎn)基因植物、或其細(xì)胞或組織的方法，該方法包括建立的轉(zhuǎn)基因植物或其細(xì)胞或組織的基因組DNA的下列一個(gè)或兩個(gè)特征a)基因組DNA可產(chǎn)生選自以下限制性片段組中的至少兩組，優(yōu)選地至少三組，更優(yōu)選地至少四組，最優(yōu)選地五組限制性片段組i)含兩條EcoRI片段的組，一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2266bp，且一條的長(zhǎng)度大于14kbp；ii)含兩條EcoRV片段的組，其中一條的長(zhǎng)度在1159和1700bp之間，優(yōu)選地約1.4kbp，且另一條的長(zhǎng)度大于14kbp；iii)含兩條Hpal片段的組，一條的長(zhǎng)度在1986和2140bp之間，優(yōu)選地長(zhǎng)度約1990bp，且一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2229bp；iv)含三條AflIII片段的組，一條的長(zhǎng)度在514和805bp之間，優(yōu)選地長(zhǎng)度約522bp，且一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2250bp，且一條的長(zhǎng)度在2450和2838bp之間，優(yōu)選地約2477bp；v)含兩條NdeI片段的組，兩者的長(zhǎng)度均在5077和14057bp之間，優(yōu)選地一條約為6500bp，且另一條約為10kbp；其中每一條限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊條件下可與包含PTA29-芽孢桿菌RNA酶序列的3942bp長(zhǎng)的片段雜交，其中所述3942bp長(zhǎng)的片段可通過(guò)用HindIII消化此處描述的質(zhì)粒pTHW107獲得；和/或c)可使用基因組DNA，根據(jù)本文所述的PCR鑒定方法，擴(kuò)增出長(zhǎng)度在260和300bp之間，優(yōu)選地約為280bp的DNA片段，兩條鑒定原種事件的引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No12和SEQ ID No19。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定包含本發(fā)明之原種事件RF-BN1的轉(zhuǎn)基因植物、或其細(xì)胞或組織的方法，該方法包含建立轉(zhuǎn)基因植物或其細(xì)胞或組織的基因組DNA的下列一個(gè)或兩個(gè)特征b)基因組DNA可產(chǎn)生選自以下限制性片段組中的至少兩組，優(yōu)選地至少三組，更優(yōu)選地四組限制性片段組i)含三條BamHI片段的組，其中一條長(zhǎng)度在805和1099bp之間，優(yōu)選地約為814bp，一條長(zhǎng)度在1700和1986bp之間，優(yōu)選地約為1849bp，一條長(zhǎng)度在2450和2838bp之間，優(yōu)選地約為2607bp，且一條長(zhǎng)度在5077和14057bp之間，優(yōu)選地約為6500bp；ii)含四條EcoRI片段的組，一條片段在805和1159bp之間，優(yōu)選地約為1094bp，一條長(zhǎng)度在1986和2450bp之間，優(yōu)選地約為2149bp，以及兩條長(zhǎng)度在5077和14057bp之間，優(yōu)選地一條約為7000bp，且一條長(zhǎng)度約為10kbp；iii)含兩條EcoRV片段的組，其中兩者長(zhǎng)度均在5077和14057bp之間，優(yōu)選地一條長(zhǎng)度約為5.4kbp，且另一條長(zhǎng)度約為8kbp；iv)含三條HindIII片段的組，其中一條片段的長(zhǎng)度在1700和2140bp之間，優(yōu)選地約為1969bp，且兩條長(zhǎng)度在2450和2838bp之間，優(yōu)選地一條長(zhǎng)度約為2565bp，且一條長(zhǎng)度約為2635bp；其中每一條限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊條件下可與包含PTA29-芽孢桿菌RNA酶抑制劑序列的2182bp長(zhǎng)的片段雜交，其中所述2182bp長(zhǎng)的片段可通過(guò)用HpaI消化此處描述的質(zhì)粒pTHW118獲得，和/或d)可使用基因組DNA，用此處描述的PCR鑒定方法擴(kuò)增出長(zhǎng)度在195和235bp之間，優(yōu)選地約為215bp的DNA片段，鑒定該原種事件的兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No23和SEQ ID No41。
本發(fā)明也涉及用于鑒定包含本發(fā)明原種事件MS-BN1的植物的試劑盒，所述試劑盒包含核苷酸序列為SEQ ID No.12和SEQ ID No.19的PCR探針。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于鑒定包含本發(fā)明原種事件RF-BN1的植物的試劑盒，所述試劑盒包含核苷酸序列為SEQ ID No.23和SEQ ID No.41的PCR探針。
本發(fā)明也涉及用于鑒定生物樣本中的原種事件MS-BN1和/或RF-BN1的試劑盒，該試劑盒包含至少一條特異引物或探針，其具有的序列對(duì)應(yīng)于(或互補(bǔ)于)與MS-BN1特定區(qū)域具有80％至100％序列同一性的序列，和/或包含至少一條特異引物或探針，其具有的序列對(duì)應(yīng)于(或互補(bǔ)于)與RF-BN1特定區(qū)域具有80％至100％序列同一性的序列。優(yōu)選的探針序列對(duì)應(yīng)于包含MS-BN1和/或RF-BN15’或3’側(cè)翼區(qū)部分的特定區(qū)域。最優(yōu)選地，該特異探針具有(或互補(bǔ)于)這樣的序列，對(duì)于MS-BN1而言，它與SEQ ID No.36或SEQ ID No.38的植物DNA序列具有80％至100％序列同一性或與RF-BN1而言，它與SEQ ID No.39或SEQ ID No.40的植物DNA序列具有80％至100％序列同一性。
優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒除了包含一條特異性識(shí)別MS-BN1和/或RF-BN1的5’或3’側(cè)翼區(qū)的引物外，還包含第二條特異性識(shí)別MS-BN1和/或RF-BN1的外源DNA序列的引物，以用于PCR鑒定方法。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒包含兩條(或多條)特異引物，其中一條識(shí)別MS-BN1和/或RF-BN1的5’或3’側(cè)翼區(qū)中的序列，最優(yōu)選地，MS-BN1SEQ ID No.36或SEQ ID No.38的植物DNA區(qū)域的序列，或?qū)τ赗F-BN1SEQ ID No.39或SEQ ID No.40的植物DNA區(qū)域的序列，且另一條識(shí)別MS-BN1和/或RF-BN1的外源DNA中的序列。特別優(yōu)選地，識(shí)別MS-BN15’側(cè)翼區(qū)植物DNA序列的引物包含SEQ ID No.19的核苷酸序列。尤其是，識(shí)別MS-BN15’側(cè)翼區(qū)的植物DNA序列的引物包含SEQ ID No.19的核苷酸序列，識(shí)別MS-BN1的外源DNA的引物包含此處描述的SEQ ID No.12的核苷酸序列。尤其優(yōu)選地，識(shí)別RF-BN15’側(cè)翼區(qū)的植物DNA序列的引物包含SEQ ID No.41的核苷酸序列。尤其地，識(shí)別RF-BN15’側(cè)翼區(qū)的植物DNA序列的引物包含SEQ ID No.41的核苷酸序列且識(shí)別RF-BN1的外源DNA的引物包含此處描述的SEQ ID No.23的核苷酸序列。
本發(fā)明包含的方法和試劑盒可用于不同的目的，例如但不限于下列目的用于鑒定植物、植物材料或產(chǎn)品中的MS-BN1和/或RF-BN1，其中所述產(chǎn)品例如但不限于包含或衍生于植物材料的食物或飼料產(chǎn)品(新鮮或加工過(guò)的)；另外，本發(fā)明的方法和試劑盒可用于鑒定轉(zhuǎn)基因植物材料，目的在于將轉(zhuǎn)基因材料和非轉(zhuǎn)基因材料分開(kāi)；另外，本發(fā)明的方法和試劑盒可用于確定含MS-BN1和/或RF-BN1的植物材料之質(zhì)量(即純材料百分比)。
應(yīng)理解本文提及的從屬權(quán)利要求描述了本發(fā)明具體的實(shí)施方案。
附圖簡(jiǎn)述下文以實(shí)例方式進(jìn)行的詳述不用于將本發(fā)明限制于所述的具體實(shí)施方案，其可通過(guò)結(jié)合附圖來(lái)理解，附圖于此處引用作為參考，其中


圖1pVE113的質(zhì)粒圖譜圖2MS-BN1基因組DNA消化后得到的限制性圖譜用Southern印跡分析凝膠的加樣順序泳道1，用EcoRI消化MS-BN1DNA，泳道2，用EcoRV消化MS-BN1 DNA，泳道3，用HpaI消化MS-BN1DNA，泳道4，用AflIII消化MS-BN1 DNA，泳道5，用NdeI消化MS-BN1DNA，泳道6，用BamHI消化非轉(zhuǎn)基因WOSR DNA，泳道7，用BamHI消化非轉(zhuǎn)基因WOSR+用BamHI消化對(duì)照質(zhì)粒pTHW1O7DNA。
圖3.RF-BN1基因組DNA消化后得到的限制性圖譜用Southern印跡分析凝膠的加樣順序泳道1，用BamHI消化RF-MS1DNA，泳道2，用EcoRI消化RF-BN1DNA，泳道3，用EcoRV消化RF-BN1DNA，泳道4，用HindIII消化RF-BN1DNA，泳道5，用BamHI消化非轉(zhuǎn)基因WOSR DNA，泳道6，用BamHI消化非轉(zhuǎn)基因WOSR+用BamHI消化對(duì)照質(zhì)粒pTHW118DNA。
圖4.用MS-BN1PCR鑒定方法對(duì)不同品系的PCR分析凝膠的加樣順序泳道1，DNA樣本來(lái)自包含轉(zhuǎn)基因事件MS-BN1的OSR植物，泳道2，DNA樣本來(lái)自包含另一轉(zhuǎn)基因事件的OSR植物，泳道3，DNA樣本來(lái)自野生型OSR，泳道4，陰性對(duì)照(水)，泳道5，分子量標(biāo)志物(100bp梯帶)。
圖5.用RF-BN1PCR鑒定方法對(duì)不同品系的PCR分析凝膠的加樣順序泳道1，DNA樣本來(lái)包含轉(zhuǎn)基因事件RF-BN1的OSR植物，泳道2，DNA樣本來(lái)自包含另一轉(zhuǎn)基因事件的OSR植物，泳道3，DNA樣本來(lái)自野生型OSR，泳道4，陰性對(duì)照(水)，泳道5，分子量標(biāo)志物(100bp梯帶)。發(fā)明詳述此處所用的術(shù)語(yǔ)“基因”指的是任一DNA序列，其包含一些可操作連接的DNA片段，例如啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)(5’UTR)，它們一起形成啟動(dòng)子區(qū)域，編碼區(qū)(其編碼或不編碼蛋白質(zhì))以及包含聚腺苷酸化位點(diǎn)的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)。在植物細(xì)胞中通常5’UTR、編碼區(qū)和3’UTR轉(zhuǎn)錄為RNA，其在為蛋白質(zhì)編碼基因的情況下被翻譯為蛋白質(zhì)?；蚩砂~外的DNA片段，例如內(nèi)含子。如此處所用，基因座為某個(gè)指定基因在植物基因組中的位置。
當(dāng)提到基因或DNA序列時(shí)所用的術(shù)語(yǔ)“嵌合”是指這樣的基因或DNA序列，其包含至少兩種相互間為非天然連接的，且例如來(lái)自不同來(lái)源的、功能相關(guān)的DNA片段(例如啟動(dòng)子、5’UTR、編碼區(qū)、3’UTR、內(nèi)含子)。談到某植物種的“外源”基因或DNA序列指的是在該植物中該基因或DNA序列為非天然發(fā)現(xiàn)的，或在該植物種的該基因座中該基因或DNA序列為非天然發(fā)現(xiàn)的。此處所用術(shù)語(yǔ)“外源DNA”指作為轉(zhuǎn)化的結(jié)果而摻入植物基因組的DNA序列。此處所用“轉(zhuǎn)化DNA”指用于轉(zhuǎn)化的重組DNA分子。轉(zhuǎn)化DNA通常包含可將一種或多種特異的特性賦予被轉(zhuǎn)化植物的至少一種“目標(biāo)基因”(例如嵌合基因)。術(shù)語(yǔ)“重組DNA分子”用于例證和可包含分離的核酸分子，其可為DNA且其可通過(guò)重組或其它方法獲得。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”指摻入植物基因組的目的基因?！稗D(zhuǎn)基因植物”指在其所有細(xì)胞的基因組中包含至少一種轉(zhuǎn)基因的植物。
在本發(fā)明的植物中存在的外源DNA優(yōu)選地包含兩種目的基因，更具體地，或?yàn)樾坌圆挥蚝统輨┛剐曰?，或?yàn)橛曰謴?fù)基因和除草劑抗性基因。
此處所用術(shù)語(yǔ)“雄性不育基因”指的是這樣的基因，其在植物中表達(dá)后，使植物不能產(chǎn)生能育的、能活的花粉。雄性不育基因的實(shí)例為包含編碼芽孢桿菌RNA酶之DNA序列的基因，其中編碼芽孢桿菌RNA酶的DNA序列處于介導(dǎo)其于絨氈層細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子的控制下。更具體地，本發(fā)明的雄性不育基因?yàn)榇颂幟枋龅摹癟A29-芽孢桿菌RNA酶”。
此處所用的“育性恢復(fù)基因”指的是這樣的基因，其在含有雄性不育基因的植物中表達(dá)后，可阻止雄性不育基因的表型表達(dá)，使該植物恢復(fù)育性。更具體地，育性恢復(fù)基因包含編碼可阻止雄性不育基因表型表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽的DNA，其中所述DNA處于介導(dǎo)其至少在表達(dá)雄性不育基因的細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子的控制下。更具體地，本發(fā)明的育性恢復(fù)基因?yàn)榇颂幩龅摹癟A29-芽孢桿菌RNA酶抑制劑”。
植物基因組中重組DNA分子的摻入通常來(lái)自細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)化(或來(lái)自另一種遺傳操作)。摻入的具體位點(diǎn)或是隨機(jī)的或是事先決定的位置(如果用靶向整合方法的話)。
