專利名稱：神經(jīng)酰胺酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可作為神經(jīng)酰胺結(jié)構(gòu)和功能分析的脂質(zhì)工程學(xué)試劑應(yīng)用的、且具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽，與之特異性結(jié)合的抗體，編碼該多肽的基因，以及與該基因特異性雜交的探針及引物。本發(fā)明還涉及上述多肽的基因工程學(xué)制備方法，以及該多肽或基因的檢測方法及其試劑盒。再者，本發(fā)明涉及細胞內(nèi)和/或組織內(nèi)神經(jīng)酰胺量的調(diào)節(jié)方法，該方法有可能應(yīng)用于因神經(jīng)酰胺量異常引起的疾病。
根據(jù)最適pH可把神經(jīng)酰胺酶分成酸性神經(jīng)酰胺酶、中性/堿性神經(jīng)酰胺酶。到目前為止的在酸性區(qū)具有最適pH的神經(jīng)酰胺酶存在于大鼠腦[生化(Biochemistry)，第8卷，第1692-1698頁(1969)]，豚鼠上皮細胞[生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，第270卷，第12677-12684頁(1995)]，人腎臟[生化與生物物理學(xué)學(xué)報(Biochim.Biophys.Acta)，第398卷，第125-131頁(1975)]，脾臟[生化與生物物理學(xué)學(xué)報，第1004卷，第245-251頁(1989)]，成纖維細胞[生化雜志(Biochem.J.)，第205卷，第419-425頁(1982)]，上皮細胞[FEBS Lett.，第268卷，第110-112頁(1990)]等哺乳動物組織，人尿[生物化學(xué)雜志，第270卷，第11098-11102頁(1995)]等。
另外，已知假單胞菌屬的細菌產(chǎn)生神經(jīng)酰胺酶，這種神經(jīng)酰胺酶具有的最適pH在堿性區(qū)[生物化學(xué)雜志，第273卷，第14368-14373頁(1998)]。
在這些神經(jīng)酰胺酶中，已測定了從人尿純化出的酸性神經(jīng)酰胺酶的氨基酸序列和編碼該神經(jīng)酰胺酶的基因的堿基序列[生物化學(xué)雜志，第271卷，第33110-33115頁(1996)]。而且，利用與上述來源于人尿的酸性神經(jīng)酰胺酶基因的同源性得到了小鼠的酸性神經(jīng)酰胺酶基因[基因組(Genomics)，第50卷，第267-274頁(1998)]。
但是，目前所報道的來源于哺乳類的神經(jīng)酰胺酶基因均編碼酸性神經(jīng)酰胺酶，而對于哺乳類中中性/堿性神經(jīng)酰胺酶的氨基酸序列和基因結(jié)構(gòu)完全不了解，對于高等生物中中性/堿性神經(jīng)酰胺酶的生物學(xué)功能也不清楚。
在闡明生物體內(nèi)神經(jīng)酰胺的功能、其代謝調(diào)控、與神經(jīng)酰胺相關(guān)的疾病的診斷及治療等研究中，有必要獲得與神經(jīng)酰胺相關(guān)的各種酶及與該酶的基因相關(guān)的詳細信息。但是，如同上述所講，現(xiàn)狀是尚未得到與哺乳類中中性/堿性神經(jīng)酰胺酶的氨基酸序列和其基因相關(guān)的信息。因此，為了開發(fā)與神經(jīng)酰胺相關(guān)的上述技術(shù)，有必要獲得與中性/堿性神經(jīng)酰胺酶相關(guān)、尤其是與其基因相關(guān)的信息。
如上所述，有幾篇報道是關(guān)于克隆哺乳類神經(jīng)酰胺酶基因的，但均是在酸性區(qū)顯示活性的神經(jīng)酰胺酶，它們和在中性/堿性區(qū)顯示活性的神經(jīng)酰胺酶之間也不可能具有高的同源性。因此，將中性/堿性神經(jīng)酰胺酶基因作為酸性神經(jīng)酰胺酶基因堿基序列的同源物來獲得是很困難的。
本發(fā)明者們成功地從哺乳類小鼠的肝臟中分離出了中性/堿性神經(jīng)酰胺酶及其基因。另外，通過雜交和聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)等手段，成功地闡明了包括人在內(nèi)的哺乳類中性/堿性神經(jīng)酰胺酶的結(jié)構(gòu)。還應(yīng)用該基因，通過基因工程學(xué)方法成功地簡便地制備出高純度的中性/堿性神經(jīng)酰胺酶，進而完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明的要點如下。
一種基團，它具有從下列核酸構(gòu)成的組中選擇的核酸堿基序列(A)一種核酸，它編碼的多肽具有序列表的序列號14中所述的氨基酸序列或其一部分序列，且該多肽具有神經(jīng)酰胺酶活性；(B)一種核酸，它具有序列表的序列號15中所述的堿基序列或其一部分序列，且編碼具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽；(C)一種核酸，它編碼的多肽具有序列表的序列號14中所述的氨基酸序列中至少1個氨基酸殘基發(fā)生缺失、添加、插入或置換的氨基酸序列，且該多肽具有神經(jīng)酰胺酶活性；(D)一種核酸，它具有序列表的序列號15中所述的堿基序列中至少1個堿基發(fā)生缺失、添加、插入或置換的堿基序列，且編碼具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽；以及，(E)一種核酸，它可在嚴格條件下與上述(A)-(D)任一項所述的核酸的互補鏈雜交，且編碼具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽；(F)一種核酸，通過密碼子的簡并性與上述(A)-(E)任一項所述的核酸具有不同的堿基序列，并且該核酸編碼具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽。
重組DNA，它含有上述[1]所述的基因；[3]微生物、動物細胞或植物細胞用的表達載體，它包含上述[1]所述的基因或上述[2]所述的重組DNA；[4]轉(zhuǎn)化體，它攜有上述[3]所述的表達載體；[5]具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽的制備方法，其特征在于，在適于神經(jīng)酰胺酶基因表達且適于生產(chǎn)該基因編碼的多肽的條件下培養(yǎng)上述[4]所述的轉(zhuǎn)化體，從所得培養(yǎng)物中提取具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽；[6]一種多肽，具有序列表的序列號14中所述的氨基酸序列或其一部分序列，且具有神經(jīng)酰胺酶活性；[7]一種多肽，它由上述[1]所述的基因編碼，且具有神經(jīng)酰胺酶活性；[8]與上述[1]所述的基因或其一部分互補的反義DNA；[9]與上述[1]所述的基因或其一部分互補的反義RNA；[10]含有上述[8]所述的反義DNA的表達載體；[11]與上述[1]所述的基因或其互補鏈特異性雜交的寡核苷酸探針或引物；[12]可與上述[6]或[7]所述的多肽特異性結(jié)合的抗體或其片斷；[13]編碼具有神經(jīng)酰胺酶活性多肽的基因的檢測方法，該方法中使用了上述[11]所述的寡核苷酸探針和/或引物；[14]用于檢測編碼具有神經(jīng)酰胺酶活性多肽的基因的試劑盒，它含有上述[11]所述的寡核苷酸探針和/或引物；[15]檢測具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽的方法，它使用了上述[12]所述的抗體或其片斷；[16]用于檢測具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽的試劑盒，它含有上述[12]所述的抗體或其片斷；[17]調(diào)節(jié)細胞內(nèi)和/或組織內(nèi)神經(jīng)酰胺量的方法，其特征在于，將上述[1]所述的基因或其反義核酸導(dǎo)入細胞和/或組織內(nèi)，由此來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)和/或組織內(nèi)的神經(jīng)酰胺量。
圖2是含有神經(jīng)酰胺酶基因的DNA片斷的限制酶譜圖。
由此得到一驚人的發(fā)現(xiàn)，即本發(fā)明的來源于小鼠肝臟的中性/堿性神經(jīng)酰胺酶的氨基酸序列與假單胞菌屬細菌(綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))來源的已知堿性神經(jīng)酰胺酶[生物化學(xué)雜志，第273卷，第14368-14373頁(1998)]的氨基酸序列的同源性低。
