專利名稱：基于正選擇的向日葵和油料種子的新型有效的轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對向日葵物種的轉(zhuǎn)化外植體賦予木糖代謝能力的正選擇方法。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及構(gòu)建包含選擇標(biāo)記基因的載體構(gòu)建體。具體方面涉及將所構(gòu)建載體在適于感染的條件下轉(zhuǎn)化至宿主植物的外植體中的農(nóng)桿菌介導(dǎo)性方法，其中所述的載體包含選擇標(biāo)記基因。成功轉(zhuǎn)化的包含目的基因的細(xì)胞因陽性作用而被誘導(dǎo)，其中所述的陽性作用在含有選擇劑的合適的培養(yǎng)基上一起培養(yǎng)時(shí)給予這些細(xì)胞勝過非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性代謝優(yōu)勢。這種選擇優(yōu)勢歸因于標(biāo)記基因在標(biāo)記化合物存在下的成功表達(dá)。
根據(jù)又一個(gè)方面，施加至轉(zhuǎn)化組織群體的選擇標(biāo)記化合物是誘導(dǎo)標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)化外植體中表達(dá)的木糖。
另外，發(fā)明主題的其他方面涉及編碼具有木糖異構(gòu)酶生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸分子。具體地，該方面涉及如SEQ ID 3中所示的多核苷酸。
此外，由所公開方法而實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化效率是12-15％并且已經(jīng)證明再生效率比基于抗生素(潮霉素)的負(fù)選擇方法大2-3倍。
現(xiàn)有技術(shù) 名為“甘露糖或木糖正選擇法”的美國專利申請5,767,378涉及從真核細(xì)胞群體中鑒定或選擇因轉(zhuǎn)化而具有代謝優(yōu)勢的細(xì)胞的方法，其中所述的真核細(xì)胞群體在含有至少一種化合物的培養(yǎng)基上或在其中培養(yǎng)。其中細(xì)胞用表達(dá)時(shí)導(dǎo)致化合物(如甘露糖或木糖)代謝的核苷酸序列或共導(dǎo)入的核苷酸序列加以轉(zhuǎn)化。
Haldrup等人(1998)已經(jīng)證實(shí)來自高溫厭氧芽孢桿菌(Thermonanaerobacterium)熱硫基因(thermosulfurogene)的木糖異構(gòu)酶基因允許在馬鈴薯、番茄和煙草物種中使用D-木糖作為選擇劑(Plant Molecular Biology(1998)，37(2)，287-296)而有效選擇轉(zhuǎn)基因植物。木糖異構(gòu)酶基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)移至靶植物。選擇研究表明在馬鈴薯和番茄中，木糖異構(gòu)酶選擇比卡那霉素抗性選擇是更高效的，而在煙草植物中觀察到相反效果。
最近名為“用于常規(guī)植物轉(zhuǎn)化的陽性選擇標(biāo)記基因”的綜述提到迄今所用的選擇標(biāo)記基因是抗生素抗性基因或除草劑耐受性基因。該綜述還描述了賦予轉(zhuǎn)基因細(xì)胞勝過非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的代謝優(yōu)勢的新類型標(biāo)記基因。
Haldrup等人(2001)描述了基于使用木糖異構(gòu)酶作為選擇標(biāo)記而選擇轉(zhuǎn)化的植物(In Vitro Cellular & Developmental BiologyPlant(2001)，37(2)，114-119。
美國專利申請5,767,378的繼續(xù)申請部分進(jìn)一步涉及用于從細(xì)胞群體內(nèi)選擇遺傳轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的方法中的新葡糖苷酸化合物(包含細(xì)胞分裂素葡糖苷酸化合物)，其中所述的方法包括引導(dǎo)所需核苷酸序列或共導(dǎo)入的核苷酸序列至細(xì)胞基因組，因而所需的核苷酸序列在細(xì)胞群體供以無活性化合物時(shí)通過給予該轉(zhuǎn)化細(xì)胞競爭性優(yōu)勢而誘導(dǎo)正作用，因而允許從非轉(zhuǎn)化細(xì)胞群體中鑒定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
Hou等人描述選擇標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)基因植物中的用途以及其去除。該綜述的焦點(diǎn)是在轉(zhuǎn)基因植物中選擇標(biāo)記基因的使用及其清除，重點(diǎn)是在轉(zhuǎn)基因植物中使用異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因、木糖異構(gòu)酶基因、磷酸甘露糖-異構(gòu)酶基因和β-葡糖醛酸糖苷酶基因作為正選擇標(biāo)記。還描述使用共轉(zhuǎn)化、位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的再定位(reposition)和同源重組除去標(biāo)記基因的方法。