外源DNA可表征為重組DNA分子在植物基因組中摻入位點(diǎn)的位置和構(gòu)型。重組DNA在植物基因組中的插入位點(diǎn)也稱為“插入位點(diǎn)”或“目標(biāo)點(diǎn)”。植物基因組中轉(zhuǎn)基因的插入與植物DNA的缺失相關(guān)，稱為“目標(biāo)位點(diǎn)缺失”。此處所用的“側(cè)翼區(qū)”或“側(cè)翼序列”指的是這樣的序列，其為植物基因組的至少20bp序列，優(yōu)選地至少50bp序列，以及高達(dá)5000bp的序列，其位于緊挨著外源DNA的上游且鄰近于外源DNA，或位于緊挨著外源DNA的下游且鄰近于外源DNA。導(dǎo)致外源DNA隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)化步驟會(huì)產(chǎn)生具有不同側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)化子，對(duì)每一次轉(zhuǎn)化而言它們是特有的和唯一的。當(dāng)轉(zhuǎn)基因通過(guò)常規(guī)的雜交導(dǎo)入植物時(shí)，其在植物基因組中的插入位點(diǎn)或其側(cè)翼區(qū)一般不改變。此處所用的“插入?yún)^(qū)”指的是對(duì)應(yīng)于至少40bp，優(yōu)選地至少100bp，以及高達(dá)超過(guò)10000bp的區(qū)域，其包含在(未轉(zhuǎn)化的)植物基因組中轉(zhuǎn)基因的上游和下游側(cè)翼區(qū)中且包括插入位點(diǎn)(以及可能的目標(biāo)位點(diǎn)缺失)?？紤]到由于種內(nèi)突變引起的小差異，插入?yún)^(qū)與包含那個(gè)種中指定植物的外源DNA上游和下游側(cè)翼區(qū)的序列保持至少85％，優(yōu)選地90％，更優(yōu)選地95％，且最優(yōu)選地100％序列同一性。
目的基因的表達(dá)指的是通過(guò)轉(zhuǎn)化，將重組DNA分子-轉(zhuǎn)化DNA-導(dǎo)入(基于部分或全部目的基因的結(jié)構(gòu)和功能)，而賦予植物一個(gè)或多個(gè)表型特征(例如除草劑抗性)。
“事件”定義為作為遺傳操作結(jié)果的(人工的)基因座，其攜帶包含至少一拷貝目的基因的外源DNA。一個(gè)事件的一般等位基因狀態(tài)為外源DNA的存在或缺失。此處所用的“MS”事件和“RF”事件分別指攜帶“TA29-芽孢桿菌RNA的特征為一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。在基因水平上，事件是植物基因組成的一部分。在分子水平上，事件的特征在于轉(zhuǎn)基因的限制性酶切圖譜(例如通過(guò)Southern印跡確定)和/或轉(zhuǎn)基因的上游和/或下游側(cè)翼序列，和/或轉(zhuǎn)基因的分子構(gòu)型。通常用包含至少一種目的基因的轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化植物，導(dǎo)致多個(gè)事件，其中每一個(gè)均為唯一的。
此處所用的“原種事件”為基于轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和穩(wěn)定性以及與含有它的植物之最佳農(nóng)藝學(xué)特性的相容性而從一組事件選擇的事件，其通過(guò)用同一轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化或通過(guò)與此類轉(zhuǎn)化所獲得的植物回交而獲得。因此原種事件選擇的標(biāo)準(zhǔn)為一種或多種，優(yōu)選地兩種或多種，有利地為所有下列標(biāo)準(zhǔn)a)轉(zhuǎn)基因的存在不降低其它所期望有的植物特性，例如那些與農(nóng)學(xué)特性或商業(yè)價(jià)值相關(guān)的特性；b)事件的特征在于充分定義的穩(wěn)定遺傳之分子構(gòu)型，且可開(kāi)發(fā)用于鑒定對(duì)照的合適診斷工具；c)在事件的雜合(或半合子)和純合子的情況下，轉(zhuǎn)基因中的目標(biāo)基因在一系列的環(huán)境條件下以商業(yè)可接受水平顯示正確、合適且穩(wěn)定的空間和時(shí)間表型表達(dá)，其中攜帶事件的植物可能處于常規(guī)的農(nóng)業(yè)用途；
優(yōu)選外源DNA與植物基因組的某個(gè)位置有關(guān)，其中所述位置允許基因摻入所期望的商業(yè)遺傳背景。
事件作為原種事件的情形通過(guò)將原種事件摻入不同的相關(guān)遺傳背景并且觀察例如上述a)，b)和c)中的一個(gè)、兩個(gè)或所有標(biāo)準(zhǔn)而證實(shí)。
另外，對(duì)于此處描述的編碼雄性不育和育性恢復(fù)的轉(zhuǎn)基因，對(duì)原種事件的選擇也取決于這些事件間的相容性，更具體地?cái)y帶雄性不育事件的植物與攜帶育性恢復(fù)事件的植物雜交所產(chǎn)生的子代中存在兩種事件，所述子代具有以下特征a)育性恢復(fù)表型即雄性育性的充分表型表達(dá)，以及b)在一系列的環(huán)境條件下，表型表達(dá)為商業(yè)可接受的水平，其中攜帶兩個(gè)事件的植物可能處于常規(guī)的農(nóng)業(yè)用途；因此“原種事件”指的是包含轉(zhuǎn)基因的基因座，其滿足上述標(biāo)準(zhǔn)。植物、植物材料或子代例如種子可在其基因組中包含一個(gè)或多個(gè)原種事件。
開(kāi)發(fā)用于鑒定原種事件或鑒定包含原種事件的植物或植物材料之“診斷工具”是基于原種事件的特定基因組特性，例如包含外源DNA的基因組區(qū)域之特定的限制性圖譜和/或轉(zhuǎn)基因側(cè)翼區(qū)的序列。此處所用的“限制性圖譜”指的是用特定的限制性酶或一組限制性酶酶切植物基因組DNA并在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊條件下與探針雜交后獲得的一組Southern印跡模式，其中所述探針與轉(zhuǎn)基因具有序列相似性。此處所用標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)緊條件指的是此處所述的用于雜交的條件或由Sambrook等(1989)(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約(Molecular CloningA LaboratoryManual，Second Edition，Cold Spring Harbour Laboratory Press，NY))描述的常規(guī)雜交條件，其例如包括以下步驟1)將植物基因組DNA固定在濾膜上，2)將濾膜用50％甲酰胺，5X SSPE，2X Denhardt’s試劑和0.1％SDS，42℃預(yù)雜交1至2小時(shí)，或用6X SSC，2X Denhardt’s試劑和0.1％SDS，68℃預(yù)雜交1至2小時(shí)，3)加入已標(biāo)記的雜交探針，4)孵育16至24小時(shí)，5)用1X SSC，0.1％SDS室溫洗濾膜20分鐘，6)洗濾膜三次，20分鐘，每次在68℃于0.2X SSC，0.1％SDS，以及7)用增感屏將濾膜于-70℃暴露于X-射線膠片24至48小時(shí)。
由于(內(nèi)源)限制性位點(diǎn)在外源DNA摻入之前已存在于植物基因組中，外源DNA的插入將改變基因組的特定限制性圖譜。這樣由其衍生的特定轉(zhuǎn)化子或子代可通過(guò)一種或多種特定的限制性模式鑒定。決定事件的限制性圖譜的條件在“限制性圖譜鑒定方法”中給出。另外，一旦已對(duì)轉(zhuǎn)基因的一個(gè)或兩個(gè)側(cè)翼區(qū)進(jìn)行了測(cè)序，可在“PCR鑒定方法”中開(kāi)發(fā)特異性識(shí)別這種(這些)序列的PCR-探針。包含原種事件的植物或植物材料可用這些特異引物按照PCR方法通過(guò)試驗(yàn)鑒定。
如此處所用“生物樣本”為植物、植物材料或含有植物材料的產(chǎn)品之樣本。術(shù)語(yǔ)“植物”包含在任一成熟階段的WOSR(歐洲油菜)植物組織以及取自或衍生于任一此類植物的任一細(xì)胞、組織或器官，包括(但不限于)任一種子、葉、莖、花、根、單細(xì)胞、配子、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或原生質(zhì)體。此處所用的“植物材料”指的是來(lái)自或衍生于植物的材料。包含植物材料的產(chǎn)品涉及到食物、飼料或其它用植物材料產(chǎn)生的或可被植物材料污染的產(chǎn)品。應(yīng)該明白在本發(fā)明的上下文中，此類生物材料優(yōu)選地用于測(cè)試MS-BN1和/或RF-BN1特異核酸的存在，暗示樣本中存在核酸。因此此處所指的用于鑒定生物樣本中的原種事件MS-BN1和/或RF-BN1的方法優(yōu)選地涉及鑒定包含原種事件生物樣本中的核酸。
此處所用的“試劑盒”指的是以本發(fā)明方法實(shí)施為目的的一套試劑，更具體地，指的是鑒定生物樣本中原種事件MS-BN1和/或RF-BN1的一套試劑。更具體地，本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包含如上所述的至少一條或兩條特異引物。任選地，試劑盒可進(jìn)一步包含此處PCR鑒定方法中描述的任一其它試劑。另外，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，該試劑盒可包括如上所述的一條特異探針，其與生物樣本的核酸特異性雜交以鑒定其中MS-BN1和/或RF-BN1的存在。任選地，該試劑盒可進(jìn)一步包含任一其它試劑(例如但不限于雜交緩沖液、標(biāo)記物)，用于用特異探針鑒定生物樣本中MS-BN1和/或RF-BN1。
可使用本發(fā)明的試劑盒，試劑盒的組分可特異地調(diào)節(jié)，以用于質(zhì)量控制(例如種子批次的純度)，檢測(cè)植物材料或包含或衍生于植物材料的材料中(例如但不限于食物或飼料產(chǎn)品)的原種事件。
本發(fā)明涉及在WOSR中產(chǎn)生一組原種事件，MS-BN1和RF-BN1，包含這些事件的植物，這些植物雜交所獲得的子代，衍生于這些事件的植物細(xì)胞或植物材料。包含原種事件MS-BN1的植物通過(guò)如實(shí)施例1所述，用pTHW107轉(zhuǎn)化而獲得。包含原種事件RF-BN1的植物也通過(guò)如實(shí)施例1所述的轉(zhuǎn)化pTHW118而獲得。
用于產(chǎn)生原種事件MS-BN1的重組DNA分子包含編碼芽孢桿菌RNA酶分子的DNA序列，其在介導(dǎo)其選擇性地于絨氈層細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子的控制下(稱為“TA29-芽孢桿菌RNA酶”)。該TA29啟動(dòng)子在OSR中具有“絨氈層選擇的”表達(dá)模式(De Block和Debrouwer，Planta189218-225，1993)。TA29-芽孢桿菌RNA酶基因在WOSR植物的表達(dá)導(dǎo)致絨氈層被破壞，使植物雄性不育(Mariani等，1990，見(jiàn)上)。用于產(chǎn)生原種事件RF-BN1的重組DNA分子包含編碼芽孢桿菌RNA酶抑制劑分子的DNA序列，其在絨氈層特異的啟動(dòng)子的控制下(稱為“TA29-芽孢桿菌RNA酶抑制劑”)。在植物中存在“TA29-芽孢桿菌RNA酶”基因時(shí)，TA29-芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因在WOSR植物中的表達(dá)可阻止芽孢桿菌RNA酶在植物的絨氈層細(xì)胞中的活性，阻止了對(duì)絨氈層的破壞，并因此在這些植物中恢復(fù)育性(Mariani等，1992，見(jiàn)上)。
用于產(chǎn)生原種事件MS-BN1和RF-BN1的重組DNA兩者均額外包含編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶以及花椰菜花葉病毒(Cauliflower Mosaic Virus)35S啟動(dòng)子的DNA序列，其中編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶的序列在35S啟動(dòng)子的控制下(稱為“35S-bar”)。該35S啟動(dòng)子在OSR中為“組成型”表達(dá)模式，指的是它在大多數(shù)植物的生活周期中在大多數(shù)細(xì)胞類型中顯著表達(dá)。35S-bar基因在OSR植物的表達(dá)賦予其對(duì)除草劑化合物的抗性，如膦絲菌素或雙丙氨酰膦或草銨膦，或更通常是谷氨酰胺合成酶抑制劑或其鹽類或旋光異構(gòu)體。
包含MS-BN1的WOSR植物或植物材料可根據(jù)此處的實(shí)施例5中描述的MS-BN1限制性圖譜鑒定方法來(lái)鑒定。簡(jiǎn)而言之，WOSR基因組DNA用所選擇的下列限制性酶(優(yōu)選地2至5種)EcoRI、EcoRV、Ndel、HpaI、AflIII消化，然后轉(zhuǎn)移至尼龍膜并與質(zhì)粒pTHW107(或包含在其中的T-DNA)的3942bp HindIII片段雜交。然后確定所用的每一種限制性內(nèi)切酶是否可鑒定出下列片段-EcoRI一個(gè)片段在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2266bp，且一個(gè)片段大于14kbp；-EcoRV一個(gè)片段在1159和1700bp之間，優(yōu)選地約1.4kbp，且一個(gè)片段的長(zhǎng)度大于14kbp；-Hpal一個(gè)片段在1986和2140bp之間，優(yōu)選地長(zhǎng)度約1990bp，且一個(gè)片段在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2229bp；-AflIII一個(gè)片段在514和805bp之間，優(yōu)選地長(zhǎng)度約522bp，且一個(gè)片段在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2250bp，且一個(gè)片段在2450和2838bp之間，優(yōu)選地約2477bp；-Ndel兩條片段的長(zhǎng)度均在5077和14057bp之間，優(yōu)選地一條約為6500bp，且另一條約為10kbp；DNA片段的長(zhǎng)度通過(guò)與一組已知長(zhǎng)度的DNA片段，尤其是與噬菌體λDNA的PstI片段比較來(lái)確定。當(dāng)按照Dellaporta等(1983，PlantMolecular Biology Reporter，1，第3卷，19-21頁(yè))的方法提取DNA時(shí)，估計(jì)大于14kbp的片段的長(zhǎng)度在14kbp和40kbp之間。
如果用至少兩種，優(yōu)選地至少三種，尤其是至少四種，更尤其是用所有這些限制性酶消化植物材料后，產(chǎn)生具有上述同樣長(zhǎng)度的DNA片段，則該WOSR植物確定為擁有原種事件MS-BN1。
包含MS-BN1的植物或植物材料也可用此處實(shí)施例5描述的MS-BN1PCR鑒定方法進(jìn)行鑒定。簡(jiǎn)而言之，WOSR基因組DNA用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中一條引物特異性識(shí)別MS-BN1的側(cè)翼序列，優(yōu)選地識(shí)別此處描述的MS-BN1之5’或3’側(cè)翼序列，尤其是引物具有SEQ ID No19的序列，另一條引物識(shí)別轉(zhuǎn)基因中的序列，尤其是引物具有SEQ ID No12的序列。內(nèi)源的WOSR引物用作對(duì)照。如果植物材料產(chǎn)生在260和300bp間的片段，優(yōu)選地約280bp，該WOSR植物確定為擁有原種事件MS-BN1。