本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶是首次探明的哺乳類來源的中性/堿性神經(jīng)酰胺酶。因此與眾所周知的假單胞菌屬細菌來源的已知堿性神經(jīng)酰胺酶相比，本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶對于闡明生物體內(nèi)神經(jīng)酰胺的功能、其代謝的調(diào)控、及在診斷和治療與神經(jīng)酰胺相關(guān)的疾病等開發(fā)應(yīng)用方面更有用。
以下，說明本發(fā)明。(1)具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽本說明書中“具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽”(本說明書中，有時可能描述為神經(jīng)酰胺酶)是具有如前所述的、將神經(jīng)酰胺水解成鞘氨基醇堿和脂肪酸活性的酶?！爸行?堿性神經(jīng)酰胺酶”是指最適pH處于比酸性區(qū)域高的區(qū)域的神經(jīng)酰胺酶。
作為一個例子，本發(fā)明中描述了分離純化出的小鼠肝臟來源的中性/堿性神經(jīng)酰胺酶的酶化學(xué)、物理化學(xué)性質(zhì)。
1.作用本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶水解神經(jīng)酰胺生成鞘氨基醇堿和脂肪酸。
該神經(jīng)酰胺酶的活性可按照生物化學(xué)雜志，第275卷，第3462-3468頁(2000)中所述的方法進行測定。即，將在20μl 25mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)中溶解了550pmol的C12-NBD-神經(jīng)酰胺[分析生化(Anal.Biochem.)，第263卷，第183-188頁(1998)]、1.0％(W/V)膽酸鈉及適量酶(神經(jīng)酰胺酶)的反應(yīng)混合液在37℃溫育30分鐘。在沸水浴中將反應(yīng)液保溫5分鐘，使反應(yīng)終止。再將所得反應(yīng)液減壓干燥。將干燥物溶解到氯仿/甲醇＝2/1(V/V)中，用硅膠薄層色譜(展開劑氯仿/甲醇/25％氨水＝90/20/0.5(V/V/V))展開。其后，用CS-9300色譜掃描儀(島津)，在激發(fā)波長475nm、熒光波長525nm處，對上述反應(yīng)中生成的C12-NBD-脂肪酸進行定量。該酶(神經(jīng)酰胺酶)的1單位(U)定義為，在上述條件下每1分鐘從C12-NBD-神經(jīng)酰胺水解釋放出1μmol C12-NBD-脂肪酸所需的酶量。
2.底物特異性脂肪酸部分用14C放射性同位素標記的100pmol各種神經(jīng)鞘脂置于含5mU本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶及1％膽酸鈉的25mM Tris-HCl(pH7.5)緩沖液20ml中，37℃作用24小時。用硅膠薄層色譜將反應(yīng)液展開后，用圖像分析儀BAS1000(富士膠卷公司制)檢測并定量14C-標記的神經(jīng)鞘脂與通過酶促反應(yīng)生成的14C-標記的脂肪酸，并通過所得數(shù)值計算出分解率。本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶的底物特異性如表1所示。
如表1所示，本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶的底物特異性為①水解各種N-?；窠?jīng)鞘氨醇；②對半乳糖基神經(jīng)酰胺、硫苷脂、GM1a、神經(jīng)鞘磷脂無作用；③相對于含二氫神經(jīng)鞘氨醇(d180)的神經(jīng)酰胺，對含神經(jīng)鞘氨醇(d181)的神經(jīng)酰胺作用更好；④對含植物鞘氨醇(t180)的神經(jīng)酰胺作用較難。
表1底物(結(jié)構(gòu))分解率(％)N-月桂酰基神經(jīng)鞘氨醇(C120/d180) 63N-棕櫚?；窠?jīng)鞘氨醇(C160/d180) 93N-硬脂酰基神經(jīng)鞘氨醇(C180/d180) 83N-棕櫚?；渖窠?jīng)鞘氨醇(C160/d180) 59N-硬脂酰基二氫神經(jīng)鞘氨醇(C180/d180) 40N-棕櫚?；参锴拾贝?C160/t180) 5N-硬脂酰基植物鞘氨醇(C180/t180) 2NBD-N-十二烷?；窠?jīng)鞘氨醇(NBD-C120/d181)97NBD-N-己?；窠?jīng)鞘氨醇(NBD-C60/d181) 2半乳糖基神經(jīng)酰胺(Galb1-1｀Cer) 0硫苷脂(HS03-3Galb1-1｀Cer) 0Gmla(Galb1-3GalNAcb1-4(NeuAca2-3)Galb1-4Glcb1-1｀Cer)0神經(jīng)鞘磷脂(磷酸膽堿Cer) 03.最適pH在20ml 3，3-二甲基戊二酸、50mM Tris(羥甲基)氨基甲烷、50mM 2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇中，加入100pmol C12-NBD-神經(jīng)酰胺和本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶16mU，37℃作用24小時。用硅膠薄層色譜將反應(yīng)液展開后，用CS-9300色譜掃描儀，在檢測波長525nm處，檢測并定量NBD-標記的神經(jīng)酰胺和通過酶促反應(yīng)生成的NBD-標記的脂肪酸，通過所得數(shù)值計算出分解率。


圖1表示C12-NBD-標記的神經(jīng)酰胺分解活性與pH的關(guān)系?？v軸為分解率(％)，橫軸為反應(yīng)pH。如
圖1所示，本神經(jīng)酰胺酶的最適pH為7.0-8.0。
4.溫度穩(wěn)定性在含有0.1％polidocanol(商品名Lubrol PX)的20mM Tris-HCl(pH7.5)緩沖液中，將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶37℃處理24小時，未見其活性降低；但在60℃處理1小時后，活性降低到處理前的約30％左右。
5.分子量通過SDS-PAGE(還原條件)測定的本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶分子量約為94kDa。用糖肽酶F消化該酶后，用SDS-PAGE(還原條件)測定的分子量約為73kDa。
作為本說明書中“具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽”的一個例子，例如具有序列表的序列號14所示的氨基酸序列、來源于小鼠的天然型神經(jīng)酰胺酶的多肽。另外，除具有該氨基酸序列的多肽之外，用上述方法進行活性測定時能確定具有同樣的神經(jīng)酰胺酶活性、且具有序列表的序列號14所示氨基酸序列中導(dǎo)入了1個以上氨基酸置換、缺失、添加、插入等突變的氨基酸序列的多肽也包括在“具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽”中。只要所得的多肽具有神經(jīng)酰胺酶活性，上述突變可以導(dǎo)入2種以上的突變。本說明書中“導(dǎo)入了突變的氨基酸序列”既包括人為誘變的氨基酸序列，也包括具有自發(fā)突變的氨基酸序列。
對于獲得具有突變的神經(jīng)酰胺酶，具體地如對后述的神經(jīng)酰胺酶基因的堿基序列(序列號15)中具有突變的突變基因，按如下步驟篩選出具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽(a)將上述基因的表達產(chǎn)物，在反應(yīng)混和液(組成20μl的25mM Tris-HCl緩沖液(pH6-9，優(yōu)選6.5-8.5，更優(yōu)選7-8，特別優(yōu)選7.5)、550pmol C12-NBD-神經(jīng)酰胺及1.0％(W/V)膽酸鈉)中，37℃溫育30分鐘，使之反應(yīng)的步驟；以及，(b)檢測所得反應(yīng)物中C12-NBD-脂肪酸的生成的步驟。(2)神經(jīng)酰胺酶基因本發(fā)明中神經(jīng)酰胺酶基因是具有編碼上述“具有神經(jīng)酰胺酶活性多肽”的核酸堿基序列的基因，或是含有該基因的堿基序列的核酸。例如，具有編碼序列表序列號14所示的氨基酸序列或其一部分構(gòu)成的多肽的核酸堿基序列的基因，及具有序列表序列號15所示的堿基序列或其一部分構(gòu)成的核酸堿基序列的基因，但本發(fā)明并不限定于此。如上所述，具有編碼序列表序列號14所示氨基酸序列的一部分構(gòu)成的多肽的核酸堿基序列的基因，或具有序列表序列號15所示堿基序列的一部分構(gòu)成的核酸堿基序列的基因，只要能編碼具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽，均包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些基因是小鼠肝臟來源的中性/堿性神經(jīng)酰胺酶的基因，但本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶基因來源沒有特殊限制，只要通過與上述(1)中所述的(a)和(b)同樣的步驟檢測出基因產(chǎn)物具有神經(jīng)酰胺酶活性即可。作為來源，如小鼠，大鼠，人，倉鼠，豚鼠等。