本文中公開的選擇方法充分明晰以至于區(qū)別于所援引的現(xiàn)有技術(shù)。本發(fā)明的目標(biāo)具體地是正選擇屬于植物物種向日葵的轉(zhuǎn)化植物外植體的方法。此外，編碼木糖異構(gòu)酶蛋白質(zhì)的選擇標(biāo)記基因已經(jīng)從裂殖壺菌(Schizochytrium)中分離并適當(dāng)?shù)丶右孕揎椧员阍谒拗髦参镂锓N內(nèi)表達(dá)。還必須特別指出的是，幾乎沒有報(bào)道向日葵植物中的高轉(zhuǎn)化效率。更具體地，已經(jīng)提到伴隨從向日葵的多種外植體類型中再生的幾個(gè)問題(Schrammeijer等，Plant Cell Reports，1990955-60)。
我們報(bào)道12-15％的轉(zhuǎn)化效率和再生效率-該效率大于迄今所實(shí)現(xiàn)的效率2-3倍。
附圖簡述

圖1.SC-1去飽和酶的1.5kb序列中的完整木糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域 圖2.來自SC-1的基序與木糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域的同源性 圖3.pGEX-XI圖。木糖異構(gòu)酶基因克隆在BAmHI和XhoI位點(diǎn)之間以研究在大腸桿菌中的表達(dá)。
圖4.木糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中的誘導(dǎo)。所轉(zhuǎn)化SEA外植體用XI引物的擴(kuò)增。泳道I誘導(dǎo)；U未誘導(dǎo)；1、2、3攜帶木糖異構(gòu)酶基因的不同克隆；MMW標(biāo)記。
圖5.A.從木糖異構(gòu)酶克隆中擴(kuò)增ORF。
BpCAMBI A-XI用Xho I的限制酶切。注意hpt基因從Xho I位點(diǎn)中的釋放。
圖6.在pCAMBIA-CO-XI中用XI替換hpt。
圖7.培養(yǎng)在蔗糖(35gm/l)上A)、培養(yǎng)在D-木糖(30gm/l)上B)和培養(yǎng)在無任何碳源的培養(yǎng)基上C)的未轉(zhuǎn)化向日葵SEA外植體。在3周后給外植體照相。
圖8.在選擇2周后，在培養(yǎng)于A)潮霉素(25mg/l)和B)木糖(15g/l)+蔗糖(5gm/l)上的轉(zhuǎn)化SEA外植體中所觀察到的出芽。
圖9.在第一選擇培養(yǎng)基A)上的SEA外植體。B)&C)伸長培養(yǎng)基D)生根培養(yǎng)基E)&F)在硬化期(Hardening stage)的小植物。
圖10.用XI引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)化的SEA外植體。
序列表簡述 SEQ ID NO 1SC1的木糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)錄物的全長序列 SEQ ID NO 2SC1的木糖異構(gòu)酶的翻譯的蛋白質(zhì)序列 SEQ ID NO 3植物中優(yōu)化表達(dá)后的木糖異構(gòu)酶的序列 SEQ ID NO 4pCAMBIA載體閱讀框內(nèi)的全長密碼子優(yōu)化的SC1木糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)錄物的序列。
發(fā)明詳述 術(shù)語“選擇標(biāo)記基因”指優(yōu)選地隨目的基因一起共導(dǎo)入的任何核苷酸序列，其中選擇優(yōu)勢被賦予用所述選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
術(shù)語“選擇劑”是處于無活性形式或前體形式的化合物或營養(yǎng)物，其中所述的化合物或營養(yǎng)物在例如選擇標(biāo)記基因不表達(dá)時(shí)相對于所討論的細(xì)胞以基本上無生物學(xué)活性的形式存在，但是當(dāng)選擇標(biāo)記表達(dá)或轉(zhuǎn)錄時(shí)其受到水解或其它形式地被激活或代謝，以至于為遺傳轉(zhuǎn)化的含有目的基因的細(xì)胞提供選擇優(yōu)勢并且因而允許選擇該細(xì)胞。
術(shù)語“選擇優(yōu)勢”如本文中所用包括術(shù)語選擇性、代謝性和生理性優(yōu)勢并且意指轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠比劣勢(非轉(zhuǎn)化的)細(xì)胞更迅速地生長，或有利地能夠利用劣勢細(xì)胞不能利用的底物(如營養(yǎng)物前體等)。
實(shí)施例1克隆來自Thraustochytrid菌株SC-1木糖異構(gòu)酶。
從裂殖壺菌SC-1(從果阿的死水中分離的Thraustochytrid)的三日齡培養(yǎng)物中分離總RNA。使用Superscript Rnase(GibcoBRL)從mRNA中合成CDNA。cDNA克隆至pSPORT1載體的NotI-SalI位點(diǎn)中并且轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10B。
初級cDNA文庫由2×106個(gè)克隆構(gòu)成，而擴(kuò)增的文庫具有滴度2×1010個(gè)克隆/ml。隨機(jī)挑取EST克隆并且用SP6和T7引物擴(kuò)增插入物。隨機(jī)選擇2000個(gè)cDNA克隆的5’端并用T7引物測序。5’端測序來自SC-1的cDNA文庫的克隆導(dǎo)致1.5kb的cDNA克隆的鑒定，該克隆編碼具有158bp 5’UTR和30bp 3’UTR的1511bp的全長木糖異構(gòu)酶(xy1A)cDNA。該克隆具有1481bp的ORF。
CDS的序列示于SEQ ID 1。這是SC-1全長木糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)錄物的序列。該序列翻譯成具有440個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于SEQ ID 2。該序列顯示與擬南芥(Arabidopsis thaliana)木糖異構(gòu)酶的74％同源性。該序列含有完整的木糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域并且命名為SC-1木糖異構(gòu)酶。在圖1中顯示完整木糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域在SC-1去飽和酶的1.5kb序列中的存在。