擁有MS-BN1的植物表型特征為當(dāng)它們的基因組中缺乏恢復(fù)基因時(shí)，它們?yōu)樾坌圆挥?。雄性不育植物被定義為不能產(chǎn)生能育的、能活的花粉。
擁有MS-BN1的植物例如，可從含有MS-BN1的種子獲得，其中所述種子保藏在ATCC，保藏號(hào)為PTA-730。此類植物可進(jìn)一步繁殖以將本發(fā)明的原種事件導(dǎo)入相同植物種的其它栽培品種包含RF-BN1的WOSR植物或植物材料可根據(jù)此處的實(shí)施例5中描述的RF-BN1限制性圖譜的鑒定方法來(lái)鑒定。簡(jiǎn)而言之，WOSR基因組DNA用所選擇的下列限制性酶(優(yōu)選地2至4種)BamHI、EcoRI、EcoRV和HindIII消化，然后轉(zhuǎn)移至尼龍膜并與質(zhì)粒pTHW118(或包含在其中的T-DNA)的2182bp Hpal片段雜交。然后確定所用的每一種限制性內(nèi)切酶是否可鑒定出下列片段-BamHI一個(gè)片段在805和1099bp之間，優(yōu)選地約為814bp，一個(gè)片段在1700和1986bp之間，優(yōu)選地約為1849bp，一個(gè)片段在2450和2838bp之間，優(yōu)選地約為2607bp，且一個(gè)片段在5077和14057bp之間，優(yōu)選地約為6500bp；-EcoRI一個(gè)片段在805和1159bp之間，優(yōu)選地約為1094bp，一個(gè)片段在1986和2450bp之間，優(yōu)選地約為2149bp，以及兩個(gè)片段在5077和14057bp之間，優(yōu)選地一條約為7000bp，且一條長(zhǎng)度約為10kbp；-EcoRV兩個(gè)片段均在5077和14057bp之間，優(yōu)選地一條長(zhǎng)度約為5.4kbp，且另一條長(zhǎng)度約為8kbp；-HindIII一個(gè)片段的長(zhǎng)度在1700和2140bp之間，優(yōu)選地約為1969bp，且兩個(gè)片段在2450和2838bp之間，優(yōu)選地一條長(zhǎng)度約為2565bp，且一條長(zhǎng)度約為2635bp；DNA片段的長(zhǎng)度通過(guò)與一組已知長(zhǎng)度的DNA片段，尤其是與噬菌體λDNA的PstI片段比較來(lái)確定。
如果用至少兩種，優(yōu)選地至少三種，更尤其是用所有這些限制性酶消化植物材料后，產(chǎn)生具有上述同樣長(zhǎng)度的DNA片段，則該WOSR植物確定為擁有原種事件RF-BN1。
包含RF-BN1的植物或植物材料也可用此處實(shí)施例5描述的RF-BN1PCR鑒定方法進(jìn)行鑒定。簡(jiǎn)而言之，WOSR基因組DNA用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中一條引物特異性識(shí)別RF-BN1的側(cè)翼序列，優(yōu)選地識(shí)別此處描述的RF-BN1之5’或3’側(cè)翼序列，尤其是引物具有SEQ ID No41的序列，另一條引物識(shí)別轉(zhuǎn)基因中的序列，尤其是引物具有SEQ ID No23的序列。內(nèi)源的WOSR引物用作對(duì)照。如果植物材料產(chǎn)生在195和235bp間的片段，優(yōu)選地約215bp，該WOSR植物確定為擁有原種事件RF-BN1。
擁有RF-BN1的植物特征為在絨氈層細(xì)胞中表達(dá)芽孢桿菌RNA酶抑制劑。在植物的絨氈層細(xì)胞中芽孢桿菌RNA酶抑制劑的產(chǎn)生顯示出對(duì)花粉的產(chǎn)生既無(wú)益處也無(wú)害處(Mariani等，1992，見(jiàn)上)。這樣當(dāng)植物基因組中缺乏雄性不育基因時(shí)，該TA29-芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因?qū)⒉粚?dǎo)致可觀察到的表型。當(dāng)植物基因組中存在雄性不育基因時(shí)，該TA29-芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因?qū)?dǎo)致育性恢復(fù)，即能育的表型。將具有育性恢復(fù)表型的植物定義為這樣的植物，盡管在其基因組中存在雄性不育基因，該植物能產(chǎn)生能育的、能活的花粉。
擁有RF-BN1的植物例如可從種子獲得，其中所述種子保藏在ATCC，保藏號(hào)為PTA-730。此類植物可進(jìn)一步繁殖和/或用于常規(guī)育種方案以將本發(fā)明的原種事件導(dǎo)入相同植物種的其它載培品種。
擁有MS-BN1和/或RF-BN1的植物的特征還在于它們的草銨膦耐受性，在本發(fā)明的上下文中它們包括耐受除草劑LibertyTM的植物。LibertyTM耐受性的定義標(biāo)準(zhǔn)為在3至4葉階段(3V to 4V)用至少200克活性成分/公頃(g.a.i./ha)，優(yōu)選地400g.a.i./ha，也可能高達(dá)1600g.a.i./ha噴灑植物時(shí)，不殺死該植物。擁有MS-BN1和/或RF-BN1的植物的特征還在于用PAT測(cè)定法測(cè)出它們的細(xì)胞中存在膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(DeBlock等，1987，見(jiàn)前)。
本發(fā)明的WOSR植物可用常規(guī)方法培育。35S-bar基因的存在使它們對(duì)草銨膦具耐受性。因此在生長(zhǎng)此類WOSR植物的田間可通過(guò)使用包含草銨膦作為活性成分的除草劑(例如LibertyTM)控制雜草。
擁有MS-BN1和/或RF-BN1的植物的特征還在于具有與在美國(guó)市售的WOSR品種相當(dāng)?shù)霓r(nóng)學(xué)特征。相關(guān)的農(nóng)學(xué)特征為植物高度、桿的強(qiáng)度或硬度、倒伏傾向、冬季頑強(qiáng)度、抗碎性、耐干旱性、抗病性(Black leg，Light leafspot，Sclerotinia)以及谷物生產(chǎn)和產(chǎn)量。
已觀察到此處描述的歐洲油菜WOSR植物基因組的插入?yún)^(qū)存在外源DNA，更具體地在歐洲油菜WOSR植物基因組的這些插入位點(diǎn)處存在外源DNA時(shí)，可賦予包含這些事件之植物特別感興趣的表型和分子特征。更具體地，在這些植物基因組的特定區(qū)存在外源DNA可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定的表型表達(dá)，而沒(méi)有顯著性危及到植物的任一其它理想的農(nóng)學(xué)特性方面，使得它們尤其適于產(chǎn)生雜交WOSR。這樣，對(duì)應(yīng)于SEQ ID No22和SEQID No34的插入?yún)^(qū)，更具體地為其中的MS-BN1和RF-BN1插入位點(diǎn)，顯示為尤其適于目的基因的導(dǎo)入。更具體地，MS-BN1(SEQ ID No22)的插入?yún)^(qū)和RF-BN1(SEQ ID No34)的插入?yún)^(qū)，或其中的MS-BN1和RF-BN1各自的插入位點(diǎn)，尤其適于分別導(dǎo)入包含雄性不育基因和育性恢復(fù)基因的質(zhì)粒，可確保植物中這些基因的每一個(gè)或兩者的最佳表達(dá)，同時(shí)不危及到植物的農(nóng)學(xué)特性。
重組DNA分子可通過(guò)靶向插入方法特定插入插入?yún)^(qū)。此類方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，包含例如用重組酶進(jìn)行同源重組，其中重組酶例如但不限于來(lái)自釀酒酵母(Saccharomyces cervisiae)的FLP重組酶(美國(guó)專利5,527,695)，來(lái)自大腸桿菌噬菌體P1的CRE重組酶(已公開(kāi)的PCT專利申請(qǐng)WO9109957)，來(lái)自魯氏糖酵母(Saccharomyces rouxii)pSRI的重組酶(Araki等，1985，分子生物學(xué)雜志(J Mol Biol)182191-203)，或如美國(guó)專利4,673,640中描述的λ噬菌體重組系統(tǒng)。
此處所用關(guān)于核苷酸序列(DNA或RNA)的“序列同一性”指的是具有的相同核苷酸的位置數(shù)除以兩個(gè)序列中的較短序列的核苷酸數(shù)目。兩個(gè)核苷酸序列的排列用Wilbur和Lipmann算法(Wilbur和Lipmann，1983)進(jìn)行，所用窗口大小為20個(gè)核苷酸， 字長(zhǎng)為4個(gè)核苷酸且缺口罰分為4。例如可用IntelligeneticsTM Suite程序(Intelligenetics Inc.，CA)方便地進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助分析并解釋序列數(shù)據(jù)，包括上述的序列排列。當(dāng)此類序列的序列同一性為至少約75％，尤其是至少約80％，更尤其是至少約85％，更尤其是約90％，特別是約95％，更特別是約100％，更特別是完全一致時(shí)，序列被表示為“基本相似”。這樣當(dāng)RNA序列被說(shuō)成是與DNA序列基本相似或具有某種程度的序列同一性時(shí)，應(yīng)清楚DNA序列中的胸腺嘧啶(T)認(rèn)為與RNA序列中的尿嘧啶(U)是相同的。
此處所用的“包含”可解釋為使所述特征、整數(shù)、步驟或組成的存在如所指的具體化，但不排除另外的一個(gè)或多個(gè)特征、整數(shù)、步驟、組成或組的存在。這樣例如包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白質(zhì)可包含較實(shí)際所引用的要多的核苷酸或氨基酸，即包括在較大的核酸或蛋白質(zhì)中。包含功能上或結(jié)構(gòu)上確定的DNA序列之嵌合基因可包含額外的DNA序列等。
下列實(shí)例描述了擁有原種事件MS-BN1和RF-BN1的WOSR植物的產(chǎn)生及特征。
除非另外指出，所有的重組DNA技術(shù)均按照描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，描述見(jiàn)Sambrook等(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約以及Ausubel等，(1994)分子生物學(xué)最新方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)，第1和2卷，最新方法，美國(guó)。植物分子研究的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法的描述見(jiàn)BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK R.D.D.Croy出版的植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)Labfax(1993)。
在描述和實(shí)施例中，參照以下序列SEQ ID No1質(zhì)粒pTHW107SEQ ID No2質(zhì)粒pTHW118SEQ ID No3引物248SEQ ID No4引物249SEQ ID No 5引物247SEQ ID No6引物250SEQ ID No7引物251SEQ ID No8引物254SEQ ID No9引物258SEQ ID No10引物SP6SEQ ID No11引物T7SEQ ID No12引物201(BNA01)
SEQ ID No13包含MS-BN15’側(cè)翼區(qū)的序列SEQ ID No14引物611SEQ ID No15引物259SEQ ID No16引物260SEQ ID No17引物24SEQ ID No18包含MS-BN13’側(cè)翼區(qū)的序列SEQ ID No19引物51(BNA02)SEQ ID No20引物48SEQ ID No21包含MS-BN1目標(biāo)位點(diǎn)缺失的序列SEQ ID No22插入?yún)^(qū)MS-BN1SEQ ID No23引物193(BNA03)SEQ ID No24包含RF-BN15’側(cè)翼區(qū)的序列SEQ ID No25引物286SEQ ID No26引物314SEQ ID No27引物315SEQ ID No28引物316SEQ ID No29引物288SEQ ID No30包含RF-BN13’側(cè)翼區(qū)的序列SEQ ID No31引物269SEQ ID No32引物283SEQ ID No33引物284SEQ ID No34整合區(qū)RF-BN1SEQ ID No35引物57SEQ ID No36包含WOSR中MS-BN15’側(cè)翼區(qū)的序列SEQ ID No37引物68SEQ ID No38包含WOSR中MS-BN13’側(cè)翼區(qū)的序列SEQ ID No39包含WOSR中RF-BN15’側(cè)翼區(qū)的序列SEQ ID No40包含WOSR中RF-BN13’側(cè)翼區(qū)的序列SEQ ID No41引物268(BNA04)
SEQ ID No42引物BNA05SEQ ID No43引物BNA06
表1對(duì)包含在pTHW107邊界重復(fù)序列之間的DNA進(jìn)行了充分描述表1質(zhì)粒pTHW107的T-DNA
b)構(gòu)建包含在組成型啟動(dòng)子控制下的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的嵌合DNA(pTHW118)質(zhì)粒pTHW118(SEQ ID No.2)也基本上衍生自中間載體pGSV1(描述見(jiàn)上)。表2給出了包含在pTHW118邊界重復(fù)序列之間的DNA的充分描述
表2質(zhì)粒pTHW118的T-DNA
c)歐洲油菜的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化歐洲油菜所用載體系統(tǒng)如Deblaere等(1985，1987)所述。該載體系統(tǒng)由農(nóng)桿菌菌株和兩個(gè)質(zhì)粒成分組成1)非致瘤性Ti-質(zhì)粒(pGV4000)和2)基于質(zhì)粒pGSV1的中間克隆載體。已缺失T-區(qū)的非致瘤性Ti-質(zhì)粒攜帶vir基因，它是將克隆在第二個(gè)質(zhì)粒上的人工T-DNA轉(zhuǎn)移至植物基因組所需要的。由這些成分之間三親雜交形成的農(nóng)桿菌菌株可用于植物轉(zhuǎn)化。
除小植株再生外，所有階段均用膦絲菌素(PPT)進(jìn)行選擇，缺乏PPT時(shí)進(jìn)行小植株再生可促進(jìn)其生長(zhǎng)。這樣產(chǎn)生了一組原初轉(zhuǎn)化體(T0代植物)。