本說明書中“(氨基酸序列的)一部分構(gòu)成的多肽”是指通過上述(1)中所述的步驟(a)和(b)可檢測出具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽。
編碼具有同樣的神經(jīng)酰胺酶活性、且具有突變的神經(jīng)酰胺酶的基因也包含在本發(fā)明內(nèi)。例如，具有編碼序列表的序列號15所示氨基酸序列中導(dǎo)入了1個以上的氨基酸殘基置換、缺失、添加、插入等突變的氨基酸序列的核酸堿基序列的基因，只要該基因編碼的多肽具有神經(jīng)酰胺酶活性，那么也包含在本發(fā)明的基因內(nèi)。這種具有突變的天然來源的基因及人為制備的基因，只要是編碼具有中性/堿性神經(jīng)酰胺酶活性的多肽的基因，均包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
例如，可使用以下方法制備上述人為導(dǎo)入突變的基因。
導(dǎo)入隨機突變的方法有，例如應(yīng)用亞硫酸氫鈉進行化學(xué)處理將胞嘧啶堿基置換成尿嘧啶堿基的引起轉(zhuǎn)換突變的方法(美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，)第79卷，第1408-1412頁(1982))；在含錳的反應(yīng)液中進行PCR，并降低DNA合成時核苷酸摻入的準確率的方法(分析生化(Anal.Biochem.)，第224卷，第347-353頁(1995))等。
位點特異性突變的導(dǎo)入方法有，例如利用琥珀突變的方法(缺口雙鏈體(gapped duplex)法，核酸研究(Nucleic Acids Research)，第12卷，第9441-9456頁(1984))；利用缺失dut(dUTPase)和ung(尿嘧啶-DNA糖基化酶)基因的宿主的方法(Kunkel定位誘變法，美國國家科學(xué)院院刊，第82卷，第488-492頁(1985))；利用琥珀突變的PCR方法(國際公開第98/02535號小冊子)等。用這些方法將位點特異性突變導(dǎo)入目的基因的各種試劑盒已制成商品出售，通過利用這些試劑盒，可輕松地獲得導(dǎo)入了所要突變的基因。
另外，在嚴格條件下與上述核酸的互補鏈雜交、且具有編碼神經(jīng)酰胺酶活性多肽的核酸堿基序列的基因也包含在本發(fā)明的基因內(nèi)。神經(jīng)酰胺酶活性，例如可通過上述(1)中所述的步驟(a)和(b)進行檢測。
這里，“嚴格條件”是指以下條件。即在含0.5％SDS、5×Denhardt’s(Denhardt’s0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％Ficoll 400)及100μg/ml鮭魚精子DNA的6×SSC(1×SSC0.15M NaCl、0.015M檸檬酸鈉、pH7.0)中，50℃溫育4小時至一晚。
另外，雜交操作詳細描述于，如1989年冷泉港實驗室(ColdSpring Harbor Laboratory)發(fā)行，T.Maniatis等編著的，分子克隆實驗指南第2版(Molecular CloningA Laboratory Manual2nd ed.)等。
通過簡并基因密碼子，與上述核酸具有不同堿基序列的基因也包含在本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶基因內(nèi)。
由本發(fā)明的基因所編碼的多肽，若能通過上述(1)所述的步驟(a)和(b)檢測出具有神經(jīng)酰胺酶活性，就包含在本發(fā)明內(nèi)。
由本發(fā)明的基因還可提供適于不同使用目的的重組DNA。這里，“重組DNA”指通過基因工程學(xué)手段得到的含有本發(fā)明基因的DNA。
可將含有本發(fā)明神經(jīng)酰胺酶基因的重組DNA連接到眾所周知的載體上，進而構(gòu)建可表達神經(jīng)酰胺酶基因的表達載體。該表達載體也包含在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明中，表達載體是插入了上述基因或重組DNA、且可在所希望的宿主細胞內(nèi)進行表達的載體。另外，插入了下述反義DNA的載體也包含在本發(fā)明的載體內(nèi)。作為用于構(gòu)建表達載體的載體，例如質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體等。pUC18、pUC19、pBluescript、pET等市售品適用于作為質(zhì)粒載體，λgt10、λgt11等λ噬菌體載體市售品適用于作為噬菌體載體，但并不限定于此。可使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、牛痘病毒載體、腺伴隨病毒載體等作為病毒載體，但并不限定于此?？筛鶕?jù)應(yīng)用的宿主細胞適當(dāng)?shù)倪x用載體。這些載體可適宜含有可誘導(dǎo)的啟動子、選擇性標記基因、終止子等因子。
另外，為了簡化分離純化過程，根據(jù)使用目的分別可應(yīng)用具有His-tag、GST融合蛋白表達序列的載體。此時，可應(yīng)用具有在宿主細胞內(nèi)可發(fā)揮一定功能的適當(dāng)?shù)膯幼?例如lac，tac、trc、trp、CMV、SV40早期啟動子等)的GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)融合蛋白質(zhì)載體(例如，pGEX4T)，和具有tag序列(例如Myc，HisA等)的載體等。(3)含有神經(jīng)酰胺酶基因的轉(zhuǎn)化體用插入了本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶基因的表達載體進行宿主的轉(zhuǎn)化，由此得到本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，即得到表達本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶基因的細胞。使用的宿主可根據(jù)所希望的神經(jīng)酰胺酶的使用目的進行適當(dāng)選擇。可應(yīng)用以大腸桿菌為代表的微生物，之外如酵母、動物細胞、植物細胞、動物個體、植物個體等。具體而言，大腸桿菌可應(yīng)用大腸桿菌K-12系統(tǒng)的HB101株、C600株、JM109株、DH5α株、DH10B株、XL-1BlueMRF’株、TOP10F株等。酵母細胞如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。動物細胞如L，3T3、FM3A、CHO、COS、Vero、Hela等。植物細胞如煙草BY2等。
作為將表達載體導(dǎo)入宿主的方法，例如可應(yīng)用分子克隆實驗指南第2版，第249-254頁所述的方法。然后，利用表達載體的特性篩選表達目的基因的轉(zhuǎn)化體。例如質(zhì)粒載體為pBluescript、大腸桿菌作宿主細胞時，在含有氨芐青霉素的平皿上篩選具有氨芐青霉素抗性的菌落，或在含有氨芐青霉素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)及異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的平皿上篩選氨芐青霉素抗性且呈現(xiàn)白色的菌落，并以此來篩選導(dǎo)入了外源基因的菌落。
本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)可在通常所用的條件下進行，并生產(chǎn)具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽。因表達本發(fā)明基因的宿主對密碼子的使用頻率不同，有時可能會出現(xiàn)抑制表達的現(xiàn)象。此時，可將本發(fā)明的基因所使用的密碼子分別替換成各個宿主慣用的密碼子。另外，上述表達載體不只限于來源于質(zhì)粒的載體，只要不妨礙本發(fā)明的目的，可應(yīng)用來源于噬菌體、粘粒的載體。為了輕松且大量地制備本發(fā)明的多肽，優(yōu)選應(yīng)用可誘導(dǎo)表達外源基因的載體，以及可與報道基因產(chǎn)物以融合蛋白的形式表達的載體。