圖2顯示來自SC-1的基序與木糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域的的同源性。
實(shí)施例2木糖異構(gòu)酶的密碼子優(yōu)化 SC-1木糖異構(gòu)酶(xy1A)序列使用在植物中相對很少利用的密碼子；SC-1優(yōu)勢地利用CGC來編碼精氨酸，而僅9％的編碼Ar g的植物密碼子是CGC。因此，用更頻繁使用的精氨酸密碼子替換CGC密碼子。該克隆經(jīng)兩輪多位點(diǎn)定向誘變以在導(dǎo)入植物之前置換9個(gè)核苷酸。優(yōu)化的序列示于SEQ ID 3。
實(shí)施例3克隆木糖異構(gòu)酶至pGEX表達(dá)載體 為證實(shí)密碼子優(yōu)化的基因的確轉(zhuǎn)錄并翻譯，來自pSPORT1的密碼子優(yōu)化的SC-1Xy1A基因用含BamHI位點(diǎn)的正向引物(5’GCGCGGATCCATGGGTGAATTCTTTC3’)和含XhoI位點(diǎn)的反向引物(5’GAAACTCGAGCTTGTCGATTAAGAAATGTATTGGTT 3’)擴(kuò)增。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物(1323)用BamHI和XhoI消化。pGEX-4T-3是用來表達(dá)蛋白質(zhì)為含26-kDa谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST處于tac啟動(dòng)子控制下)的融合蛋白的表達(dá)載體。pGEX-4T-3用BamHI和XhoI消化并且將(用BamHI和XhoI限制性消化的)PCR產(chǎn)物在這兩個(gè)位點(diǎn)之間定向克隆，產(chǎn)生的克隆稱作pGEX-XI。pGEX-XI圖已經(jīng)示于圖3。
木糖異構(gòu)酶融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá) 將攜帶木糖異構(gòu)酶基因的pGEX-XI轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21。在含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。隨機(jī)挑取菌落并將菌落在含100μg/ml氨芐青霉素的LB中培養(yǎng)過夜。1％的這些過夜培養(yǎng)物用作初始培養(yǎng)物以接種含100μg/ml氨芐青霉素的5ml LB肉湯。溫育培養(yǎng)物直至O.D.600達(dá)到大約0.6-0.7。2ml這些培養(yǎng)物用1mMIPTG誘導(dǎo)3小時(shí)。同時(shí)，將2ml培養(yǎng)物離心下來作為無誘導(dǎo)的對照。細(xì)胞沉淀重懸于100μl樣品緩沖液中并且將其中50u l加載至10％SDS-PAGE凝膠上。誘導(dǎo)示于圖4。
在克隆1和2的誘導(dǎo)細(xì)胞中觀察到GST-木糖異構(gòu)酶融合蛋白預(yù)期大小的76KDa的蛋白質(zhì)，而在未誘導(dǎo)的細(xì)胞中該蛋白質(zhì)不存在。因此密碼子優(yōu)化的木糖異構(gòu)酶處于正確的閱讀框中并且能夠被轉(zhuǎn)錄并翻譯。
木糖異構(gòu)酶基因在大腸桿菌中功能的證實(shí) 大腸桿菌菌株AB477(proA2，his-4，aroC1，thi-1，lacY1，galK2，xyl-5，mtl-1，λ-supE44)是木糖異構(gòu)酶(Xy1A)缺陷型(Haldrup等，1998 & 2001)。木糖異構(gòu)酶基因在突變體中的互補(bǔ)作用將能夠使該菌株利用木糖并且生長并因而證實(shí)其功能。大腸桿菌菌株AB477從美國大腸桿菌遺傳貯藏中心獲得。將pGEX-4T-3中的木糖異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株AB477的感受態(tài)細(xì)胞，其中所述的感受態(tài)細(xì)胞涂布在具有氨芐青霉素(100μg/ml)的含1％(w/v)D-木糖的MacConkey瓊脂平板上。攜帶Xy1A基因的轉(zhuǎn)化體能夠發(fā)酵D-木糖并且在含有木糖的M acConkey瓊脂平板上顯紅色。
分別在含有氨芐青霉素(100μg/ml)的MacConkey培養(yǎng)基以及分別含有木糖(1％w/v)和氨芐青霉素(100μg/ml)的培養(yǎng)基上涂布AB477宿主細(xì)胞、用pGEX4T-3轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和用pGEX-XI轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞。在含有木糖的培養(yǎng)基中用pGEX-XI獲得紅色菌落，而宿主細(xì)胞和攜帶pGEX4-T3的AB477在該培養(yǎng)基中不生長。因此從SC-1分離的密碼子優(yōu)化的木糖異構(gòu)酶基因得到翻譯并且是有功能的。
實(shí)施例4克隆木糖異構(gòu)酶至pCAMBIA pCAMBIA-1301從pPZP載體衍生。該載體含有處于CaMV35S啟動(dòng)子下并由CaMV35S聚腺苷酸化信號終止的潮霉素磷酸-轉(zhuǎn)移酶(hpt)。該基因提供潮霉素抗性，因而在含有潮霉素的培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