實(shí)施例2.事件的產(chǎn)生2.1.轉(zhuǎn)基因事件的鑒定2.1.1.MS事件的Southern印跡分析用標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡分析檢查轉(zhuǎn)基因的存在和基因插入數(shù)。按照Dellaporta(1983，植物分子生物學(xué)報(bào)告者(Plant Molecular BiologyReporter)，1，第3卷，19-21頁(yè))或Doyle等，1987，植物化學(xué)通訊(Phytochem.Bull.)1911)從1g發(fā)芽組織分離總基因組DNA并用限制性酶SacI消化。在T-DNA片段中SacI具有唯一的限制性酶切位點(diǎn)，位于芽孢桿菌RNA酶和bar構(gòu)建體之間。用以下兩條探針進(jìn)行Southern分析“芽孢桿菌RNA酶”探針質(zhì)粒pVE113的478bp PstI-EcoRI片段“bar”探針質(zhì)粒pDE110的546bp NcoI-BglII片段質(zhì)粒pVE113和pDE110分別如
圖1和WO92/09696所述。
MS事件與芽孢桿菌RNA酶探針雜交產(chǎn)生一條12Kb條帶，而與bar探針雜交產(chǎn)生一條14Kb條帶。
相關(guān)條帶的深淺提供了植物是否與轉(zhuǎn)基因位置同源或異源的指征。發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)事件為簡(jiǎn)單插入。這一點(diǎn)可通過(guò)以下事實(shí)證實(shí)轉(zhuǎn)基因的分離模式可用簡(jiǎn)單基因瘤的孟德?tīng)栠z傳解釋。
2.1.2.RF事件的Southern印跡分析用標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡分析檢查轉(zhuǎn)基因的存在和基因插入數(shù)。從1g發(fā)芽組織分離總基因組DNA(按照Doyle等1987，植物化學(xué)通訊1911)并用限制性酶SacI消化。在T-DNA片段中SacI具有唯一的限制性酶切位點(diǎn)，位于芽孢桿菌RNA酶和bar構(gòu)建體之間。用以下兩條探針進(jìn)行Southern分析“芽孢桿菌RNA酶抑制劑”探針質(zhì)粒pVE113的436bpHindIII-PstI片段“bar”探針質(zhì)粒pDE110的546bp NcoI-BglII片段RF事件與芽孢桿菌RNA酶抑制劑探針雜交產(chǎn)生一條3Kb條帶，而與bar探針雜交產(chǎn)生一條14Kb片段。
相關(guān)條帶的深淺提供了植物是否與轉(zhuǎn)基因位置同源或異源的指征。發(fā)現(xiàn)一些事件為簡(jiǎn)單插入。這一點(diǎn)可通過(guò)以下事實(shí)證實(shí)轉(zhuǎn)基因的分離模式可用簡(jiǎn)單基因瘤的孟德?tīng)栠z傳解釋。
2.1.3.總體的植物表型及農(nóng)業(yè)特性用一系列的表型性狀評(píng)估含MS and RF事件的T1植物，包括高度、桿的強(qiáng)度或硬度、倒伏傾向、冬季頑強(qiáng)度、抗碎性、耐干旱性、抗病性(Blackleg，Light leafspot，Sclerotinia)以及谷物生產(chǎn)和產(chǎn)量。
與未轉(zhuǎn)化的品種及一系列油料種子油菜栽培品種比較，該品系所顯示出的農(nóng)學(xué)特征被評(píng)估為相似(或有所改變)。在一些情況下，植物分離用于對(duì)一個(gè)或多個(gè)上述性狀進(jìn)行體細(xì)胞克隆變異。除非這導(dǎo)致商業(yè)上感興趣的表型性狀的導(dǎo)入，否則棄去這些植物。
2.2.攜帶MS或RF性狀之品系的產(chǎn)生從組織培養(yǎng)物過(guò)渡成不同的T0半合子小植株(“Ms/-“或“Rf/-“)，轉(zhuǎn)移至溫室土壤。用southern印跡分析檢查轉(zhuǎn)基因的存在及拷貝數(shù)(如上所述)。允許植物開(kāi)花，并分別評(píng)估花的不育或育性。T0植物與野生型植物-/-)雜交以產(chǎn)生T1種子(MsT1和RfT1)。在溫室中種植并生長(zhǎng)T1種子。評(píng)估植物對(duì)草銨膦銨鹽的耐受性。也評(píng)估Ms-T1植物的不育/育性分離(在未經(jīng)噴灑的植物中)，同時(shí)檢查Rf-T1植物的育性花。
使包含轉(zhuǎn)基因的Ms-T1植物與育性恢復(fù)基因純合的試驗(yàn)植物(Rf/Rf)雜交，以產(chǎn)生MsRf-F1種子。在溫室種植該種子(Ms/-，Rf/-以及-/-，Rf/-)并噴灑LibertyTM。評(píng)估剩下的F1子代育性/不育分離，以測(cè)試在歐洲油菜中是否雄性不育特性可被足夠地恢復(fù)(育性接近100％)。
選擇最佳事件用于進(jìn)一步試驗(yàn)。Ms-T1植物與純合的育性恢復(fù)植物雜交，并在田間種植種子。評(píng)估植物對(duì)LibertyTM除草劑的耐受性(以800克活性成分/公頃(g.a.i./ha)，給農(nóng)民的推薦劑量為400g.a.i./ha)，評(píng)估育性/不育分離及評(píng)估總體的表型特征。與野生型同基因的對(duì)照比較，選擇育性100％恢復(fù)的且其表型或農(nóng)學(xué)特性未觀察到負(fù)罰分(詳見(jiàn)(d))的品系。
使包含轉(zhuǎn)基因的Rf-T1植物與包含雄性不育基因的試驗(yàn)植物(Ms/-)雜交，以產(chǎn)生F1種子。將該種子于溫室種植，噴灑LibertyTM并評(píng)估育性的恢復(fù)(接近100％)。
同時(shí)使Rf-T1植物自花授粉以產(chǎn)生S1。該S1植物于溫室生長(zhǎng)，噴灑LibertyTM并再次自花授粉以產(chǎn)生S2；從S2選擇純合子個(gè)體。
2.3.MS和RF事件的結(jié)合在溫室中，將已選擇的Ms-T1植物與已選擇的Rf-S2事件雜交，進(jìn)行育性恢復(fù)試驗(yàn)。將種子重新種植在溫室，植物噴灑LibertyTM并檢查花的育性。
2.4.在不同的遺傳背景及在不同位置上試驗(yàn)MS和RF事件將已選擇的事件導(dǎo)入兩個(gè)雜合差異的不同遺傳背景，以證實(shí)在任一受試背景下MS和RF事件均可發(fā)揮作用并對(duì)產(chǎn)量和質(zhì)量無(wú)負(fù)罰分。
同時(shí)對(duì)已選擇的MS和RF事件在四個(gè)或五個(gè)不同的環(huán)境中測(cè)試，以確保環(huán)境和MS或RF事件之間沒(méi)有消極的相互作用。
在下一階段，在田間進(jìn)行了更深入的試驗(yàn)，用已選擇的MS和RF事件產(chǎn)生雜交種子。使已選擇的MS事件在其最初背景以及在兩個(gè)不同的和雜合差異的背景下與已選擇的RF事件雜交。評(píng)估F1雜種對(duì)LibertyTM的抗性、育性以及總的農(nóng)學(xué)特性(產(chǎn)量和質(zhì)量)。
2.5.原種事件的選擇在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因MS品系的過(guò)程中，上述選擇步驟產(chǎn)生了一些原種事件，其可顯示轉(zhuǎn)基因的最佳表達(dá)，即對(duì)草銨膦銨鹽的抗性、雄性不育表型以及對(duì)于用純合恢復(fù)品系更具體地已選擇的RF原種事件完全恢復(fù)育性的易感性。
在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因RF品系的過(guò)程中中，上述選擇步驟產(chǎn)生了一些原種事件，其可顯示轉(zhuǎn)基因的最佳表達(dá)，即對(duì)草銨膦銨鹽的抗性以及F1與攜帶雄性不育基因，更具體地為已選擇的MS原種事件的植物雜交后恢復(fù)育性的能力。
實(shí)施例3將已選擇的候選原種事件導(dǎo)入WOSR如上所述于歐洲油菜中產(chǎn)生的一些MS和RF原種事件通過(guò)反復(fù)與Drakkar品種植物回交而導(dǎo)入WOSR栽培品種。
檢查植物并確定a)外源DNA的存在并不降低其它所期望有的植物特性，例如那些與農(nóng)學(xué)特性或商業(yè)價(jià)值相關(guān)的特性；b)事件的特征在于分定義的穩(wěn)定遺傳之分子構(gòu)型；c)在事件雜合(或半合)和純合的情況下，外源DNA中的目標(biāo)基因在一系列的環(huán)境條件下以商業(yè)可接受水平顯示正確、合適且穩(wěn)定的空間和時(shí)間表型表達(dá)，其中攜帶事件的植物可能處于常規(guī)的農(nóng)業(yè)用途；進(jìn)一步地，與野生型WOSR種類比較來(lái)評(píng)估該植物的農(nóng)學(xué)特性和性能。
在田間的廣泛試驗(yàn)表明當(dāng)某些春油料種子油菜的侯選原種事件導(dǎo)入WOSR植物時(shí)，可使植物表現(xiàn)出與最佳農(nóng)學(xué)性能相結(jié)合的、外源DNA中目的基因的充分表達(dá)。這些事件被選作WOSR中的MS和RF原種事件，并被分別命名為MS-BN1和RF-BN1。
實(shí)施例4.原種事件MS-BN1和RF-BN1的鑒定一旦MS-BN1和RF-BN1事件被鑒定為每個(gè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)及總體農(nóng)學(xué)性能均為最佳的原種事件，則于分子水平上詳細(xì)分析轉(zhuǎn)基因的位置。這包括詳細(xì)的Southern印跡分析(用多個(gè)限制性酶)以及對(duì)轉(zhuǎn)基因側(cè)翼區(qū)的測(cè)序。
4.1.使用多個(gè)限制性酶的Southern印跡分析從轉(zhuǎn)基因植物及對(duì)照植物收獲葉組織。按照Dellaporta等(1983，植物分子生物學(xué)報(bào)告者，1，第3卷，19-21頁(yè))，從葉組織分離總基因組DNA。用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為260nm處測(cè)定光密度來(lái)確定每種制品的DNA濃度。
用限制性酶消化10μg基因組DNA，終反應(yīng)體積為40μl，所用條件為廠商推薦條件。調(diào)節(jié)限制性酶的消化時(shí)間和/或量以確?；蚪MDNA樣本的完全消化且無(wú)非特異性降解。消化后，將4μl加樣染料加至已消化的DNA樣本，并將它們加樣至1％瓊脂糖凝膠上。
將下列對(duì)照DNA也加樣至凝膠上-陰性對(duì)照，由非轉(zhuǎn)基因蕓苔屬植物制備的基因組DNA。該陰性對(duì)照用于證實(shí)不存在背景雜交。
-DNA陽(yáng)性對(duì)照由將雜合的單拷貝轉(zhuǎn)基因整合入歐洲油菜基因組，10μg基因組DNA與±19皮克的來(lái)自pTHW118DNA的1501bpPvuI-HindIII片段具有相同分子當(dāng)量數(shù)(歐洲油菜二倍體基因組大小0.8×109bp)。將代表每個(gè)基因組一個(gè)質(zhì)?？截惖牧考又?μg消化的非轉(zhuǎn)基因歐洲油菜DNA中。該重建樣本用于顯示雜交是在允許探針與靶序列雜交的條件下進(jìn)行的。
將PstI消化的噬菌體λDNA(CIind 1 ts 857 Sam7株，LifeTechnologies)用作大小標(biāo)準(zhǔn)。
電泳后，用毛細(xì)管印跡將DNA樣本(消化的蕓苔屬基因組DNA，對(duì)照和大小標(biāo)準(zhǔn)DNA)經(jīng)12至16小時(shí)轉(zhuǎn)移至尼龍膜。
通過(guò)用HindIII限制性酶切消化PTW107制備用作MS-BN1事件探針制品的DNA模板。產(chǎn)生了一條包含轉(zhuǎn)化DNA相關(guān)部分的3942bp DNA片段(PSSUARA的部分，3’nos，芽孢桿菌RNA酶，PTA29)。
通過(guò)用Hpal限制性酶切消化PTW118制備用作RF-BN1事件探針制品的DNA模板。產(chǎn)生了一條包含轉(zhuǎn)化DNA相關(guān)部分的2182bp DNA片段(PSSUARA部分，3’nos，芽孢桿菌RNA酶抑制劑，PTA29)。
純化后，按照標(biāo)準(zhǔn)步驟標(biāo)記DNA片段，并用于與膜雜交。
在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊條件下進(jìn)行雜交在95℃至100℃水浴中加熱5至10分鐘變性標(biāo)記探針，并于冰上冷卻5至10分鐘，加至雜交液中，其中雜交液為(6X SSC(20X SSC為3.0M NaCl，0.3M檸檬酸鈉，pH7.0)、5XDenhardt′s(100X Denhardt’s＝2％Ficoll，2％聚乙烯吡咯烷酮，2％牛血清白蛋白)、0.5％SDS和20μg/ml變性載體DNA(平均長(zhǎng)度為120-3000個(gè)核苷酸的單鏈魚(yú)精DNA)。于65℃過(guò)夜雜交。用洗液(2X SSC，0.1％SDS)于65℃洗膜三次，持續(xù)20至40分鐘。
電子掃描放射自顯影。
4.1.1.MS-BN1用不同的限制性酶消化MS-BN1基因組DNA后得到的限制性酶切模式于圖2中給出，并總結(jié)在表3中。
表3MS-BN1的限制性圖譜
(*)這些片段的長(zhǎng)度為從質(zhì)粒pTHW107的限制性圖譜預(yù)測(cè)的長(zhǎng)度。4.1.2.RF-BN1用不同的限制性酶消化RF-BN1基因組DNA后得到的限制性酶切模式于圖3中給出，并總結(jié)在表4中。
表4RF-BN1的限制性圖譜
(*)這些片段的長(zhǎng)度為根據(jù)BamHI酶切pTHW118載體所得的限制性圖譜而預(yù)測(cè)的長(zhǎng)度。4.2.側(cè)翼區(qū)的鑒定首先鑒定已產(chǎn)生了原種事件MS-BN1和RF-BN1之春OSR中這些事件之側(cè)翼區(qū)，然后檢查WOSR。4.2.1.MS-BN1側(cè)翼區(qū)的鑒定4.2.1.1.右(5’)側(cè)翼區(qū)對(duì)MS-BN1右邊界側(cè)翼區(qū)序列，使用具延伸捕獲的(Trmanen等，1993，NAR205487-5488)由連接反應(yīng)介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)(Mueller等，1989，科學(xué)780-786；Maxine等，1994，PCR方法和應(yīng)用(PCR Methods andApplications)，71-75)。用作接頭制品的寡核苷酸為MDB248(SEQ ID No.3)5′CAT.GCC.CTG.ACC.CAG.GCT.AAG.TAT.TTT.AAC.TTT.AAC.CAC.TTT.GCT.CCG.ACA.GTC.CCA.TTGMDB249(SEQ ID No.4)5′CAA.TGG.GAC.TGT.CGG.AGG.ACT.GAG.GGC.CAA.AGC.TTG.GCT.CTT.AGC.CTG.GGT.CAG.GGC.ATG接頭制備后，用生物素化的基因特異引物，由經(jīng)NcoI消化的基因組MS-BN1 DNA合成第一鏈
然后將接頭連接至第一鏈DNA，再將接頭與磁珠偶聯(lián)，從其上洗脫非生物素化的鏈。用下列引物對(duì)該DNA進(jìn)行大規(guī)模PCR擴(kuò)增
該P(yáng)CR產(chǎn)生一條約1150bp的片段。從瓊脂糖凝膠洗脫該右邊界片段，用下列引物對(duì)該DNA的100倍稀釋物進(jìn)行巢式PCR
該反應(yīng)產(chǎn)生一條約1000bp的片段，從瓊脂糖凝膠洗脫該片段、純化，并連接至pGem-T載體。用下列引物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)來(lái)篩選重組質(zhì)粒DNA