可通過測定神經(jīng)酰胺酶的活性檢測神經(jīng)酰胺酶的表達?；钚詼y定可將轉(zhuǎn)化體的細胞提取液作為樣品，并按照生物化學(xué)雜志，第275卷，第3462-3468頁(2000)中所述的方法，例如進行與上述(1)所述的步驟(a)和(b)同樣的操作。另外，通過測定細胞內(nèi)的神經(jīng)酰胺量也可檢測神經(jīng)酰胺酶的表達。上述神經(jīng)酰胺量的測定可按照分析生化(Analytical Biochemistry)，第244卷，第291-300頁(1997)中所述的方法進行。另外，也可使用神經(jīng)酰胺酶抗體。當(dāng)神經(jīng)酰胺酶與其它多肽(本發(fā)明神經(jīng)酰胺酶之外的多肽)以融合體形式表達時，可使用針對其多肽(本發(fā)明神經(jīng)酰胺酶之外的多肽)部分的抗體。使用抗體時可這樣進行檢測，如將轉(zhuǎn)化體的細胞提取液進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移印跡到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并在膜上用抗體進行檢測。(4)具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽的制備方法本發(fā)明還提供具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽的制備方法，該方法是在適于表達本發(fā)明的基因、且適于生產(chǎn)該基因編碼的多肽的條件下，培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體，并從所得培養(yǎng)物中提取具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽。轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)方法無特殊限制，可從適合于所使用宿主的已知的培養(yǎng)方法中適當(dāng)選擇。
本發(fā)明的制備方法中，上述轉(zhuǎn)化體為微生物或培養(yǎng)細胞時，通過確定培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、誘導(dǎo)劑的使用量、使用時間等神經(jīng)酰胺酶表達的最佳條件，可有效地生產(chǎn)神經(jīng)酰胺酶。
可應(yīng)用常規(guī)方法從轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中純化神經(jīng)酰胺酶。轉(zhuǎn)化體如大腸桿菌那樣將神經(jīng)酰胺酶蓄積在細胞內(nèi)時，可在培養(yǎng)終止后，通過離心收集轉(zhuǎn)化體細胞，所得細胞用超聲波處理等破碎后，通過離心得到無細胞提取液。以此作為原始材料，用鹽析法、之外如離子交換、凝膠過濾、疏水性、親和性等各種色譜方法等一般性的蛋白質(zhì)純化方法進行純化。根據(jù)所用的宿主-載體體系，當(dāng)表達產(chǎn)物分泌在細胞外時，可由培養(yǎng)上清同樣進行純化。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，該神經(jīng)酰胺酶在細胞內(nèi)生產(chǎn)時，目的物神經(jīng)酰胺酶與細胞內(nèi)的各種酶、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)共存，但這些雜質(zhì)與表達的神經(jīng)酰胺酶量相比，其量甚微，所以神經(jīng)酰胺酶的純化極其容易，這也是本發(fā)明制備方法的優(yōu)點。另外，應(yīng)用細胞外分泌型載體作為載體時，神經(jīng)酰胺酶分泌于細胞外，神經(jīng)酰胺酶的組分中含有培養(yǎng)基成分。但是，由于其中基本不含有妨礙通常的神經(jīng)酰胺酶純化的蛋白質(zhì)成分，所以有利的一點是沒必要進行象從小鼠肝臟中純化神經(jīng)酰胺酶那樣必要而又復(fù)雜的分離純化操作。
另外，真核生物來源的神經(jīng)酰胺酶自身可具有糖鏈，應(yīng)用無糖鏈生物合成能力的細胞作宿主細胞時，例如應(yīng)用大腸桿菌、枯草菌、放線菌等原核生物，或應(yīng)用酵母、真菌、動物細胞、昆蟲細胞及植物細胞等的失去糖鏈生物合成能力的突變細胞時，可制備出具有神經(jīng)酰胺酶活性而沒有糖鏈的多肽。另外，也可生產(chǎn)出具有糖鏈的酶，此時應(yīng)用具有糖鏈生物合成能力的細胞作宿主細胞，例如應(yīng)用酵母、真菌、動物細胞、昆蟲細胞及植物細胞等可制備出具有神經(jīng)酰胺酶活性且具有糖鏈的多肽。
另外，根據(jù)由于所用宿主-載體體系不同，有時表達產(chǎn)物可形成不溶性包涵體(inclusion body)。這種情況下，在培養(yǎng)結(jié)束后通過離心收集細胞，用超聲波處理等破碎細胞后，通過離心等方法收集含有包涵體的不溶性組分。將包涵體洗滌后，應(yīng)用通常用的蛋白質(zhì)助溶劑，如尿素和鹽酸胍等使之溶解，必要時通過離子交換、凝膠過濾、疏水性、親和性等各種色譜將之進行純化，然后應(yīng)用透析法或稀釋法等進行重折疊操作，得到含有保持神經(jīng)酰胺酶活性的多肽的標準品。必要時將該標準品再通過各種色譜進行純化，可得到高純度的且具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽。(5)雜交用探針及PCR用引物本發(fā)明的寡核苷酸探針或引物可與本發(fā)明的基因或其互補鏈特異性雜交。該寡核苷酸探針或引物是以本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶基因的堿基序列為基礎(chǔ)設(shè)計的，例如可用常規(guī)方法進行化學(xué)合成。該寡核苷酸探針的堿基序列無特殊限制，只要在嚴格條件下能與上述神經(jīng)酰胺酶基因、或具有該基因互補堿基序列的核酸雜交即可。上述“嚴格條件”無特殊限制，例如在含6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt、100mg/ml鮭魚精子DNA的溶液中，在(上述探針的Tm-25℃)溫度下保溫一晚。對上述引物的堿基序列也無特殊限制，只要在通常的PCR反應(yīng)條件下能與上述神經(jīng)酰胺酶基因、或具有該基因互補堿基序列的基因退火雜合，并通過DNA聚合酶能起始延伸反應(yīng)即可。
寡核苷酸探針或引物的Tm值，例如可通過以下式子計算Tm＝81.5-16.6(log10〔Na+〕)+0.41(％G+C)-(600/N)(式中，N為寡核苷酸探針或引物的鏈長，％G+C為寡核苷酸探針或引物中的鳥嘌呤和胞嘧啶殘基的含量)另外，當(dāng)寡核苷酸探針或引物的鏈長短于18個堿基時，Tm值例如通過A+T(腺嘌呤+胸腺嘧啶)殘基的含量與2℃的積與G+C殘基的含量與4℃的積的和〔(A+T)×2+(G+C)×4〕進行推算。
上述寡核苷酸探針的鏈長無特殊限制，但從防止非特異性雜交的觀點出發(fā)，優(yōu)選在15個堿基以上，更優(yōu)選在18個堿基以上。
另外，本發(fā)明的引物可以是與上述寡核苷酸探針具有相同堿基序列的核酸。例如，可以本發(fā)明基因的堿基序列為基礎(chǔ)進行設(shè)計，并通過化學(xué)合成等方法進行制備。引物的長度無特殊限制，例如可使用15-40個堿基數(shù)的引物，特別優(yōu)選17-30個堿基數(shù)的引物。上述引物可用于以PCR為代表的各種基因擴增法，并由此可進行本發(fā)明神經(jīng)酰胺酶基因的檢測。
另外，作為上述寡核苷酸探針或引物，也可應(yīng)用經(jīng)限制酶處理、核酸外切酶處理等酶處理，超聲波等物理處理而使天然來源的編碼神經(jīng)酰胺酶的核酸片斷化后，將所得片斷通過以瓊脂糖為代表的各種核酸分離法進行純化而得到的核酸。上述所得的核酸最好是來源于具有神經(jīng)酰胺酶特征性序列的區(qū)域。
再者，為了使上述寡核苷酸探針或引物能更容易地檢測出檢測對象的核酸，可用已知的方法將核酸進行適當(dāng)標記后，再用于本發(fā)明神經(jīng)酰胺酶基因的檢測。標記無特殊限制，除放射性同位素以外，可應(yīng)用熒光物質(zhì)、生物素和洋地黃毒苷等配體為代表的各種標記。
應(yīng)用本發(fā)明的雜交用探針，通過篩選小鼠肝臟以外的臟器或小鼠以外生物體來源的基因組DNA或cDNA、或基因組DNA文庫或cDNA文庫，可克隆出與本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶基因具有高度同源性的DNA。
另外，應(yīng)用本發(fā)明的引物，通過PCR方法，可從小鼠肝臟以外的臟器或小鼠以外生物體來源的基因組DNA或cDNA、或基因組DNA文庫或cDNA文庫檢測出與本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶基因具有高度同源性的DNA片斷，并且可得到其全長基因。(6)基因的檢測方法本發(fā)明基因的檢測方法的一個顯著特征是使用上述寡核苷酸探針和/或引物檢測待檢樣品中的基因。
本發(fā)明的檢測方法中，既可應(yīng)用上述寡核苷酸探針，通過雜交法等進行基因的檢測；也可應(yīng)用上述引物，通過PCR等DNA擴增方法進行基因的檢測。