用分別含XhoI位點(diǎn)的正向引物(5’CTCTCTCGAGCAACCATGGGTGAATTCTTTCC 3’)及反向引物(5’GAAACTCGAGCTTGTCGATTAAGAAATGTATTGGTT 3’)擴(kuò)增pSPORT中的密碼子優(yōu)化的木糖異構(gòu)酶(Xy1A)基因的ORF。擴(kuò)增的片段用XhoI限制性消化。pCAMBIA 1301同時(shí)用XhoI限制性消化以釋放hpt基因并且將純化自瓊脂糖凝膠的載體與擴(kuò)增片段連接。對來自木糖異構(gòu)酶克隆的ORF的擴(kuò)增和pCAMBIA-XI用XhoI的限制性消化示于圖5。
將連接混合物轉(zhuǎn)化至DH10B。挑取轉(zhuǎn)化的菌落并且從這些菌落中分離的質(zhì)粒用XI引物擴(kuò)增并且用相同引物進(jìn)行測序。因此，鑒定了攜帶處于正確方向上和正確讀框中的XI基因的構(gòu)建體。在SEQ ID.4中給出克隆在正確讀框中的基因的序列。
圖6顯示在pCAMBIA載體閱讀框內(nèi)的全長密碼子優(yōu)化的SC1木糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)錄物的序列和pCAMBIA-CO-XI中XI對hpt的替換?？寺≡谳d體pCAMBIA1301的Xho-I位點(diǎn)間的編碼潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的hpt基因已經(jīng)由密碼子優(yōu)化的的木糖異構(gòu)酶替換，其代替潮霉素，已被命名為pCAMBIA-XI。
實(shí)施例5 使用木糖異構(gòu)酶作為正選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化向日葵 已知當(dāng)遺傳材料欲通過轉(zhuǎn)化而導(dǎo)入細(xì)胞群體時(shí)，僅某些數(shù)目的細(xì)胞成功地轉(zhuǎn)化。已經(jīng)常規(guī)地使用負(fù)選擇法實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的鑒定和選擇，因而轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠在含有轉(zhuǎn)化細(xì)胞能降解的試劑的培養(yǎng)基上存活，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則在該培養(yǎng)基上被殺死。潮霉素是最常使用的抗生素，而構(gòu)建體中用于轉(zhuǎn)化的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)為在含有抗生素的培養(yǎng)基中培育的轉(zhuǎn)化細(xì)胞提供抗性。
這些負(fù)選擇方法具有某些劣勢。盡管非轉(zhuǎn)化細(xì)胞可能因生長培養(yǎng)基中存在抗生素而死亡，然而它們向培養(yǎng)基釋放同樣抑制并毒害轉(zhuǎn)化細(xì)胞的毒素。此外，在攝入植物中的抗生素抗性基因及微生物的存在為環(huán)境組織和政府機(jī)構(gòu)所關(guān)注。另外，使用負(fù)選擇法對細(xì)胞或組織選擇需要相對于選擇過程而對導(dǎo)入基因的表達(dá)精確計(jì)時(shí)。若轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在脫毒基因表達(dá)前或在產(chǎn)生足夠的基因產(chǎn)物以減少有毒化合物的作用之前用有毒化合物處理，則轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞均被殺死。若選擇被延誤，對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織的選擇可因例如來自非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織的芽或愈傷組織的形成而受阻，這對用來選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的化合物滲透形成障礙。
以上提及的劣勢通過正選擇方法極大程度地得以克服，其中所述的正選擇方法使以下成為可能即選擇性地培育轉(zhuǎn)化細(xì)胞而不損害或殺死群體中的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞并且不導(dǎo)入抗生素抗性基因或除草劑抗性基因。
眾多植物物種沒有代謝木糖的內(nèi)在能力并且因此不能在其中木糖是唯一碳源的培養(yǎng)基上繁茂生長。用攜帶木糖異構(gòu)酶作為選擇標(biāo)記的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化此類物種將賦予轉(zhuǎn)化的細(xì)胞利用木糖作為碳源的能力。
在向日葵中的轉(zhuǎn)化和選擇 植物材料 對于本研究，使用向日葵CMS234B，即234A的保持系，它是在印度廣泛用作母本以產(chǎn)生雜交向日葵的近交系。向日葵CMS234B是KBSH1雜交種的親代系，這是國家驗(yàn)證的短生存期品種(90-100日)，含油量42％，是用作全部雜交種生產(chǎn)的保持系。
將向日葵CMS 234B的種子脫皮并在70％乙醇中消毒2分鐘并用0.1％升汞消毒4分鐘。消毒的種子用無菌水劇烈洗滌4-5次，隨后在BOD中在25℃于水中吸脹2小時(shí)。對三種不同的外植體即芽頂端分生組織、分裂的胚軸(split embryonic axis)和子葉測試其再生效率。在這些外植體中，發(fā)現(xiàn)分裂的胚軸(SEA)外植體具有最大再生潛能。