上述反應(yīng)產(chǎn)生下列片段SP6-T71224bpSP6-MDB2011068bpT7-MDB2011044bp純化右邊界片段并測(cè)序(SEQ ID No.13)，得到963bp，其中的bp1-867對(duì)應(yīng)于植物DNA且bp868至953對(duì)應(yīng)于pTW107的T-DNA。4.2.1.2.MS-BN1的左(3’)側(cè)翼區(qū)在MS-BN1事件中插入的轉(zhuǎn)基因之側(cè)翼的左邊界區(qū)序列用Liu等(1995，植物雜志(The Plant Journal)8(3)457-463)所述的熱不對(duì)稱交錯(cuò)(TAIL-)PCR法測(cè)定。該方法采用三條巢式特異引物與一條短的任意簡(jiǎn)并(AD)引物連續(xù)反應(yīng)，從而可熱控制特異和非特異產(chǎn)物的相對(duì)擴(kuò)增效力。特異引物選擇為與轉(zhuǎn)基因的邊界退火，并基于它們的退火條件。在1％瓊脂糖凝膠上分析小量(5μl)來(lái)純化的第二次和第三次PCR產(chǎn)物。第三次PCR產(chǎn)物用于制備性擴(kuò)增，純化并用DyeDeoxy Terminator循環(huán)試劑盒在自動(dòng)測(cè)序儀上測(cè)序。所用引物如下
其中N＝A，C，T或g；S＝C或g；W＝A或T用HCA24-MDB611擴(kuò)增的片段大約540bp，其中的537bp已測(cè)序(3’側(cè)翼SEQ ID No18)。在bp1和bp180之間的序列包含pTHW107DNA，而bp181和bp537之間的序列對(duì)應(yīng)于植物DNA。4.2.1.3.靶位點(diǎn)缺失的鑒定用對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)基因側(cè)翼區(qū)的序列作為引物，以野生型歐洲油菜品種Drakkar作為模板，鑒定轉(zhuǎn)基因的插入位點(diǎn)。
所用引物如下
在5’側(cè)翼中的位置 在3’側(cè)翼中的位置序列(5’→3’)(SEQ ID No13) (SEQ ID No18)VDS51 TgA.CAC.TTT.gAg.CCA.CTC.g 733→751-----(SEQ ID No.19)HCA48 GgA.ggg.TgT.TTT.Tgg.TTA.TC ----- 189←208(SEQ ID No.20)反應(yīng)產(chǎn)生一條178bp片段(SEQ ID No21)，其中bp132至150對(duì)應(yīng)于靶位點(diǎn)的缺失。4.2.1.4.MS-BN1插入?yún)^(qū)的鑒定基于側(cè)翼區(qū)的鑒定及靶位點(diǎn)的缺失，可確定MS-BN1的插入?yún)^(qū)(SEQ IDNo22)1-8225’側(cè)翼區(qū)SEQ ID No13的bp46-867823-841靶位點(diǎn)缺失SEQ ID No21的bp132-150842-11983’側(cè)翼區(qū)SEQ ID No18的bp181至5374.2.2.RF-BN1側(cè)翼區(qū)的鑒定用Vectorette-PCR確定RF-BN1邊界側(cè)翼區(qū)(使用Vectorette和Subvectorette PCR以分離轉(zhuǎn)基因側(cè)翼DNA，Maxine J.Allen，Andrew Collick和Alec J.Jeffreys PCR方法和應(yīng)用-1994(4)，71-75頁(yè))，以經(jīng)過(guò)HindIII消化的RF-BN1基因組DNA作為模板。用上述的MDB248(SEQ ID No.3)引物和MDB249(SEQ ID No.4)引物制備Vectorette接頭。4.2.2.1.BN-RF1的右(5’)側(cè)翼區(qū)所用引物如下
反應(yīng)產(chǎn)生了一條1077bp片段(SEQ ID No.24)，其中bp1-881對(duì)應(yīng)于植物DNA，且bp882-1077對(duì)應(yīng)于pTW118的T-DNA。4.2.2.2.BN-RF1的左(3’)側(cè)翼區(qū)為鑒定原種事件BN-RF1的3’側(cè)翼區(qū)，如上所述進(jìn)行TAIL PCR，使用了一條任意簡(jiǎn)并引物和多條位于T-DNA中的左邊界附近的引物。
所用引物為任意簡(jiǎn)并引物MDB286 NTg.CgA.SWg.ANA.WgA.A(SEQ ID No.25)其中N＝A，C，T或g；S＝C或g；W＝A或T
T-DNA引物MDB314 gTA.ggA.ggT.Tgg.gAA.gAC.C(SEQ ID No.26)MDB315 ggg.CTT.TCT.ACT.AgA.AAg.CTC.TCg.g(SEQ IDNo.27)MDB316 CCg.ATA.ggg.AAg.TgA.TgT.Agg.Agg(SEQ ID No.28)得到了一條約2000bp片段。將該片段克隆入pGem-T載體，并用作使用以下引物的PCR反應(yīng)的模板植物DNA引物MDB288 ATg.CAg.CAA.gAA.gCT.Tgg.Agg SEQ ID No.29)T-DNA引物MDB314 gTA.ggA.ggT.Tgg.gAA.gAC.C(SEQ ID No.26)反應(yīng)產(chǎn)生一條約1500bp(SEQ ID No.30)的片段，其中bp1-166對(duì)應(yīng)于質(zhì)粒pTW118的T-DNA，且bp167-1441對(duì)應(yīng)于植物DNA。
4.2.2.3.靶位點(diǎn)缺失的分子分析用TAIL-PCR方法克隆靶位點(diǎn)缺失(見(jiàn)上述)，用T-DNA插入物上游的指向該插入物的野生型基因組DNA特異引物和植物DNA特異引物任意簡(jiǎn)并引物MDB286NTg.CgA.SWg.ANA.WgA.A(SEQ ID No.25)其中N＝A，C，T或g；S＝C或g；W＝A或T植物DNA引物MDB269ggTTTTCggAggTCCgAgACg (SEQ ID No.31)MDB283CTTggACCCCTAggTAAATgC(SEQ ID No.32)MDB284gTACAAAACTTggACCCCTAgg(SEQ ID No.33)得到了一條約1068bp(SEQ ID No.34)的片段，其中53-835’側(cè)翼區(qū)84-133靶位點(diǎn)缺失134-10553’側(cè)翼區(qū)通過(guò)插入T-DNA，51bp的靶位點(diǎn)被缺失。比較野生型基因瘤序列與Rf3基因瘤序列顯示在右邊界連接點(diǎn)存在填充DNA。在右邊界的該填充TCTCG序列的5′末端側(cè)翼為TCA，3′末端側(cè)翼為CGA。在靶位點(diǎn)缺失的斷點(diǎn)和T-DNA的斷點(diǎn)也分別發(fā)現(xiàn)存在這些三聯(lián)體。在親屬關(guān)系較遠(yuǎn)的植物序列中搜尋顯示了該填充DNA的可能起源。該TCA.TCTCG.CGA序列也位于植物DNA中靶位點(diǎn)缺失的3′末端。它是位于靶位點(diǎn)缺失的斷點(diǎn)下游209bp處兩個(gè)相同的13bp重復(fù)的核心序列。
RF-BN1插入?yún)^(qū)可被定義為包含如下的左側(cè)翼區(qū)、靶位點(diǎn)缺失和右側(cè)翼區(qū)1-8815’側(cè)翼區(qū)(SEQ ID No 24的bp1-881)882-932靶位點(diǎn)缺失(SEQ ID No.34的bp84-133)933-2207 3’側(cè)翼區(qū)(SEQ ID No.30的bp167-1441)4.3.基因瘤的遺傳分析對(duì)子代植物的多代進(jìn)行分子和表型分析，以檢查兩個(gè)事件插入的遺傳穩(wěn)定性。
T0，T1和T2代植物的Southern印跡分析比較事件MS-BN1和RF-BN1。對(duì)每個(gè)事件而言，所得到的模式在不同的代中是相同的。這表明該轉(zhuǎn)基因的分子構(gòu)型在含有MS-BN1和RF-BN1的植物中是穩(wěn)定的。
MS-BN1和RF-BN1事件顯示了，它們各自的轉(zhuǎn)基因在至少接下來(lái)的三代中作為單一的基因瘤的孟德?tīng)柗蛛x，表明插入是穩(wěn)定的。
基于上述結(jié)果，MS-BN1和MS-RF1被鑒定為原種事件。
4.4.鑒定WOSR中MS-BN1和RF-BN1的側(cè)翼序列用引物確定WOSR中原種事件MS-BN1和RF-BN1，其中所述引物是以春油料種子油菜中這些事件的側(cè)翼序列為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的。
用T-DNA引物(SEQ ID No.12)和位于MS-BN1右邊界植物DNA的引物確定MS-BN1 WOSR右(5’)側(cè)翼序列VDS575’gCA.TgA.TCT.gCT.Cgg.gAT.ggC-3’(SEQ ID No.35)反應(yīng)產(chǎn)生一條約909bp的片段(SEQ ID No.36)，其序列基本上與SEQID No.13序列類似(從第98位核苷酸開(kāi)始)。
用T-DNA引物(SEQ ID No.17)和位于MS-BN1左邊界植物DNA的引物確定MS-BN1 WOSR左(3’)側(cè)翼序列
HCA685’-CCA.TAT.Acg.CCA.gAg.Agg.AC-3’(SEQ ID No.37)反應(yīng)產(chǎn)生一條約522bp的片段(SEQ ID No.38)，其序列基本上與SEQID No.18序列類似。
用T-DNA引物(SEQ ID No.12)和位于RF-BN1右邊界植物DNA的引物(SEQ ID No.31)確定RF-BN1 WOSR右(3’)側(cè)翼序列。反應(yīng)產(chǎn)生一條約694 bp的片段(SEQ ID No.39)，其序列基本上與SEQ ID No.24序列類似(從第293至980位核苷酸)。
用T-DNA引物(SEQ ID No.26)和位于RF-BN1左邊界植物DNA的引物(SEQ ID No.29)確定RF-BN1 WOSR左側(cè)翼序列。反應(yīng)產(chǎn)生一條約1450bp的片段，其中的1279bp已測(cè)序(SEQ ID No.40)。該序列基本上與SEQ IDNo.30序列類似(從第141至1421位核苷酸)。
由此證實(shí)SOSR和WOSR中，原種事件MS-BN1和RF-BN1之左和右邊界序列基本上類似。
實(shí)施例5開(kāi)發(fā)用于鑒定對(duì)照的診斷工具開(kāi)發(fā)下列方法以鑒定任一包含原種事件MS-BN1的WOSR植物材料。
5.1.MS-BN1和RF-BN1原種事件限制性圖譜鑒定方法包含原種事件MS-BN1的WOSR植物可用與實(shí)施例4.1.中所述的基本相同步驟進(jìn)行Southern印跡鑒定。這樣WOSR基因組DNA，1)用下列限制性酶EcoRI，EcoRV，Ndel，Hpal，AflIII中的至少兩種，優(yōu)選地至少三種，尤其是用至少四種，更尤其是用所述的全部限制性酶消化，2)轉(zhuǎn)移至尼龍膜，以及3)與質(zhì)粒pTHW107的3942bp HindIII片段雜交。如果使用了至少兩種限制性酶，用與實(shí)施例4.1.1.表3中所列出的相同長(zhǎng)度的片段鑒定DNA片段，該WOSR植物可確定為擁有原種事件MS-BN1。
包含原種事件RF-BN1的WOSR植物可用與實(shí)施例4.1.中所述的基本相同步驟進(jìn)行Southern印跡鑒定。這樣WOSR基因組DNA，1)用下列限制性酶BamHI，EcoRI，EcoRV，HindIII中的至少兩種，優(yōu)選地至少三種，更優(yōu)選地用所述的全部限制性酶消化，2)轉(zhuǎn)移至尼龍膜，以及3)與質(zhì)粒pTHW118的2182bp HpaI片段雜交。如果使用了至少兩種限制性酶，用與實(shí)施例4.1.2.表4中所列出的相同長(zhǎng)度片段鑒定DNA片段，該WOSR植物可確定為擁有原種事件RF-BN1。
5.2.MS-BN1和RF-BN1原種事件聚合酶鏈反應(yīng)鑒定方法在嘗試篩選未知對(duì)象前，進(jìn)行具有所有適當(dāng)對(duì)照的試驗(yàn)。已有的方法可能需要優(yōu)化在不同的實(shí)驗(yàn)室間可能不同的組分(模板DNA制品，TaqDNA聚合酶，引物性質(zhì)，dNTP’s，熱循環(huán)儀等)。
內(nèi)源序列的擴(kuò)增在方法中起到關(guān)鍵作用。必須達(dá)到的PCR和熱循環(huán)條件為對(duì)已知的轉(zhuǎn)基因基因組DNA模板，可擴(kuò)增等摩爾量的內(nèi)源序列和轉(zhuǎn)基因序列。在同樣的溴化乙錠染色強(qiáng)度下用瓊脂糖凝膠電泳判斷時(shí)，當(dāng)目標(biāo)內(nèi)源片段未被擴(kuò)增或目標(biāo)序列未被擴(kuò)增時(shí)，需要優(yōu)化PCR條件。
5.2.1.模板DNA按照Edwards等，(核酸研究，19，1349頁(yè)，1991)用葉鉆孔器或單種子制備模板DNA。當(dāng)所用的DNA是用其它方法制備而得時(shí)，需要用不同量的模板進(jìn)行試驗(yàn)。通常50ng基因組模板DNA可產(chǎn)生最佳結(jié)果。
5.2.2.指定陽(yáng)性和陰性對(duì)照在PCR運(yùn)行中應(yīng)包括以下陽(yáng)性和陰性對(duì)照-基本的混合物對(duì)照(DNA陰性對(duì)照)。此為反應(yīng)中未加入DNA的PCR。當(dāng)觀察到預(yù)期結(jié)果即無(wú)PCR產(chǎn)物時(shí)，表明該P(yáng)CR混合物未污染靶DNA。
-DNA陽(yáng)性對(duì)照(已知含有轉(zhuǎn)基因序列的基因組DNA樣本)。該陽(yáng)性對(duì)照的成功擴(kuò)增表明PCR是在允許靶序列擴(kuò)增的條件下運(yùn)行的。
-野生型DNA對(duì)照。此為PCR反應(yīng)中所提供的模板DNA為制備自非轉(zhuǎn)基因植物制備的基因組DNA的PCR。當(dāng)觀察到預(yù)期結(jié)果，即轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物未被擴(kuò)增而內(nèi)源PCR產(chǎn)物被擴(kuò)增時(shí)，表明在基因組DNA樣本中無(wú)可檢測(cè)到的轉(zhuǎn)基因背景擴(kuò)增。
5.2.3.引物使用下列特異識(shí)別轉(zhuǎn)基因和MS-BN1側(cè)翼序列的引物BNA015’-gCT.Tgg.ACT.ATA.ATA.CCT.gAC-3’(SEQ ID 12)