應(yīng)用寡核苷酸探針進行雜交時，作為待檢測用的樣品，如微生物的菌落和培養(yǎng)細胞、組織切片等樣品，將這些樣品中的DNA和RNA固定到膜上的樣品，從這些樣品中提取出的DNA和RNA等。
雜交可按照分子克隆實驗指南第2版等中所述的已知方法進行。雜交條件可根據(jù)所用探針的Tm值、目的DNA的GC含量等適當(dāng)選定。例如可應(yīng)用上述分子克隆實驗指南第2版等所述的條件。
應(yīng)用引物來檢測基因時，作為待檢測用的樣品，如微生物培養(yǎng)液、微生物菌落、微生物菌體等微生物樣品，培養(yǎng)細胞、組織、組織切片等活體來源的樣品等。這些樣品可直接應(yīng)用分離的微生物和培養(yǎng)細胞，亦可應(yīng)用經(jīng)過適當(dāng)處置的上述微生物和培養(yǎng)物。另外，象組織這樣的固體樣品可制成浸出液和懸濁液使用。另外，也可使用這些樣品的上清、或經(jīng)表面活性劑處理等細胞溶解處理的樣品及其上清。此外，在不損害作為檢測對象的核酸的情況下，可進行除去樣品中其它成分的操作。
應(yīng)用上述引物通過PCR進行檢測時，PCR的條件要根據(jù)所用引物的Tm值、擴增并檢測的檢測對象區(qū)域的長度等進行適當(dāng)選擇。PCR法可通過確認有無擴增產(chǎn)物來檢測目的基因。有無擴增產(chǎn)物的確認無特殊限制，可通過將核酸擴增反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳后，將凝膠用適當(dāng)?shù)暮怂崛旧噭?，如用溴化乙錠、SYBER綠I(SYBER GreenI)等進行染色，后經(jīng)紫外線照射檢測有無條帶產(chǎn)生來確認。條帶的檢測可用肉眼觀察，也可用熒光成像分析儀(Fluorescent imageanalyzer)等進行檢測。
本發(fā)明的基因檢測方法中，為了提高檢測靈敏度，可聯(lián)合應(yīng)用上述探針和引物。例如應(yīng)用上述引物，通過PCR法擴增樣品中微量存在的神經(jīng)酰胺酶基因，然后用探針與該基因雜交，由此可高靈敏度且正確地進行檢測。
應(yīng)用本發(fā)明的基因檢測方法進行神經(jīng)酰胺酶基因的檢測，進而確定該基因的量時，可通過對來自雜交探針的信號強度、及應(yīng)用引物進行擴增的產(chǎn)物產(chǎn)生的條帶的熒光強度等的定量來進行。此外，通過以mRNA為測定對象進行定量，可檢測目的基因的表達量。
本發(fā)明的檢測方法中，通過使用本發(fā)明基因的檢測試劑盒可更為簡便地進行。該試劑盒也包括在本發(fā)明內(nèi)。該試劑盒的一個特征是含有上述寡核苷酸探針和/或上述引物。該試劑盒可含有檢測操作中所使用的各種成分，例如包含寡核苷酸探針的試劑盒中可含有用于固定核酸的膜和雜交緩沖液等雜交用各種試劑；包含引物的試劑盒中可含有耐熱性DNA聚合酶、dNTP混和液、PCR用緩沖液等PCR用試劑。還可含有探針和用于檢測擴增出的DNA的試劑和微生物增殖用的培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，用于從樣品中抽提核酸的試劑等。(7)與具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽特異性結(jié)合的抗體或其片斷與本發(fā)明的多肽特異性結(jié)合的抗體或其片斷無特別限制，可以是多克隆抗體也可是單克隆抗體，只要具有與該多肽特異性結(jié)合的能力即可。還可使用經(jīng)已知技術(shù)修飾過的抗體和抗體衍生物，例如人源化抗體、Fab片斷、單鏈抗體等。本發(fā)明抗體的制備很容易，例如參照1992年John Wiely&Sons.Inc公司發(fā)行，John E.Coligan編著的現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)(Current Protocols in Immunology)中所述的方法，用本發(fā)明多肽的全部或一部分免疫兔子、大鼠、小鼠等。將得到的抗體純化后，經(jīng)過肽酶等處理得到抗體片斷。另外，也可制備基因工程學(xué)抗體。再者，為了便于用酶免疫測定法、熒光免疫測定法、發(fā)光免疫測定法等進行檢測，可對本發(fā)明的抗體或其片斷進行各種修飾。
上述抗體或其片斷中還包括與多肽的某一部分片斷特異性結(jié)合的抗體或抗體片斷。
所得抗體或其片斷的用途有，神經(jīng)酰胺酶生產(chǎn)菌的檢測、神經(jīng)酰胺酶表達細胞株的檢測、培養(yǎng)細胞和組織中神經(jīng)酰胺酶蛋白質(zhì)的檢測、親和色譜、各種文庫(基因組DNA或cDNA)表達產(chǎn)物的篩選、醫(yī)藥、診斷藥、研究用試劑等方面的應(yīng)用。(8)多肽的檢測方法本發(fā)明多肽的檢測方法的特征為，使用上述抗體或其片斷檢測出具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽。
作為本發(fā)明中可應(yīng)用的檢測用樣品，例如微生物和動物細胞的培養(yǎng)物，組織切片，微生物和動物細胞的細胞破碎物，皮膚等組織的提取液或洗滌液，固定了微生物和動物細胞、組織來源的蛋白質(zhì)的膜等蛋白質(zhì)樣品。
抗體或其片斷與上述多肽特異性結(jié)合的檢測可用已知的方法，例如酶免疫測定法、熒光免疫測定法、發(fā)光免疫測定法等。
本發(fā)明多肽的檢測方法，可通過應(yīng)用本發(fā)明多肽的檢測試劑盒進行更為簡便地測定。該試劑盒也包括在本發(fā)明內(nèi)。該試劑盒的特征是含有上述抗體或其片斷。另外，該試劑盒還可含有反應(yīng)用緩沖液、標記的二抗、顯色試劑等。(9)反義DNA和反義RNA本發(fā)明中的“反義DNA”和“反義RNA”是指具有與本發(fā)明神經(jīng)酰胺酶基因或其一部分互補的堿基序列，通過與內(nèi)源性的神經(jīng)酰胺酶基因(基因組DNA和mRNA)形成雙鏈抑制或調(diào)控該基因信號表達(轉(zhuǎn)錄、翻譯)的DNA或RNA。反義DNA或反義RNA的長度可根據(jù)堿基序列的特異性和導(dǎo)入細胞內(nèi)的方法而改變。反義DNA或反義RNA可用合成儀人工合成，或通過以本發(fā)明基因為模板的酶反應(yīng)，并使之按與通常相反的方向(反義方向)表達基因來制備。想在生物體內(nèi)表達反義RNA時，將本發(fā)明基因按與通常相反的方向連接到表達載體上，并將之導(dǎo)入生物體內(nèi)即可。
例如，應(yīng)用tat基因〔核酸研究，第19卷，第3359-3368頁(1991)〕、或rev基因〔美國國家科學(xué)院院刊，第86卷，第4244-4248頁(1989)〕的HIV增殖抑制等反義技術(shù)已知有許多，因此通過這些方法，應(yīng)用本發(fā)明的反義DNA和反義RNA，可抑制或調(diào)控內(nèi)源性神經(jīng)酰胺酶基因的表達。另外，本發(fā)明的反義DNA和反義RNA可作為原位雜交等的研究試劑使用。(10)應(yīng)用神經(jīng)酰胺酶基因或其反義核酸調(diào)節(jié)細胞內(nèi)或組織內(nèi)的神經(jīng)酰胺量應(yīng)用本發(fā)明的基因，還可提供細胞內(nèi)和/或組織內(nèi)神經(jīng)酰胺量的調(diào)節(jié)方法。該調(diào)節(jié)方法也包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的細胞內(nèi)和/或組織內(nèi)神經(jīng)酰胺量的調(diào)節(jié)方法的一個特征是，將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶基因?qū)爰毎麅?nèi)和/或組織內(nèi)，并由此調(diào)節(jié)細胞內(nèi)和/或組織內(nèi)的神經(jīng)酰胺量。
也就是說，本發(fā)明的調(diào)節(jié)方法中將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶基因?qū)爰毎蚪M織內(nèi)，通過該基因表達產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺酶，分解細胞或組織內(nèi)的神經(jīng)酰胺；另一方面，通過將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶基因?qū)爰毎蚪M織內(nèi)，促使該基因的反義核酸、如反義RNA的生成，并由此降低該細胞或組織內(nèi)的神經(jīng)酰胺酶活性及抑制神經(jīng)酰胺的分解。另外，抑制神經(jīng)酰胺的量時，可將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶基因的反義核酸、即本發(fā)明的反義DNA或反義RNA直接導(dǎo)入細胞或組織內(nèi)。