分裂的胚軸外植體的分離 在種子消毒后，小心地剝下紙狀半透明種衣和內(nèi)部薄的透明胚乳層。第一次切割沿平行于兩片子葉結(jié)合的線穿透子葉而進(jìn)行以剖分芽分生組織。小心地從芽頂端分生組織的尖端切去初葉，若其存在。除去含有根分生組織的組織并且直接穿過芽頂端分生組織的中央進(jìn)行最后切割。將外植體收集在潤濕的濾紙上。
篩選利用木糖作為碳源的能力 為了確定向日葵是否能夠使用木糖作為碳源，在分別含有蔗糖和木糖的再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)外植體。
分離100個(gè)SEA外植體并將它們在其中碳源是a)3.5％蔗糖；b)3％木糖和c)無碳源的含0.5mg/lBAP的Murashige和Skoog培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)上培養(yǎng)3周。碳源對外植體的影響在三周結(jié)束時(shí)觀察。
圖7表示培養(yǎng)在蔗糖(35gm/l)上A)、培養(yǎng)在D-木糖(30gm/l)上B)和培養(yǎng)在無任何碳源的培養(yǎng)基上C)的向日葵SEA外植體。在3周后給外植體照相。
在含木糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的外植體在2-3周內(nèi)枯黃和死亡。這些外植體看上去類似于在培養(yǎng)基中無任何碳源存在下所培育的外植體。因此，向日葵CMS234B SEA外植體顯示不能夠使用木糖作為碳源。
使用pCAMBIA-XI轉(zhuǎn)化向日葵 用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染 如前所述對種子消毒并分離分裂的胚軸。攜帶雙元載體pCAMBIA1301(攜帶hpt基因)的根瘤農(nóng)桿菌(Agrobactrium tumefaciens)菌株GV3101和攜帶載體pCAMBIA-XI的菌株用于比較。
來自甘油貯藏物的農(nóng)桿菌細(xì)胞在含有利福平(10μg/ml)、慶大霉素(10μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中培育過夜并且指數(shù)方式培育4-6小時(shí)時(shí)間段以達(dá)到O.D600＝1.0。將細(xì)胞在4℃以6000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘并且隨后在MS液中洗滌并重懸以達(dá)到1.0的O.D600。切下的外植體立即轉(zhuǎn)移至含有25ml重懸的培養(yǎng)物的真空浸透燒瓶(vacuum infiltration flask)中。在200atm壓力下施加真空15分鐘并且將真空迅速釋放。隨后徹底倒出培養(yǎng)物并且在吸墨紙上收集外植體。外植體轉(zhuǎn)移至含有0.5mg/lBAP+2gm/l蔗糖的MS培養(yǎng)基中在26℃在黑暗下持續(xù)2日。
實(shí)施例6 選擇和再生 正選擇和再生 在共培養(yǎng)2日后，外植體用含有250mg/l頭孢噻肟的Murashigeand Skoog(1972)液體培養(yǎng)基徹底洗滌。外植體隨后轉(zhuǎn)移至含有0.5mg/lBAP、15gmD-木糖、5gm/l蔗糖、250mg/l頭孢噻肟、8gm/l瓊脂，pH 5.6的MS培養(yǎng)基內(nèi)并且在16小時(shí)光照和8小時(shí)黑暗的光周期下培養(yǎng)3周，實(shí)施兩輪繼代培養(yǎng)。在選擇期后，使芽繼代培養(yǎng)至含有1/2MS培養(yǎng)基的伸長培養(yǎng)基上。在2周后，伸長的芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(含有0.01mg/lIBA的1/2MS培養(yǎng)基)。生根的植物在轉(zhuǎn)移至土壤和蛭石混合物之前在水中硬化2日。
負(fù)選擇和再生 在共培養(yǎng)2日后，外植體用含有250mg/l頭孢噻肟的MS培養(yǎng)基徹底洗滌。外植體隨后轉(zhuǎn)移至選擇和再生培養(yǎng)基(含有0.5mg/lBAP、15mg/l潮霉素、250mg/l頭孢噻肟、30gm/l蔗糖、8gm/l瓊脂，pH 5.6的MS培養(yǎng)基)。在選擇期后，使芽繼代培養(yǎng)至伸長培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基)持續(xù)2周。伸長的芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(含有0.01mg/lIBA的1/2MS培養(yǎng)基)并且生根的植物隨后轉(zhuǎn)移至土壤。
比較正選擇法與負(fù)選擇法 外植體用pCAMBIA 1301(帶有hpt)和pCAMBIA-XI(木糖異構(gòu)酶替換hpt)轉(zhuǎn)化并且在分別含有不同濃度的潮霉素和木糖的相應(yīng)選擇培養(yǎng)基上選擇。將第一輪選擇后存活的外植體轉(zhuǎn)移至相同培養(yǎng)基上持續(xù)21日以進(jìn)行第二次選擇。外植體隨后轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的伸長培養(yǎng)基上。健康的小苗轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的生根培養(yǎng)基上。
所作觀察列于下表 A)用pCAMBIA-1301轉(zhuǎn)化外植體。在含有潮霉素的培養(yǎng)基上的選擇 B)用pCAMBIA-XI轉(zhuǎn)化外植體。在含有木糖的培養(yǎng)基上的選擇 表1向日葵SEA外植體用pCAMBIA-1301和pCAMBIA-XI的轉(zhuǎn)化 圖8顯示在選擇2周后在培養(yǎng)于A)潮霉素(25mg/l)和B)木糖(15g/l)+蔗糖(5gm/l)上的轉(zhuǎn)化SEA外植體中所觀察到的出芽。