(MDB201)(靶轉(zhuǎn)基因)BNA025’-TgA.CAC.TTT.gAg.CCA.CTC.g-3’(SEQ ID 19)(VDS51)(靶植物DNA)為鑒定包含RF-BN1的植物材料，使用下列特異識(shí)別轉(zhuǎn)基因和RF-BN1側(cè)翼序列的引物BNA035’-TCA.TCT.ACg.gCA.ATg.TAC.CAg-3’(SEQ ID 23)(MDB193)(靶轉(zhuǎn)基因)BNA045’-Tgg.ACC.CCT.Agg.TAA.ATg.CC-3’(SEQ ID 41)(MDB268)(靶植物DNA)靶向內(nèi)源序列的引物總是包含在PCR混合物中。這些引物可用作未知樣本以及DNA陽(yáng)性對(duì)照中的內(nèi)部對(duì)照。內(nèi)源引物對(duì)的陽(yáng)性結(jié)果表明在基因組DNA制品中有質(zhì)量足夠好的樣本DNA，以產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。所用的內(nèi)源引物為BNA055’-AAC.gAg.TgT.CAg.CTA.gAC.CAg.C-3’(SEQ ID42)BNA065’-CgC.AgT.TCT.gTg.AAC.ATC.gAC.C-3’(SEQ ID 43)5.2.4.擴(kuò)增片段PCR反應(yīng)中預(yù)期的擴(kuò)增片段為引物對(duì)BNA05-BNA06394bp(內(nèi)源對(duì)照)引物對(duì)BNA01-BNA02280bp(MS-BN1原種事件)引物對(duì)BNA03-BNA04215bp(RF-BN1原種事件)5.2.5.PCR條件50μl反應(yīng)體系的PCR混合物包含5μl模板DNA5μl10x擴(kuò)增緩沖液(與Taq聚合酶同時(shí)提供)1μl 10mM dNTP’s1μl BNA01(MS-BN1)或BNA03(RF-BN1)(10pmoles/μl)1μl BNA02(RF-BN1)或BNA04(RF-BN1)(10pmoles/μl)
0.5μl BNA05(10pmoles/μl)0.5μl BNA06(10pmoles/μl)0.2μl Taq DNA聚合酶(5個(gè)單位/tl)加水至50μl為得到最佳結(jié)果，應(yīng)遵循下列熱循環(huán)參數(shù)95℃4分鐘然后95℃1分鐘57℃1分鐘72℃2分鐘進(jìn)行5個(gè)循環(huán)然后92℃30秒57℃30秒72℃1分鐘進(jìn)行22至25個(gè)循環(huán)然后72℃5分鐘5.2.6.瓊脂糖凝膠分析將10至20μl的PCR樣本及合適的分子量標(biāo)志物(例如100bp梯度PHARMACIA)上樣于1.5％瓊脂糖凝膠(Tris-硼酸鹽緩沖液)。
5.2.7.結(jié)果驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植物DNA樣本的單一PCR循環(huán)和單一PCR混合物的數(shù)據(jù)不可采用，除非1)DNA陽(yáng)性對(duì)照顯示預(yù)期的PCR產(chǎn)物(轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源片段)，2)PCR擴(kuò)增的DNA陰性對(duì)照為陰性(沒(méi)有片段)以及3)野生型DNA對(duì)照顯示預(yù)期結(jié)果(內(nèi)源片段擴(kuò)增)。
顯示可見(jiàn)量的如預(yù)期大小的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源PCR產(chǎn)物的泳道表明其對(duì)應(yīng)的植物(由其制備的基因組模板DNA)已遺傳了MS-BN1和/或RF-BN1原種事件。未顯示可見(jiàn)量的轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物之一且顯示可見(jiàn)量的內(nèi)源PCR產(chǎn)物的泳道表明其對(duì)應(yīng)的植物(由其制備的基因組模板DNA)不包含原種事件。未顯示可見(jiàn)量的內(nèi)源和轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物的泳道表明基因組DNA的質(zhì)和/或量不能產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。這些植物不予以評(píng)價(jià)。應(yīng)重復(fù)基因組DNA的制備，且必須進(jìn)行具備合適對(duì)照的新一輪PCR循環(huán)。
5.2.8.使用識(shí)別PCR法鑒定MS-BN1和RF-BN1按照上述方法對(duì)來(lái)自包含MS-BN1，RF-BN1或另一轉(zhuǎn)基因事件之植物的WOSR葉材料進(jìn)行試驗(yàn)。來(lái)自WOSR野生型的樣本用作陰性對(duì)照。
PCR分析結(jié)果于圖4和5中闡述。
圖4闡述了用原種事件PCR鑒定法對(duì)兩種WOSR樣本中MS-BN1的鑒定結(jié)果(泳道1和2)。認(rèn)為泳道1包含原種事件，因?yàn)闄z測(cè)到了280bp的條帶，而泳道2的樣本不包含MS-BN1。
圖5闡述了用原種事件PCR鑒定法對(duì)兩種WOSR樣本中RF-BN1的鑒定結(jié)果(泳道1和2)。認(rèn)為泳道1包含原種事件，因?yàn)闄z測(cè)到了215bp的條帶，而泳道2的樣本不包含RF-BN1。
實(shí)施例6用在WOSR中的MS-BN1和RF-BN1產(chǎn)生雜交種子將包含MS-BN1的雄性不育WOSR植物與RF-BN1純合的WOSR植物雜交。收集來(lái)自MS-BN1的雜交種子，并保藏在ATCC，其ATCC保藏號(hào)為PTA-730。
將該雜交種子種植在田地中。發(fā)現(xiàn)植物100％可育，且顯示最佳農(nóng)學(xué)特性。雜交植物或包含MS-BN1和RF-BN1兩者，或只包含RF-BN1事件。
實(shí)施例7將MS-BN1和RF-BN1導(dǎo)入優(yōu)選的WOSR栽培品種通過(guò)將包含事件MS-BN1或RF-BN1的植物反復(fù)回交，分別將原種事件MS-BN1和RF-BN1導(dǎo)入許多農(nóng)業(yè)上重要的WOSR栽培品種。
觀察到原種事件基因摻入這些栽培品種未顯著影響后者任一想要的表型或農(nóng)學(xué)特性(非連鎖妨礙)，而通過(guò)草銨膦耐受性測(cè)定，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)滿足商業(yè)可接受水平。這證實(shí)事件MS-BN1和RF-BN1作為原種事件的地位。
除非另外明確指出，在下列權(quán)利要求中所用的術(shù)語(yǔ)“植物”包含在任一成熟階段的植物組織，以及取自或衍生于此類植物的任一細(xì)胞、組織或器官，沒(méi)有限制地包括任一種子、葉、莖、花、根、單細(xì)胞、配子、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或原生質(zhì)體。
包含原種事件MS-BN1和原種事件RF-BN1的種子或只包含原種事件RF-BN1保藏在美國(guó)組織培養(yǎng)物保藏中心(American Tissue CultureCollection)，保藏號(hào)為PTA-730。
序列表序列表<110>阿溫提斯作物科學(xué)公司<120>雜交冬油料種子油菜及其生產(chǎn)方法<130>EE-BN1<140><141><160>43<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>4946<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述質(zhì)粒pTHW107的T-DNA<220><221>misc_特征<222>(964)..(4906)<223>Hind III片段<400>1aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga actcggccgt cgagtacatg 60gtcgataaga aaaggcaatt tgtagatgtt aattcccatc ttgaaagaaa tatagtttaa 120atatttattg ataaaataac aagtcaggta ttatagtcca agcaaaaaca taaatttatt 180gatgcaagtt taaattcaga aatatttcaa taactgatta tatcagctgg tacattgccg 240tagatgaaag actgagtgcg atattatgtg taatacataa attgatgata tagctagctt 300agctcatcgg gggatcctag acgcgtgaga tcagatctcg gtgacgggca ggaccggacg 360gggcggtacc ggcaggctga agtccagctg ccagaaaccc acgtcatgcc agttcccgtg 420cttgaagccg gccgcccgca gcatgccgcg gggggcatat ccgagcgcct cgtgcatgcg 480cacgctcggg tcgttgggca gcccgatgac agcgaccacg ctcttgaagc cctgtgcctc 540cagggacttc agcaggtggg tgtagagcgt ggagcccagt cccgtccgct ggtggcgggg 600ggagacgtac acggtcgact cggccgtcca gtcgtaggcg ttgcgtgcct tccaggggcc 660cgcgtaggcg 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3300tgtactgtta cacttgcacc acaagggcat atatagagca caagacatac acaacaactt 3360gcaaaactaa cttttgttgg agcatttcga ggaaaatggg gagtagcagg ctaatctgag 3420ggtaacatta aggtttcatg tattaatttg ttgcaaacat ggacttagtg tgaggaaaaa 3480gtaccaaaat tttgtctcac cctgatttca gttatggaaa ttacattatg aagctgtgct 3540agagaagatg tttattctag tccagccacc caccttatgc aagtctgctt ttagcttgat 3600tcaaaaactg atttaattta cattgctaaa tgtgcatact tcgagcctat gtcgctttaa 3660ttcgagtagg atgtatatat tagtacataa aaaatcatgt ttgaatcatc tttcataaag 3720tgacaagtca attgtccctt cttgtttggc actatattca atctgttaat gcaaattatc 3780cagttatact tagctagata tccaattttg aataaaaata gctcttgatt agtaaaccgg 3840atagtgacaa agtcacatat ccatcaaact tctggtgctc gtggctaagt tctgatcgac 3900atggggttaa aatttaaatt gggacacata aatagcctat ttgtgcaaat ctccccatcg 3960aaaatgacag attgttacat ggaaaacaaa aagtcctctg atagaagtcg caaagtatca 4020caattttcta tcgagagata gattgaaaga agtgcaggga agcggttaac tggaacataa 4080cacaatgtct aaattaattg cattcgctaa ccaaaaagtg tattactctc tccggtccac 4140aataagttat 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tatagccggc tatttgtgta 120aaaatcccta atataatcga cggatccccg ggaattccgg gggaagctta gatccatgga 180tttgttatga taaccaaaaa caccctcctt tttattataa aggtagggat agctaatctg 240ttattcggtt ttgattagag atattaatcc cgttttatca agtacagttt gatgtatttt 300tttgttcgtt ttcattacaa tccaagacaa gttaggttta ttacatttta ccaaaaaaaa 360aggtttggtt tattgtgaac attgctgcgg ttttatttaa atttgattct attcaaaggt 420caatccgtat ttaacaagta aactagtctt tatataatct taaatctaac gatacttgga 480tttttaaatt gcatttagct atgtcctctc tggcgtatat gg522<210>39<211>694<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含WOSR RF-BN15’側(cè)翼區(qū)的序列<400>39ggttttcgga ggtccgagac gagttcaaaa atacatttta cataatatat ttttcatata 60tatatatata tataacattc aaaagtttga attattacat aaacgttttc taaattttct 120tcaccaaaat tttataaact aaaattttta aatcatgaac aaaaagtatg aatttgtaat 180ataaatacaa agatacaaat ttttgattga aatattggta gctgtcaaaa aagtaaatct 240tagaatttaa attaactata gtaaactata tattgaaaat attataaatt tttatcaaat 300tctcataaat atataaaata aatctaactc atagcatata aaaagaagac taatgtggat 360caaaatattt 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atacaaattt 480ttgattgaaa tattggtagc tgtcaaaaaa gtaaatctta gaatttaaat taactatagt 540aaactatata ttgaaaatat tataaatttt tatcaaattc tcataaatat ataaaataaa 600tctaactcat agcatataaa aagaagacta atgtggatca aaatatttac agttttttag 660aagtagaatc tttatagttt tatttaaaat atagcaaaaa tgatcacaaa cctagttact 720ttaaccagaa gtccaattca aaatcaaata aaaataaaaa tctatctaaa aaaatatgtt 780aactaccatg caaaagtatt tttttttgta attagaaacc ctgaaatttg tacaaaactt 840ggacccctag gtaaattccc tagaaagtat cctattagcg tcgacaaact gttgctcata 900tttttctctc cttactttat atcatacact aatataaaaa gatgatctaa ttaattattc 960atttccatgc tagctaattc aagaaaaaga aaaaaaactt attatctaaa cttatattcg 1020agcaacacct cggagataac aggatatatg tcattaatga atgcttgaac tcatctcgcg 1080aactcatctc gcatcgctta tagccacaaa gatccaaccc ctctcttcaa tcatatatca 1140gtagtacaat acaaatagat attgtgagca catatgccgt ctagtactga tgtgtatatg 1200tagaggagcc gcaaatgttt agtcactcca acaaatgagc atgaccacgc atcttctgat 1260gatgtacagc cgtcccttt 1279<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物268(BNA04)<400>41tggaccccta ggtaaatgcc 20<210>42<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物BNA05<400>42aacgagtgtc agctagacca gc22<210>43<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物BNA06<400>43cgcagttctg tgaacatcga cc2權(quán)利要求