可使用已知的方法將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶基因或其反義核酸導(dǎo)入細胞或組織內(nèi)，如可利用電穿孔法、基因槍法等物理的基因?qū)敕椒?，及?yīng)用病毒載體的基因?qū)敕椒ā１景l(fā)明的方法中使用的病毒載體無特殊限制，例如可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、牛痘病毒載體、腺伴隨病毒載體等。
根據(jù)本發(fā)明的調(diào)節(jié)方法，將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶基因或其反義核酸導(dǎo)入細胞和/或組織內(nèi)，通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)和/或組織內(nèi)的神經(jīng)酰胺量，可有效地進行因神經(jīng)酰胺量異常引起的疾病的治療，另外可制作神經(jīng)酰胺代謝異常疾病的動物模型。“因神經(jīng)酰胺量異常引起的疾病”無特殊限制，例如法貝爾病(Farber’s disease)等。
以下，對小鼠肝臟來源的神經(jīng)酰胺酶基因的獲得方法進行說明。
1)首先，由小鼠肝臟勻漿中制備出膜組分，將之懸浮到蔗糖-EDTA溶液中，凍融后，離心得到上清(粗酶提取液)。應(yīng)用已知的蛋白質(zhì)純化方法，例如組合應(yīng)用各種色譜方法，由粗酶提取液得到單一狀態(tài)的純化的神經(jīng)酰胺酶標準品。上述純化中可使用的色譜方法有陰離子交換色譜、疏水色譜、螯合色譜、凝膠過濾色譜等。
2)然后，檢測神經(jīng)酰胺酶的部分氨基酸序列，作為制備克隆神經(jīng)酰胺酶基因時的探針的信息。將上述純化的神經(jīng)酰胺酶標準品直接用埃德曼(Edman)降解法〔生物化學(xué)雜志，第256卷，第7990-7997頁(1981)〕進行的氨基酸序列分析，由此得知神經(jīng)酰胺酶N末端的氨基酸序列。另外，用底物特異性高的蛋白酶，例如賴氨酰內(nèi)肽酶(lysyl endopeptidase)和N-甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)-胰蛋白酶等消化純化的酶標準品，從得到的肽混合物中純化適當(dāng)?shù)碾钠瑪啵瑢υ撈瑪噙M行氨基酸序列分析，從而得到神經(jīng)酰胺酶內(nèi)部的部分氨基酸序列。
3)以這樣得到的氨基酸序列信息為基礎(chǔ)，設(shè)計雜交用的探針或作為PCR引物用的寡核苷酸，并克隆本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶基因。此時，可應(yīng)用一般的PCR或雜交方法。PCR方法可按照1989年Stockton Press公司發(fā)行，Erlich，H.A.編著的PCR技術(shù)(PCR Technology)中所述的方法進行。雜交方法可按照分子克隆實驗指南，第2版中所述的方法進行。
4)對上述雜交或PCR所得DNA片斷，解讀其堿基序列，得到其編碼的氨基酸序列。將該序列與上述2)中得到的神經(jīng)酰胺酶的部分氨基酸序列相比較，確定上述DNA片斷是否為神經(jīng)酰胺酶基因的片斷。
5)當(dāng)3)中雜交或PCR所得DNA片斷為神經(jīng)酰胺酶基因的一部分時，重復(fù)3)的操作，或者以3)中得到的DNA片斷的堿基序列為基礎(chǔ)制備新的探針和引物，并使用它們進行雜交或進行PCR，得到包含編碼完整神經(jīng)酰胺酶的基因的DNA片斷。
6)將得到的編碼完整神經(jīng)酰胺酶的基因連接到適當(dāng)?shù)妮d體，構(gòu)建表達載體，并制備導(dǎo)入了該表達載體的轉(zhuǎn)化體。培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，檢測培養(yǎng)物中的神經(jīng)酰胺酶活性，以確認所得基因編碼神經(jīng)酰胺酶。
但是，在本發(fā)明神經(jīng)酰胺酶基因的克隆中，由本發(fā)明中得到的部分氨基酸序列信息不能設(shè)計出適用于雜交法文庫篩選的探針DNA。另外，基于部分氨基酸序列以及制備文庫所用的各種載體的堿基序列設(shè)計了多種PCR引物，并用其各種組合進行了PCR，但未見特異性擴增，唯有以部分氨基酸序列C-53(序列表的序列號3中所示的C-53氨基酸序列)為基礎(chǔ)設(shè)計的2種引物對組合進行PCR時見到擴增。但擴增的DNA片斷P-1(序列表的序列號6中所示的P-1堿基序列)為68bp的短片斷，不能直接用作于雜交法文庫篩選的探針。于是由P-1序列再設(shè)計PCR引物，同時由制備文庫所使用的載體的堿基序列設(shè)計引物，二者組合進行PCR，由此首次得到了適于作為雜交法文庫篩選用探針的335bp的基因片斷。
以上述335bp的DNA片斷為探針，篩選小鼠肝臟來源的cDNA文庫，從而可克隆出編碼完整神經(jīng)酰胺酶的基因。另外，通過篩選小鼠肝臟來源的基因組DNA文庫，可得到本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶的基因組DNA。
上述所得小鼠肝臟產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺酶基因的全長堿基序列描述于序列表的序列號12中，它所編碼的多肽的氨基酸序列描述于序列表的序列號13中。由該氨基酸序列與該酶的N末端氨基酸序列可以判斷，生物體內(nèi)該酶被加工成去除了N末端部分肽段的成熟型酶。該成熟型酶的氨基酸序列以及編碼該序列的堿基序列分別顯示于序列表的序列號14和15中。上述氨基酸序列、堿基序列與已知的哺乳類來源的神經(jīng)酰胺酶的氨基酸序列、堿基序列彼此之間無同源性。也就是說，本發(fā)明所提供的神經(jīng)酰胺酶基因與已知的神經(jīng)酰胺酶基因之間無關(guān)系，是全新的序列。
如此，本發(fā)明提供小鼠肝臟來源的神經(jīng)酰胺酶的一級結(jié)構(gòu)和基因結(jié)構(gòu)。另外，還可提供具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽的廉價、高純度的基因工程學(xué)制備方法。
另外，與本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶基因特異性雜交的寡核苷酸探針或引物可用于本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶基因的檢索、檢測和擴增等。與本發(fā)明的多肽特異性結(jié)合的抗體或其片斷可用于神經(jīng)酰胺酶的檢測、鑒定和純化等。
再者，根據(jù)本發(fā)明的細胞內(nèi)和/或組織內(nèi)神經(jīng)酰胺量的調(diào)節(jié)方法，將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶基因或其反義核酸導(dǎo)入細胞和/或組織內(nèi)，可調(diào)節(jié)細胞和/或組織內(nèi)的神經(jīng)酰胺量，所以該調(diào)節(jié)方法可用于因神經(jīng)酰胺量異常引起的疾病的治療，如法貝爾病等疾病的治療，然而對適合用該調(diào)節(jié)方法治療的疾病并無特殊限制。
以下通過實施例，再對本發(fā)明進行詳細說明，但本發(fā)明并不限定于實施例的范圍。實施例1神經(jīng)酰胺酶的純化從105只Sea/ddY小鼠(成和實驗動物研究所制)中摘出的肝臟181g，在300ml含1mM EDTA的0.25M蔗糖溶液(蔗糖-EDTA溶液)中勻漿。將該勻漿600×g離心10分鐘，回收上清。將所得上清再2700×g離心30分鐘，回收沉淀。
將沉淀組分懸浮于480ml蔗糖-EDTA溶液中，得到懸浮液。將所得懸浮液-80℃冷凍后，置于循環(huán)水中融化。反復(fù)凍融處理2次。然后將處理的懸浮液105000×g離心90分鐘，分別回收上清及沉淀。沉淀部分再進行上述冷凍、融化-離心處理。將回收的上清與先前回收的上清合并，得到520ml的粗酶提取液。
將260ml粗提取液上樣到預(yù)先用20mM磷酸緩沖液(pH7.0)平衡過的100ml DEAE-SepharoseFF(Amersham Pharmacia公司制)柱，洗去非吸附物質(zhì)。接著用含1M NaCl的同一種緩沖液進行洗脫，回收神經(jīng)酰胺酶活性組分160ml。將該組分隨后上樣到預(yù)先用含1M NaCl的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡過的100ml苯基-SepharoseFF(Amersham Pharmacia公司制)柱，然后用2M-0M NaCl濃度梯度進行洗脫，再用0％-1％的Polidocanol(商品名LubrolPX，Nakalai Tesque公司制)濃度梯度進行洗脫。由該層析過程回收到310ml神經(jīng)酰胺酶活性組分。