潮霉素似乎比木糖對外植體產(chǎn)生更大毒性作用。觀察到在潮霉素培養(yǎng)基上生長的外植體所產(chǎn)生的芽是矮化和水生性的。它們生長不良并且?guī)缀醪辉谏扉L培養(yǎng)基上存活。再生效率即便在低濃度潮霉素下也是極低的。
在木糖上選擇的外植體中觀察到更好的出芽效率。更多外植體產(chǎn)生正常的嫩枝芽；這些芽在第二輪選擇時(shí)存活更好。與潮霉素培養(yǎng)基上1-2個(gè)簇集且矮化的芽相比，在正選擇中觀察到每一外植體2-3個(gè)健康芽。當(dāng)與培育在潮霉素上的小植物比較時(shí)，在D-木糖培養(yǎng)基上培育的小植物含有90％的綠色組織。該外植體也在伸長培養(yǎng)基上顯示更好的存活和生長。芽在伸長培養(yǎng)基中是健康的并且發(fā)育成小苗。
相對于hpt，使用XI選擇，我們觀察到2-3倍更多數(shù)目的再生小植物。當(dāng)轉(zhuǎn)染后在選擇培養(yǎng)基中使用5g蔗糖和15g木糖時(shí)，獲得再生效率的進(jìn)一步改進(jìn)。如下是對使用正選擇法轉(zhuǎn)化和再生向日葵進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的方案 ■將向日葵CMS 234B的種子脫皮并在70％乙醇中消毒2分鐘，隨后用0.1％升汞處理4分鐘。
■消毒的種子用無菌水劇烈洗滌4-5次，隨后在BOD中在25℃于水中吸脹2小時(shí)。
■小心除去子葉、胚根和初葉以暴露芽頂端分生組織(SEA)。
■SEA外植體用攜帶AGT-D15-XI的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物GV3101(OD600＝1.0)感染 ■在200毫巴上真空浸透15分鐘 ■在含有100mg/l肌醇、0.5mg/l BAP、2g/l蔗糖、8g/l瓊脂，pH 5.6的MS培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2日。
■外植體在含有35g/l蔗糖、100mg/l肌醇、250mg/l頭孢噻肟，pH 5.6的MS培養(yǎng)基中洗滌15分鐘并吸干。
■在含有100mg/l肌醇、15g/l木糖、2gm/l蔗糖、0.5mg/l BAP、250mg/l頭孢噻肟、8g/l瓊脂，pH5.6的MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3周 ■在含有50mg/l肌醇、15g/l蔗糖、250mg/l頭孢噻肟、8g/l瓊脂，pH5.6的1/2MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)1周 ■在含有50mg/l肌醇、0.01mg/1IBA、250mg/l頭孢噻肟、8g/l瓊脂，pH 5.6的1/2MS培養(yǎng)基繼代培養(yǎng) ■最后將小植物轉(zhuǎn)移到含紅壤(10％)和蛭石(90％)混合物的盆中。
圖9顯示在第一選擇培養(yǎng)基A)上的SEA外植體。B) & C)伸長培養(yǎng)基D)生根培養(yǎng)基E)&F)在硬化期的小植物。
從100個(gè)外植體開始，用pCAMBIA-1301轉(zhuǎn)化時(shí)獲得2-3株攜帶hpt基因的轉(zhuǎn)基因植物。然而，以相同數(shù)目的外植體開始，用pCAMBIA_XI轉(zhuǎn)化時(shí)獲得12-15株攜帶XI基因的轉(zhuǎn)基因植物。經(jīng)潮霉素選擇所獲得的小植物是極少的，此外，這些小植物極為虛弱并且沒有長成完整植物。
實(shí)施例7 分子分析 對轉(zhuǎn)化后獲得的小植物通過用XI引物擴(kuò)增而篩選選擇標(biāo)記基因。
表2.用于擴(kuò)增木糖異構(gòu)酶基因的引物 從轉(zhuǎn)化的小植物中分離的基因組DNA用以上引物擴(kuò)增。所用擴(kuò)增條件如下 DNA 100ng dNTP 200μM 引物 0.25μM MgCl2mM 10X緩沖液2.5μl(Bangalore Genei) Taq聚合酶1U 總體積25μl 循環(huán)條件如下 擴(kuò)增條件如下
圖10表示用XI引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)化的SEA外植體。攜帶pCAMBIA1301-XI的所選小植物的100ng基因組DNA用XI引物進(jìn)行擴(kuò)增。泳道1-10來自不同外植體的DNA樣品；‘+’農(nóng)桿菌DNA；M1kb分子量梯 注意用XI引物在9個(gè)外植體中的擴(kuò)增顯示這些樣品使XI整合在其基因組中。
大約90％選擇的外植體顯示XI基因整合至外植體基因組內(nèi)，如通過轉(zhuǎn)化外植體中XI基因的擴(kuò)增所示。
因此，與世界范圍迄今用其它選擇標(biāo)記所報(bào)道的0.2-6.2％轉(zhuǎn)化效率相比較，我們報(bào)道使用木糖異構(gòu)酶用于選擇的穩(wěn)定的12-15％轉(zhuǎn)化效率。
因此，我們證實(shí)SC1木糖異構(gòu)酶用于正選擇是用于轉(zhuǎn)化向日葵外植體的高效方法。該選擇系統(tǒng)比傳統(tǒng)基于卡那霉素和潮霉素的系統(tǒng)更高效并且產(chǎn)生數(shù)目更多的轉(zhuǎn)基因植物。它還解決了從頑拗性作物如向日葵中增加(raising)轉(zhuǎn)基因以成功地產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因向日葵的問題。最后，它還滿足替代性選擇標(biāo)記的需要并且避免在開發(fā)基因改造的植物中使用抗生素抗性基因。
序列表
<110>Avestha Gengraine Technologies Pvt Ltd.