1.WOSR植物或其種子、植物細(xì)胞或組織，其特征在于該WOSR植物或其種子、植物細(xì)胞或組織之基因組DNA可產(chǎn)生選自以下限制性片段組中的至少兩組i)BamHI片段組，其中一條長(zhǎng)度在805和1099bp之間，優(yōu)選地約為814bp，一條長(zhǎng)度在1700和1986bp之間，一條長(zhǎng)度在2450和2838bp之間，且一條長(zhǎng)度在5077和14057bp之間；ii)EcoRI片段組，其中一條片段在805和1159bp之間，一條長(zhǎng)度在1986和2450bp之間，以及兩條長(zhǎng)度在5077和14057bp之間；iii)EcoRV片段組，其中兩者長(zhǎng)度均在5077和14057bp之間；iV)HindIII片段組，其中一條片段的長(zhǎng)度在1700和2140bp之間，且兩條長(zhǎng)度在2450和2838bp之間；其中每一條限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊條件下可與包含PTA29-芽孢桿菌RNA酶抑制劑序列的2182bp長(zhǎng)的片段雜交，其中所述2182bp長(zhǎng)的片段可通過(guò)對(duì)質(zhì)粒pTHW118用HpaI消化而獲得。
2.權(quán)利要求1的植物、種子、植物細(xì)胞或組織，其特征在于所述植物、種子、植物細(xì)胞或組織的基因組DNA可產(chǎn)生選自所述限制性片段組中的至少三組。
3.權(quán)利要求2的植物、種子、植物細(xì)胞或組織，其特征在于所述植物、種子、植物細(xì)胞或組織的基因組DNA可產(chǎn)生選自所述限制性片段組中的至少四組。
4.權(quán)利要求3的植物、種子、植物細(xì)胞或組織，其特征在于所述植物、種子、植物細(xì)胞或組織的基因組DNA可產(chǎn)生選自所述限制性片段組中的全部五組。
5.權(quán)利要求1的植物、種子、植物細(xì)胞或組織，其特征在于可使用基因組DNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增長(zhǎng)度在195和235bp之間的DNA片段，兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No23和SEQ ID No41。
6.權(quán)利要求5的植物、種子、植物細(xì)胞或組織，其特征在于可使用基因組DNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增長(zhǎng)度為215bp的DNA片段，兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No23和SEQ ID No41。
7.權(quán)利要求1的植物、種子、植物細(xì)胞或組織，其進(jìn)一步的特征在于所述植物、種子、植物細(xì)胞或組織的基因組DNA可產(chǎn)生選自以下限制性片段組中的至少三組i)EcoRI片段組，其中一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2266bp，且一條的長(zhǎng)度大于14kbp；ii)EcoRV片段組，其中一條的長(zhǎng)度在1159和1700bp之間，優(yōu)選地約1.4kbp，且另一條的長(zhǎng)度大于14kbp；iii)Hpal片段組，其中一條的長(zhǎng)度在1986和2140bp之間，優(yōu)選地長(zhǎng)度約1990bp，且一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2229bp；iv)AflIII片段組，其中一條的長(zhǎng)度在514和805bp之間，優(yōu)選地長(zhǎng)度約522bp，且一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2250bp，且一條的長(zhǎng)度在2450和2838bp之間，優(yōu)選地約2477bp；v)NdeI片段組，兩者的長(zhǎng)度均在5077和14057bp之間，優(yōu)選地一條約為6500bp，且另一條約為10kbp；其中每一條限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊條件下可與包含PTA29-芽孢桿菌RNA酶序列的3942bp長(zhǎng)的片段雜交，其中所述3942bp長(zhǎng)的片段可通過(guò)對(duì)質(zhì)粒pTHW107用HindIII消化而獲得。
8.權(quán)利要求7的植物、種子、植物細(xì)胞或組織，其特征在于所述植物、種子、植物細(xì)胞或組織的基因組DNA可產(chǎn)生選自所述限制性片段組中的至少三組。
9.權(quán)利要求8的植物、種子、植物細(xì)胞或組織，其特征在于所述植物、種子、植物細(xì)胞或組織的基因組DNA可產(chǎn)生選自所述限制性片段組中的至少四組。
10.權(quán)利要求9的植物、種子、植物細(xì)胞或組織，其特征在于所述植物、種子、植物細(xì)胞或組織的基因組DNA可產(chǎn)生選自所述限制性片段組中的全部五組。
11.權(quán)利要求7的植物、種子、植物細(xì)胞或組織，其進(jìn)一步的特征在于可使用基因組DNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增長(zhǎng)度在260和300bp之間的DNA片段，兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No12和SEQ ID No19。
12.權(quán)利要求1的植物、植物細(xì)胞或組織，其可從保藏在ATCC，保藏號(hào)為PTA-730的種子獲得。
13.權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)的植物、種子、植物細(xì)胞或組織，其為雜交植物、種子，或?yàn)殡s交植物細(xì)胞或組織。
14.保藏在ATCC，保藏號(hào)為PTA-730的種子。
15.WOSR植物或其種子、植物細(xì)胞或組織，其特征在于a)WOSR植物或其種子、植物細(xì)胞或組織的基因組DNA可產(chǎn)生選自以下限制性片段組中的至少兩組i)BamHI片段組，其中一條長(zhǎng)度在805和1099bp之間，優(yōu)選地約為814bp，一條長(zhǎng)度在1700和1986bp之間，一條長(zhǎng)度在2450和2838bp之間，且一條長(zhǎng)度在5077和14057bp之間；ii)EcoRI片段組，其中一條片段在805和1159bp之間，一條長(zhǎng)度在1986和2450bp之間，以及兩條長(zhǎng)度在5077和14057bp之間；iii)EcoRV片段組，其中兩者長(zhǎng)度均在5077和14057bp之間；iv)HindIII片段組，其中一條片段的長(zhǎng)度在1700和2140bp之間，且兩條長(zhǎng)度在2450和2838bp之間；其中每一條限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊條件下可與包含PTA29-芽孢桿菌RNA酶抑制劑序列的2182bp長(zhǎng)的片段雜交，其中所述2182bp長(zhǎng)的片段可通過(guò)對(duì)質(zhì)粒pTHW118用HpaI消化而獲得；和/或b)可使用基因組DNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度在195和235bp之間的DNA片段，兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No23和SEQID No41。
16.權(quán)利要求15的植物、細(xì)胞組織或種子，其特征在于可使用基因組DNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出215bp的DNA片段，兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No23和SEQ ID No41。
17.權(quán)利要求15的植物、種子、植物細(xì)胞或組織，其特征在于所述植物、種子、植物細(xì)胞或組織的基因組DNA可產(chǎn)生選自所述限制性片段組中的至少三組。
18.權(quán)利要求17的植物、種子、植物細(xì)胞或組織，其特征在于所述植物、種子、植物細(xì)胞或組織的基因組DNA可產(chǎn)生選自所述限制性片段組中的至少四組。
19.權(quán)利要求18的植物、種子、植物細(xì)胞或組織，其特征在于該植物、種子、植物細(xì)胞或組織的基因組DNA可產(chǎn)生選自所述限制性片段組中的全部五組。
20.WOSR植物或其種子、植物細(xì)胞或組織，其特征在于a)該植物、細(xì)胞、組織或種子的基因組DNA可產(chǎn)生選自以下限制性片段組中的至少三組i)EcoRI片段組，其中一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2266bp，且一條的長(zhǎng)度大于14kbp；ii)EcoRV片段組，其中一條的長(zhǎng)度在1159和1700bp之間，優(yōu)選地約1.4kbp，且另一條的長(zhǎng)度大于14kbp；iii)Hpal片段組，其中一條的長(zhǎng)度在1986和2140bp之間，優(yōu)選地長(zhǎng)度約1990bp，且一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2229bp；iV)AflIII片段組，其中一條的長(zhǎng)度在514和805bp之間，優(yōu)選地長(zhǎng)度約522bp，且一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2250bp，且一條的長(zhǎng)度在2450和2838bp之間，優(yōu)選地約2477bp；V)NdeI片段組，兩者的長(zhǎng)度均在5077和14057bp之間，優(yōu)選地一條約為6500bp，且另一條約為10kbp；其中每一條限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊條件下可與包含PTA29-芽孢桿菌RNA酶序列的3942bp長(zhǎng)的片段雜交，其中所述3942bp長(zhǎng)的片段可通過(guò)對(duì)質(zhì)粒pTHW107用HindIII消化獲得；和/或b)可使用基因組DNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度在260和300bp之間的DNA片段，兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No12和SEQID No19。
21.權(quán)利要求20的植物、細(xì)胞組織或種子，其特征在于可使用基因組DNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增長(zhǎng)度在260和300bp之間的DNA片段，兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No12和SEQ ID No19。
22.權(quán)利要求20的植物、種子、植物細(xì)胞或組織，其特征在于所述植物、種子、植物細(xì)胞或組織的基因組DNA可產(chǎn)生選自所述限制性片段組中的至少三組。
23.權(quán)利要求22的植物、種子、植物細(xì)胞或組織，其特征在于所述植物、種子、植物細(xì)胞或組織的基因組DNA可產(chǎn)生選自所述限制性片段組中的至少四組。
24.權(quán)利要求23的植物、種子、植物細(xì)胞或組織，其特征在于所述植物、種子、植物細(xì)胞或組織的基因組DNA可產(chǎn)生選自所述限制性片段組中的全部五組。
25.產(chǎn)生雜交種子的方法，該方法包括a)將轉(zhuǎn)基因、雄性不育的WOSR植物與育性恢復(fù)WOSR植物雜交，其中所述轉(zhuǎn)基因、雄性不育的WOSR植物具有下列一個(gè)或兩個(gè)特征1) WOSR植物或其種子、植物細(xì)胞或組織的基因組DNA可產(chǎn)生選自以下限制性片段組中的至少兩組i)EcoRI片段組，其中一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2266bp，且一條的長(zhǎng)度大于14kbp；ii)EcoRV片段組，其中一條的長(zhǎng)度在1159和1700bp之間，優(yōu)選地約1.4kbp，且另一條的長(zhǎng)度大于14kbp；iii)Hpal片段組，其中一條的長(zhǎng)度在1986和2140bp之間，優(yōu)選地長(zhǎng)度約1990bp，且一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2229bp；iv)AflIII片段組，其中一條的長(zhǎng)度在514和805bp之間，優(yōu)選地長(zhǎng)度約522bp，且一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2250bp，且一條的長(zhǎng)度在2450和2838bp之間，優(yōu)選地約2477bp；v)NdeI片段組，兩者的長(zhǎng)度均在5077和14057bp之間，優(yōu)選地一條約為6500bp，且另一條約為10kbp；其中每一條限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊條件下可與包含PTA29-芽孢桿菌RNA酶序列的3942bp長(zhǎng)的片段雜交，其中所述3942bp長(zhǎng)的片段可通過(guò)對(duì)質(zhì)粒pTHW107用HindIII消化獲得；和/或2)可使用基因組DNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度在260和300bp之間的DNA片段，兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No12和SEQID No19；其中所述育性恢復(fù)WOSR植物包含穩(wěn)定整合入其基因組的育性恢復(fù)基因，其中育性恢復(fù)基因包含-編碼核糖核酸酶抑制劑的DNA-組成型啟動(dòng)子；其中所述DNA在同一轉(zhuǎn)錄單位中且在所述組成型啟動(dòng)子的控制下。b)從所述雄性不育WOSR植物收獲該雜交種子。