將所得活性組分上樣到預(yù)先用含0.5M NaCl和0.1％Lubrol PX的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡過的25ml螯合型-SepharoseFF(Amersham Pharmacia公司制，Cu2+結(jié)合型)柱。用同一種緩沖液和含0.1％Lubrol PX的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗柱，然后用含2M NH4Cl、0.1％Lubrol PX的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)將酶洗脫出。通過超濾濃縮洗脫出的活性組分，得到濃縮物。然后將濃縮物中的緩沖液替換成含0.1％Lubrol PX的20mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)，得到酶溶液。再將所得酶溶液30ml上樣到用含0.1％Lubrol PX的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡過的porous HQ柱(φ4.6×100mm，Perceptive Biosystems公司制)，然后用0M-0.5M NaCl濃度梯度進行洗脫，得到活性組分。將該活性組分上樣到用含0.2M NaCl、0.1％Lubrol PX的1mM磷酸緩沖液(pH7.0)平衡過的羥基磷灰石(φ7.5×100mm，PENTAX公司制)柱。神經(jīng)酰胺酶不吸附到該柱上，因此從不保留的洗脫組分中回收。然后將該組分上樣到用含0.2M NaCl、0.3％Lubrol PX的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡過的Superose 200HR柱(φ10×300mm，AmershamPharmacia公司制)，進行凝膠過濾色譜，得到純化的神經(jīng)酰胺酶。以上操作的結(jié)果，得到58mg純化的神經(jīng)酰胺酶標準品。
對所得純化神經(jīng)酰胺酶標準品的各種性質(zhì)，按照本說明書中所述的那樣進行檢測的結(jié)果，其性質(zhì)如下。
作用水解神經(jīng)酰胺生成鞘氨基醇堿和脂肪酸。
底物特異性具有上述表1所示的底物特異性。
最適pH結(jié)果如
圖1所示，該酶的最適pH為7.0-8.0。
溫度穩(wěn)定性含0.1％Polidocanol(商品名Lubrol PX)的20mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)中，37℃處理24小時時，未見活性下降；但60℃處理1小時時，活性降低到處理前的約30％左右。
分子量SDS-PAGE(還原條件下)測定約94kDa。用糖肽酶F消化后，SDS-PAGE(還原條件下)測定約73kDa。實施例2神經(jīng)酰胺酶的部分氨基酸序列分析向含50pmol神經(jīng)酰胺酶的樣品溶液11ml中加入含0.3％LubrolPX的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)。所得樣品溶液上樣到Mono QPCl 6/5(100μl，Amersham Pharmacia公司制)柱。然后用含0.4MNaCl的同一種緩沖液洗脫吸附到柱上的神經(jīng)酰胺酶組分。通過該操作，將含神經(jīng)酰胺酶的組分濃縮到50μl。將所得濃縮液進行SDS-PAGE凝膠電泳，用GelCode Blue染色劑(Pirece公司制)對電泳后的膠進行染色。然后切出神經(jīng)酰胺酶的條帶。用含0.1％SDS的300μl 0.1M Tris-HCl緩沖液(pH9.0)，于37℃將切出的膠帶的1/4部分抽提16小時。將所得抽提液作為樣品，用G1005A蛋白質(zhì)測序系統(tǒng)(Hewlett-Packard公司制)進行神經(jīng)酰胺酶N末端氨基酸序列分析，確定氨基酸序列的N末端。序列表的序列號1中顯示了N末端的氨基酸序列。
另外，將切出的膠帶的剩余3/4部分在1ml 0.5M Tris-HCl緩沖液(pH9.2)/50％乙腈中，30℃洗滌45分鐘。用氮氣及離心濃縮機(Centrifugal Concentrator)將膠完全干燥后，加入含0.5μg蛋白酶Lys-C(和光純藥社制)的10μl 0.5M Tris-HCl緩沖液(pH9.2)，再加入0.1M Tris-HCl緩沖液(pH9.2)直到膠帶完全脹潤，37℃保溫16小時，進行神經(jīng)酰胺酶的蛋白酶消化。反應(yīng)結(jié)束后，用150μl 0.1％三氟乙酸/60％乙腈室溫抽提1小時，該操作進行2次，回收抽提液。將該抽提液上樣給反相色譜，進行肽片斷的純化。通過G1005A蛋白質(zhì)測序系統(tǒng)的埃德曼降解法，對所得肽片斷進行分析，確定部分氨基酸序列C-46、C-53。序列表的序列號2、3中分別顯示了C-46、C-53的氨基酸序列。實施例3用PCR法擴增含神經(jīng)酰胺酶基因的DNA片斷以實施例2中確定的神經(jīng)酰胺酶的部分氨基酸序列C-53為基礎(chǔ)，設(shè)計正向引物53-S1、反向引物53-A3，并用DNA合成儀進行合成。序列表的序列號4、5中分別顯示了引物53-S1、53-A3的堿基序列。用這些引物進行PCR。PCR以小鼠肝臟cDNA質(zhì)粒文庫(寶酒造社制)為模板進行。PCR反應(yīng)條件是94℃9分鐘后，以94℃0.5分鐘、51℃0.5分鐘、72℃1分鐘為一個循環(huán)，進行40個循環(huán)，再于72℃保溫7分鐘。通過該PCR，用瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約70bp的特異性擴增DNA片斷。
從膠中回收該擴增DNA，將它整合到pGEM-Teasy載體(Promega公司制)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。分析該質(zhì)粒中插入的DNA片斷的堿基序列，確定出該片斷的部分堿基序列P-1。序列表的序列號6中顯示了P-1的堿基序列。該序列是與實施例2中確定的神經(jīng)酰胺酶的部分氨基酸序列C-53相對應(yīng)的序列，由此確認獲得了目的基因神經(jīng)酰胺酶基因的一部分。
以P-1的堿基序列為基礎(chǔ)設(shè)計反向引物MA1和MA2，并進行合成。序列表的序列號7、8中分別顯示了引物MA1和MA2的堿基序列。另外，以用于構(gòu)建小鼠肝臟cDNA質(zhì)粒文庫的載體pAP3neo的堿基序列為基礎(chǔ)設(shè)計正向引物T7in和T7out，并進行合成。序列表的序列號9、10中分別顯示了引物T7in和T7out的堿基序列。用這些引物，以小鼠肝臟cDNA文庫為模板，進行巢式PCR。第一次PCR首先使用正向引物T7out和反向引物MA2，反應(yīng)條件是94℃ 9分鐘后，以94℃0.5分鐘、51℃0.5分鐘、72℃2分鐘為一個循環(huán)，進行40個循環(huán)，再于72℃保溫7分鐘。第二次PCR以第一次PCR的反應(yīng)液為模板，除使用正向引物T7in和反向引物MA1之外，其余與第一次PCR反應(yīng)條件相同。結(jié)果得到335bp的DNA擴增片斷。將之作為以下所示菌落雜交的探針。實施例4神經(jīng)酰胺酶基因的克隆將導(dǎo)入了小鼠肝臟cDNA質(zhì)粒文庫的轉(zhuǎn)化體涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)皿上的尼龍膜(商品名Hybond-N+，Amersham Pharmacia公司制)上，制備每一塊9.5×13.5cm的平皿形成約3萬個菌落的主濾膜(master filter)。制備該濾膜的復(fù)制品，將所得復(fù)制濾膜分別在浸泡過10％SDS溶液的濾紙上處理5分鐘，在浸泡過0.5M NaOH、1.5M NaCl溶液的濾紙上處理5分鐘(變性)，在浸泡過含3M NaCl的0.5M Tris-HCl(pH7.5)緩沖液的濾紙上處理5分鐘(中和)，在浸泡過2×SSC溶液的濾紙上處理5分鐘，然后用2×SSC溶液漂洗膜。將膜風(fēng)干后，用紫外線照射將DNA固定到膜上，成為菌落雜交用的膜。
用實施例3中得到的擴增DNA片斷作雜交探針，取其0.1μg用DNA標記試劑盒(Ready To Go，Pharmacia公司制)，按照該試劑盒的說明書，用32P進行標記。將上述濾膜放入雜交袋中，在雜交液(組成7％PEG6000，10％SDS溶液)中，60℃預(yù)雜交1小時，然后加入上述標記的探針并使其終濃度為0.006pmol/ml，60℃雜交一晚。然后，在加溫到60℃的洗滌液(2×SSC，0.1％SDS)中，60℃每次15分鐘、共3次，將膜洗凈。除去膜上的多余水分，然后在富士膠卷公司制成像板中感光20分鐘，在BAS1000成像分析儀(富士膠卷公司制)上測定信號。然后收集本次操作中得到的與陽性信號相對應(yīng)的主濾膜上的菌落(第一次篩選)。