Gengraine Techno logi es Pvt.Ltd，Avestha
Morawala Patell，Villoo
<120>在向日葵中使用木糖異構(gòu)酶的正選擇方法
<130>09-1-2005
<160>7
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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<212>DNA
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gcg ctc cgt cgt gta gac gcc gcc ttt gag cta ttt aca aag ctt ggc288
Ala Leu Arg Arg Val Asp Ala Ala Phe Glu Leu Phe Thr Lys Leu Gly
85 90 95
gtt gag tac tac agc ttt cat gat gtg gat gtt tct ccc gaa ggt gca336
Val Glu Tyr Tyr Ser Phe His Asp Val Asp Val Ser Pro Glu Gly Ala
100 105 110
aca ctc aag gag aca aat gag aac ctt gac aag att acc gac cgt atg384
Thr Leu Lys Glu Thr Asn Glu Asn Leu Asp Lys Ile Thr Asp Arg Met
115 120 125
cta gaa ctg caa aag aaa aca gga gtg aag ctt ttg tgg ggt aca gct432
Leu Glu Leu Gln Lys Lys Thr Gly Val Lys Leu Leu Trp Gly Thr Ala
130 135 140
aac ctc ttt acc aac ccc cgt tac atg aac ggt ggc tcc acg aac ccg480
Asn Leu Phe Thr Asn Pro Arg Tyr Met Asn Gly Gly Ser Thr Asn Pro
145 150 155 160
gac ccg aat gtc ttc att cga gct gct gca cag gtt aaa aag gct atc528
Asp Pro Asn Val Phe Ile Arg Ala Ala Ala Gln Val Lys Lys Ala Ile
165 170 175
gat gtt acg cac aag ctt ggt ggt caa ggt ttt gta ttc tgg ggt ggt576
Asp Val Thr His Lys Leu Gly Gly Gln Gly Phe Val Phe Trp Gly Gly
180 185 190
cgt gaa ggc tac atg cac att ctc aac act gat gtt gtg cgt gag atg624
Arg Glu Gly Tyr Met His Ile Leu Asn Thr Asp Val Val Arg Glu Met
195 200 205
aac cac tat gcc cag atg ctg aag atg gcg att gca tac aag aag aag672
Asn His Tyr Ala Gln Met Leu Lys Met Ala Ile Ala Tyr Lys Lys Lys
210 215 220
atc ggc ttt gat ggt caa att ctt gtg gag cca aaa cct cgt gaa cca720
Ile Gly Phe Asp Gly Gln Ile Leu Val Glu Pro Lys Pro Arg Glu Pro
225 230 235 240
atg aag cac caa tat gat tac gat gta caa acc gtg att ggg ttc ttg768
Met Lys His Gln Tyr Asp Tyr Asp Val Gln Thr Val Ile Gly Phe Leu
245 250 255
cga gag cat ggg ctt gaa aaa gaa gtc ctg ctg aat gtt gaa ccc aac816
Arg Glu His Gly Leu Glu Lys Glu Val Leu Leu Asn Val Glu Pro Asn
260 265 270
cac acc cag ctt gcg ggc cac gaa ttt gag cat ggc ttt atc ttt gct864
His Thr Gln Leu Ala Gly His Glu Phe Glu His Gly Phe Ile Phe Ala
275 280 285
gcc aaa ctt ggc atg ctt gga agc att gat gct aat acc ggt tct gag912
Ala Lys Leu Gly Met Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Thr Gly Ser Glu
290 295 300
agt ctt ggc tgg gac act gat gag ttc atc act gac cag act cat gcg960
Ser Leu Gly Trp Asp Thr Asp Glu Phe Ile Thr Asp Gln Thr His Ala
305 310 315 320
act ctg ctg tgt cgt acg att att gag atg ggc ggt ttc aaa aaa ggt 1008
Thr Leu Leu Cys Arg Thr Ile Ile Glu Met Gly Gly Phe Lys Lys Gly
325 330 335
ggc ctt aac ttt gat gcc aag gtg cga cgt gaa agt act gat cca gag 1056
Gly Leu Asn Phe Asp Ala Lys Val Arg Arg Glu Ser Thr Asp Pro Glu
340 345 350
gat ctc ttt atc gcg cac gtg gca tct atg gat gca ctt gct aaa ggt 1104