26.權(quán)利要求25的方法，其中該育性恢復(fù)植物具有下列一個(gè)或兩個(gè)特征1)WOSR植物或其種子、植物細(xì)胞或組織的基因組DNA可產(chǎn)生選自以下限制性片段組中的至少兩組i)BamHI片段組，其中一條長(zhǎng)度在805和1099bp之間，優(yōu)選地約為814bp，一條長(zhǎng)度在1700和1986bp之間，一條長(zhǎng)度在2450和2838bp之間，且一條長(zhǎng)度在5077和14057bp之間；ii)EcoRI片段組，其中一條片段在805和1159bp之間，一條長(zhǎng)度在1986和2450bp之間，以及兩條長(zhǎng)度在5077和14057bp之間；iii)EcoRV片段組，其中兩者長(zhǎng)度均在5077和14057bp之間；iv)HindIII片段組，其中一條片段的長(zhǎng)度在1700和2140bp之間，且兩條長(zhǎng)度在2450和2838bp之間；其中每一條限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊條件下可與包含PTA29-芽孢桿菌RNA酶抑制劑序列的2182bp長(zhǎng)的片段雜交，其中所述2182bp長(zhǎng)的片段可通過(guò)對(duì)質(zhì)粒pTHW118用HpaI消化獲得；和/或2)可使用基因組DNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度在195和235bp之間的DNA片段，兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No23和SEQID No41。
27.WOSR雜交種子，其可根據(jù)權(quán)利要求25或26的方法獲得。
28.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因WOSR植物細(xì)胞或植物的方法，其包括將重組DNA分子插入WOSR細(xì)胞的部分染色體DNA中并由轉(zhuǎn)化的WOSR細(xì)胞再生WOSR植物，其中所述重組DNA分子的特征在于它基本上類似于SEQ IDNo22的序列。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述重組DNA分子為雄性不育基因，且所述再生植物為雄性不育。
30.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因WOSR植物細(xì)胞或植物的方法，其包括將重組DNA分子插入WOSR細(xì)胞的部分染色體DNA中并由轉(zhuǎn)化的WOSR細(xì)胞再生WOSR植物，其中所述重組DNA分子的特征在于它基本上類似于SEQ IDNo34的序列。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述重組DNA分子為育性恢復(fù)基因，所述再生植物為育性恢復(fù)植物，當(dāng)與雄性不育植物雜交時(shí)，可產(chǎn)生雄性不育子代。
32.轉(zhuǎn)基因WOSR植物細(xì)胞或植物，其可通過(guò)權(quán)利要求28至31中任意一項(xiàng)的方法獲得。
33.鑒定包含原種事件MS-BN1的轉(zhuǎn)基因植物、或其細(xì)胞或組織的方法，方法包含建立該轉(zhuǎn)基因植物、或其細(xì)胞或組織的基因組DNA的下列一個(gè)或兩個(gè)特征a)該植物、細(xì)胞、組織或種子的基因組DNA可產(chǎn)生選自下列限制性片段組中的至少三組或多對(duì)限制性片段i)EcoRI片段組，其中一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2266bp，且一條的長(zhǎng)度大于14kbp；ii)EcoRV片段組，其中一條的長(zhǎng)度在1159和1700bp之間，優(yōu)選地約1.4kbp，且另一條的長(zhǎng)度大于14kbp；iii)Hpal片段組，其中一條的長(zhǎng)度在1986和2140bp之間，優(yōu)選地長(zhǎng)度約1990bp，且一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2229bp；iv)AflIII片段組，其中一條的長(zhǎng)度在514和805bp之間，優(yōu)選地長(zhǎng)度約522bp，且一條的長(zhǎng)度在2140和2450bp之間，優(yōu)選地約2250bp，且一條的長(zhǎng)度在2450和2838bp之間，優(yōu)選地約2477bp；v)NdeI片段組，兩者的長(zhǎng)度均在5077和14057bp之間，優(yōu)選地一條約為6500bp，且另一條約為10kbp；其中每一條限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊條件下可與包含PTA29-芽孢桿菌RNA酶序列的3942bp長(zhǎng)的片段雜交，其中所述3942bp長(zhǎng)的片段可通過(guò)對(duì)質(zhì)粒pTHW107用HindIII消化獲得；和/或b)可使用基因組DNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度在260和300bp之間的DNA片段，兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No12和SEQID No19。
34.權(quán)利要求33的方法，其包括確定是否可使用轉(zhuǎn)基因植物、或其細(xì)胞或組織之基因組DNA，經(jīng)用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度在260和300bp之間的DNA片段，所用的兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No12和SEQ ID No19。
35.鑒定包含MS-BN1原種事件的轉(zhuǎn)基因植物、其細(xì)胞或組織的試劑盒，所述試劑盒包含用于PCR鑒定方法的PCR探針，其中一條PCR探針識(shí)別轉(zhuǎn)基因中的序列，另一條PCR探針識(shí)別MS-BN13’側(cè)翼區(qū)的SEQID No.13或5’側(cè)翼序列SEQ ID No.18內(nèi)的植物DNA序列。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的試劑盒，用于鑒定包含MS-BN1原種事件的轉(zhuǎn)基因植物、其細(xì)胞或組織，所述試劑盒包含分別具有SEQ ID No.12和SEQID No.19之核苷酸序列的PCR探針。
37.鑒定包含原種事件RF-BN1的轉(zhuǎn)基因植物、其細(xì)胞或組織的方法，方法包括建立該轉(zhuǎn)基因植物、或其細(xì)胞或組織的基因組DNA的下列一個(gè)或兩個(gè)特征1)該WOSR植物或其種子、植物細(xì)胞或組織的基因組DNA可產(chǎn)生選自下列限制性片段組中的至少兩組i)BamHI片段組，其中一條長(zhǎng)度在805和1099bp之間，優(yōu)選地約為814bp，一條長(zhǎng)度在1700和1986bp之間，一條長(zhǎng)度在2450和2838bp之間，且一條長(zhǎng)度在5077和14057bp之間；ii)EcoRI片段組，其中一條片段在805和1159bp之間，一條長(zhǎng)度在1986和2450bp之間，以及兩條長(zhǎng)度在5077和14057bp之間；iii)EcoRV片段組，其中兩者長(zhǎng)度均在5077和14057bp之間；iV)HindIII片段組，其中一條片段的長(zhǎng)度在1700和2140bp之間，且兩條長(zhǎng)度在2450和2838bp之間；其中每一條限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊條件下可與包含PTA29-芽孢桿菌RNA酶抑制劑序列的2182bp長(zhǎng)的片段雜交，其中所述2182bp長(zhǎng)的片段可通過(guò)對(duì)質(zhì)粒pTHW118用HpaI消化獲得；和/或2)可使用基因組DNA，經(jīng)聚合酶反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度在195和235bp之間的DNA片段，兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No23和SEQ IDNo41。
38.權(quán)利要求37的方法，其包括確定是否可使用轉(zhuǎn)基因植物、或其細(xì)胞或組織之基因組DNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度在195和235bp之間的DNA片段，所用的兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No23和SEQ ID No41。
39.鑒定包含RF-BN1原種事件的轉(zhuǎn)基因植物、其細(xì)胞或組織的試劑盒，所述試劑盒包含用于PCR鑒定方法的PCR探針，其中一條PCR探針識(shí)別轉(zhuǎn)基因中的序列，另一條PCR探針識(shí)別RF-BN13’側(cè)翼區(qū)的SEQ IDNo.24或5’側(cè)翼序列SEQ ID No.30內(nèi)的植物DNA序列。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的試劑盒，用于鑒定包含RF-BN1原種事件的轉(zhuǎn)基因植物、其細(xì)胞或組織，所述試劑盒包含分別具有SEQ ID No.23和SEQID No.41之核苷酸序列PCR探針。
41.鑒定生物樣本中原種事件MS-BN1的試劑盒，所述試劑盒包含至少一條PCR引物或探針，其識(shí)別的序列位于MS-BN1的3’或5’側(cè)翼區(qū)。
42.權(quán)利要求41的試劑盒，其中所述至少一條PCR引物識(shí)別的序列為SEQ ID No.13中的植物DNA。
43.權(quán)利要求42的試劑盒，其中所述識(shí)別SEQ ID No.13中的植物DNA序列的引物包含序列SEQ ID No.19。
44.權(quán)利要求41至43中任意一項(xiàng)的試劑盒，其進(jìn)一步包含至少第二條PCR引物或探針，其識(shí)別的序列位于MS-BN2的外源DNA中。
45.權(quán)利要求44的試劑盒，其中所述識(shí)別MS-BN1的外源DNA序列的引物包含序列SEQ ID No.12。
46.用于MS-BN1PCR鑒定方法的引物，其具有這樣的序列在優(yōu)化的PCR條件下，特異性識(shí)別位于MS-BN15’或3’側(cè)翼區(qū)的序列。
47.權(quán)利要求46的引物，其具有的序列與植物DNA SEQ ID No.13或SEQ ID No.18或其互補(bǔ)序列至少具有80％的序列同一性。
48.權(quán)利要求47的引物，其包含SEQ ID No.19的序列。
49.包含序列SEQ ID No.12的引物。
50.證實(shí)種子純度的方法，該方法包含用特異引物或探針檢測(cè)種子樣本中的MS-BN1特異性DNA序列，其中所述特異引物或探針可特異識(shí)別MS-BN15’或3’側(cè)翼區(qū)。
51.篩選種子中MS-BN1的存在的方法，該方法包含用特異引物或探針檢測(cè)種子批次樣本中的MS-BN1特異性DNA序列，其中所述特異引物或探針可特異識(shí)別MS-BN15’或3’側(cè)翼區(qū)。
52.鑒定生物樣本中原種事件RF-BN1的試劑盒，所述試劑盒包含至少一條PCR引物或探針，其識(shí)別的序列位于RF-BN1的3’或5’側(cè)翼區(qū)。
53.權(quán)利要求52的試劑盒，其中所述至少一條PCR引物識(shí)別的序列位于SEQ ID No.24中的植物DNA。
54.權(quán)利要求53的試劑盒，其中所述識(shí)別位于SEQ ID No.24中的植物DNA序列的引物包含序列SEQ ID No.41。
55.權(quán)利要求52至54中任意一項(xiàng)的試劑盒，其進(jìn)一步包含至少第二條PCR引物或探針，其識(shí)別的序列位于MS-BN2的外源DNA中。
56.權(quán)利要求55的試劑盒，其中所述識(shí)別位于RF-BN1的外源DNA中序列的引物包含序列SEQ ID No.23。
57.用于RF-BN1 PCR鑒定方法的引物，其具有這樣的序列，其在優(yōu)化的PCR條件下，特異性識(shí)別位于RF-BN15’或3’側(cè)翼區(qū)的序列。
58.權(quán)利要求57的引物，其具有的序列與植物DNA SEQ ID No.24或SEQ ID No.30或其互補(bǔ)序列至少具有80％的序列同一性。
59.權(quán)利要求58的引物，其包含SEQ ID No.41的序列。
60.包含序列SEQ ID No.23的引物。
61.證實(shí)種子純度的方法，該方法包含用特異引物或探針檢測(cè)種子樣本中的RF-BN1特異性DNA序列，其中所述特異引物或探針可特異識(shí)別RF-BN15’或3’側(cè)翼區(qū)。
62.篩選種子中MS-BN1的存在的方法，該方法包含用特異引物或探針檢測(cè)種子批次樣本中的RF-BN1特異性DNA序列，其中所述特異引物或探針可特異識(shí)別RF-BN15’或3’側(cè)翼區(qū)。
全文摘要
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因冬油料種子油菜(winter oilseed rape；WOSR)植物、植物材料和種子，其特征在于擁有特異的轉(zhuǎn)化事件。它涉及冬油料種子油菜植物，更具體地涉及一對(duì)尤其適于產(chǎn)生雜交種子的冬油料種子油菜植物。更具體地，一種植物的特征為雄性不育，因?yàn)樵谒幕蚪M中存在雄性不育基因，而另一種植物的特征為攜帶育性恢復(fù)基因，可阻止雄性不育基因的活性。本發(fā)明進(jìn)一步提供了產(chǎn)生雜交種子的方法、產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因WOSR植物油或植物的方法以及鑒定轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)胞或組織的方法。也描述了用于鑒定包含本發(fā)明的原種事件之轉(zhuǎn)基因植物的試劑盒。本發(fā)明的WOSR植物將形成雜交種子的能力與最佳總體農(nóng)業(yè)性能、遺傳穩(wěn)定性以及對(duì)不同遺傳背景的適應(yīng)性結(jié)合起來(lái)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1409594SQ00816880
公開(kāi)日2003年4月9日 申請(qǐng)日期2000年12月6日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月8日
發(fā)明者G·德博特, M·德博克勒爾 申請(qǐng)人:阿溫提斯作物科學(xué)公司