Asp Leu Phe Ile Ala His Val Ala Ser Met Asp Ala Leu Ala Lys Gly
355 360 365
ctt cgt aat gct gcc aaa ttg gtt gat gaa ggc cgt atg gct aag atg1152
Leu Arg Asn Ala Ala Lys Leu Val Asp Glu Gly Arg Met Ala Lys Met
370 375 380
ctc gca gag cgt tac gct gga tgg gac tct gga cta ggt aag aga att1200
Leu Ala Glu Arg Tyr Ala Gly Trp Asp Ser Gly Leu Gly Lys Arg Ile
385 390 395 400
gag gat ggc cag agt tcg ctt gac gag ctg gag gag cat gcg ctc cag1248
Glu Asp Gly Gln Ser Ser Leu Asp Glu Leu Glu Glu His Ala Leu Gln
405 410 415
aat gat gag gag ccc gct aag act tca gca aaa cag gag aag ttt att1296
Asn Asp Glu Glu Pro Ala Lys Thr Ser Ala Lys Gln Glu Lys Phe Ile
420 425 430
gct gtt ctc aac caa tac att tct taa1323
Ala Val Leu Asn Gln Tyr Ile Ser
435 440
權(quán)利要求
1、用于選擇并再生遺傳轉(zhuǎn)化的油料種子、更具體是向日葵植物外植體的方法，其包括
a)構(gòu)建重組載體，其中所述重組載體并入與調(diào)節(jié)序列有效連接的編碼選擇劑木糖代謝所需的木糖異構(gòu)酶的核酸序列。
b)在最佳感染的條件下轉(zhuǎn)化所述載體至植物外植體內(nèi)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法。
c)在含有步驟a)的選擇劑的MS培養(yǎng)基上選擇推測性轉(zhuǎn)化體的步驟。
d)再生所選擇植物外植體的步驟。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中使用的物種是向日葵物種。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述編碼木糖異構(gòu)酶的核酸序列從生物體裂殖壺菌內(nèi)分離，并如SEQ ID 1所示。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸序列，其中至少一種所述核苷酸序列受到修飾以至于如此修飾的DNA的表達(dá)在所述宿主植物外植體中發(fā)生。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸序列，其中所述序列示于Seq ID3。
6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)的蛋白質(zhì)的相應(yīng)氨基酸序列，其示于Seq ID 2。
7、根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸，其中所述調(diào)節(jié)序列是啟動(dòng)子序列。
8、根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述選擇劑是木糖。
9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述遺傳轉(zhuǎn)化的植物外植體攜帶包含權(quán)利要求5所述的核苷酸序列的載體，所述載體的表達(dá)對轉(zhuǎn)化的外植體賦予勝過非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的代謝優(yōu)勢。
10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)化的植物外植體和未轉(zhuǎn)化的植物外植體均基于利用所述選擇劑作為糖源的所述競爭性代謝優(yōu)勢加以選擇，所述的競爭性代謝優(yōu)勢歸咎于所述酶由權(quán)利要求5所述的核酸表達(dá)。
11、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中獲得的轉(zhuǎn)化效率大于或等于10％。
12、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中獲得的轉(zhuǎn)化效率大于或等于15％。
13、根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述再生效率是相對于本說明書表-1中所示的基于潮霉素的負(fù)選擇方法的2-3倍。
全文摘要
本發(fā)明描述了導(dǎo)致獲得12-15％轉(zhuǎn)基因植物的高度改良的、可重復(fù)性和一致的轉(zhuǎn)化及再生方法。本發(fā)明涉及基于其利用木糖作為唯一糖源的能力而選擇遺傳轉(zhuǎn)化的向日葵外植體的方法。還公開了木糖異構(gòu)酶基因的核酸序列、用于并入選擇標(biāo)記基因的載體構(gòu)建體和用載體以農(nóng)桿菌介導(dǎo)方式轉(zhuǎn)化靶宿主植物的方法，其中所述的載體包含與異源調(diào)節(jié)序列處于功能性組合下的編碼木糖異構(gòu)酶的基因。還公開了用所述載體轉(zhuǎn)化后選擇具有利用木糖作為唯一碳源的代謝優(yōu)勢的推測性轉(zhuǎn)化體的方法。根據(jù)所述的正選擇方法，觀察到增加的再生效率、更好的生長和存活。發(fā)明主題減少負(fù)選擇方法的劣勢，如不希望的轉(zhuǎn)化細(xì)胞消除和因抗生素抗性基因及除草劑抗性基因擴(kuò)散引起的潛在環(huán)境損害。
文檔編號C12N9/90GK101336296SQ200680052064
公開日2008年12月31日 申請日期2006年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月12日
發(fā)明者P·V·莫拉瓦拉, K·R·拉伊亞什里 申請人:阿維沙基因有限公司