將收集的菌落懸浮到含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，然后涂布到含100μg/ml氨芐青霉素的9.5×13.5cm LB瓊脂培養(yǎng)皿上的尼龍膜上，制備每一塊平皿形成約200-1000個菌落的主濾膜。用與第一次篩選同樣的方法從該濾膜上篩選出陽性克隆，用同樣的操作再進行3次篩選。3次篩選的結(jié)果，分離出含有神經(jīng)酰胺酶基因的陽性克隆。
由該陽性克隆制備質(zhì)粒，將之命名為質(zhì)粒pLCDase。用多種限制酶或組合應(yīng)用多種限制酶酶切該質(zhì)粒，將生成的DNA片斷進行亞克隆，分析其堿基序列。由此，確定插入到質(zhì)粒pLCDase中的DNA片斷的全部堿基序列。該序列示于序列表的序列號11中。另外，該序列中出現(xiàn)的開放閱讀框架(Open reading frame，ORF)的堿基序列以及其編碼的多肽的氨基酸序列分別示于序列表的序列號12和13中。上述DNA片斷的限制酶譜圖和該DNA片斷中所含的開放閱讀框架的位置如圖2所示。
分析上述ORF的堿基序列時發(fā)現(xiàn)，它包含編碼實施例2中確定的神經(jīng)酰胺酶的部分氨基酸序列的堿基序列，這表明該ORF編碼神經(jīng)酰胺酶。另外，將該ORF編碼的神經(jīng)酰胺酶的氨基酸序列與序列表的序列號1所示的神經(jīng)酰胺酶的氨基酸序列相比較時發(fā)現(xiàn)，從小鼠肝臟純化的神經(jīng)酰胺酶缺失了上述ORF編碼的多肽中N末端部分的肽段。也就是說，神經(jīng)酰胺酶翻譯后，經(jīng)過去除其N末端部分的加工過程轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒煨兔?。序列表的序列?4中顯示的是成熟型神經(jīng)酰胺酶的氨基酸序列，序列表的序列號15中顯示的是編碼成熟型神經(jīng)酰胺酶的堿基序列。實施例5神經(jīng)酰胺酶基因的表達通過將實施例4中得到的質(zhì)粒pLCDase 1μg與脂轉(zhuǎn)染胺試劑(LipofectAMINE，Life Technologies公司制)5μl加入到在直徑35mm的含10％FCS的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CHO細胞(3×105細胞/平皿)中，把神經(jīng)酰胺酶基因?qū)隒HO細胞。將該細胞于37℃培養(yǎng)24小時后，懸浮到含0.1％Triton X-100的100μl 10mM Tris-HCl(pH7.5)中，并破碎細胞。以上述C12-NBD-神經(jīng)酰胺為底物，測定所得細胞破碎液的神經(jīng)酰胺酶活性。此時發(fā)現(xiàn)，與未導(dǎo)入pLCDase的對照細胞相比，該細胞中神經(jīng)酰胺酶的表達增強約1000倍。
再按照分析生化(Analytical Biochemistry)，第244卷，第291-300頁(1997)中所述的方法，測定細胞內(nèi)的神經(jīng)酰胺量。此時發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入了pLCDase的細胞與未導(dǎo)入的對照細胞相比，神經(jīng)酰胺量顯著性降低。實施例6從小鼠腦中克隆神經(jīng)酰胺酶基因?qū)⑾跛崂w維素膜(Schleicher&Schuell公司，PROTRAN BA850.45mm，直徑82mm)覆蓋到含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)皿上，并按每塊平皿約20萬個菌落將小鼠腦cDNA文庫(LIFETECHNOLOGIES公司，SUPERSCRIPT Mouse Brain cDNA Library)涂布于10塊平皿中，37℃培養(yǎng)10小時。將生長在硝酸纖維素膜上的大腸桿菌轉(zhuǎn)移印跡到尼龍膜(PALL Gelman Laboratory公司，biodyneA，直徑82mm(1.2mm))上，并分別鋪到氨芐青霉素平皿上后，37℃培養(yǎng)3小時。將硝酸纖維素膜作為主濾膜于4℃保存，將尼龍膜鋪到氯霉素平皿上，37℃培養(yǎng)16小時。將菌落從尼龍膜轉(zhuǎn)移印跡到新的尼龍膜上，各組重疊的尼龍膜直接用1ml變性液(0.5M NaOH/1.5MNaCl)將表、里分別處理5分鐘。同樣在1ml中和液(0.5M Tris-HCl(pH7.4)/1.5M NaCl)中處理5分鐘。分開尼龍膜，風(fēng)干后，于80℃烤2小時。其后，在200ml預(yù)洗液(5×SSC/0.5％SDS/1mlEDTA(pH8.0))中振蕩10分鐘，拭去大腸桿菌的碎片，并用2×SSC洗滌。在40ml的雜交液(0.5M Church磷酸/7％SDS/1mM EDTA)中，65℃預(yù)雜交2小時后，在含有變性后的探針的40ml雜交液中，65℃雜交16小時。作為探針，使用含小鼠神經(jīng)酰胺酶基因的質(zhì)粒pAPLCD的2.7Kbp EcoR I-EcoR I片斷。雜交結(jié)束后，用100ml洗滌液(40mMChurch磷酸/1％SDS)65℃洗滌2次，每次15分鐘。再用100ml的High stringent洗滌液(0.2×SSC/0.1％SDS)65℃洗滌15分鐘。將膜風(fēng)干后，暴露到IP板1小時，隨后用BAS1500進行分析。將陽性部分的硝酸纖維素膜切成直徑約6mm，懸浮到1ml的LB培養(yǎng)基中，將4000倍稀釋的樣品200ml涂布到加入氨芐青霉素的LB培養(yǎng)皿上，進行第二次篩選。
同樣，將陽性部分進行10000倍稀釋的樣品200ml涂布到加入氨芐青霉素的LB培養(yǎng)皿上，制備文庫，并用該文庫進行第三次篩選。將分離的克隆(pSBCD)進行亞克隆后，按常規(guī)方法測定堿基序列。其序列如序列號16所示。
可以看到上述序列中與實施例4中所述的小鼠肝臟來源的神經(jīng)酰胺酶基因具有相同的序列的ORF，但5′非翻譯區(qū)域和3′非翻譯區(qū)域的序列與小鼠肝臟來源的有所不同。另外，將分離的質(zhì)粒pSBCD與實施例5同樣導(dǎo)入CHO細胞時，可以確認該細胞中有神經(jīng)酰胺酶的表達。實施例7人神經(jīng)酰胺酶基因的基因組克隆以實施例4確定的小鼠肝臟來源的神經(jīng)酰胺酶基因的序列為基礎(chǔ)，合成具有序列表的序列號17所示堿基序列的正向引物U1107和具有序列表的序列號18所示堿基序列的反向引物L(fēng)1311。U1107引物的序列相當(dāng)于序列表的序列號12中堿基序號1107-1130的序列，L1311引物的序列相當(dāng)于與序列號12中堿基序號1311-1334的序列相互補的堿基序列。
用常規(guī)方法從人肝癌細胞Huh7純化基因組DNA。以所得625ng基因組DNA為模板，用U1107引物和L1311引物進行PCR。PCR反應(yīng)條件是在94℃9分鐘后，以94℃0.5分鐘、55℃0.5分鐘、72℃3分鐘為一個循環(huán)，進行40個循環(huán)，再于72℃保溫7分鐘。所得反應(yīng)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明，通過PCR可擴增出大約2Kbp的DNA片斷。
用Sephaglas(Pharmacia公司制)從膠中回收該DNA片斷，將所得DNA片斷整合到pGEM-T easy載體(Promega公司制)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。然后，確定所得質(zhì)粒中插入DNA片斷的堿基序列。上述序列相當(dāng)于GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的Accession NO.AC012131 Complement的96289-98478序列。另外，對該序列編碼的氨基酸序列進行分析時發(fā)現(xiàn)，該序列中具有編碼與序列表的序列號4中所示小鼠肝臟來源的神經(jīng)酰胺酶氨基酸序列中氨基酸序號370-444區(qū)域具有同源性的氨基酸序列的區(qū)域。
另外，AC012131與實施例4中確定的小鼠肝臟來源的神經(jīng)酰胺酶基因也有同源性。
序列表說明序列號1中所示的序列中氨基酸序號7、9和13的Xaa表示未知的氨基酸。
序列號4是用作引物的合成寡核苷酸序列。其中，堿基序號6、9和15的n表示G、A、T或C。
序列號5是用作引物的合成寡核苷酸序列。其中，堿基序號3、6和15的n表示G、A、T或C。
序列號7是用作引物的合成寡核苷酸序列。
序列號8是用作引物的合成寡核苷酸序列。
序列號9是用作引物的合成寡核苷酸序列。
序列號10是用作引物的合成寡核苷酸序列。
序列號11是用作引物的合成寡核苷酸序列。
序列號17是用作引物的合成寡核苷酸序列。
序列號18是用作引物的合成寡核苷酸序列。產(chǎn)業(yè)上的實用性本發(fā)明提供編碼哺乳類來源的中性/堿性神經(jīng)酰胺酶的基因，另外還提供應(yīng)用該基因的神經(jīng)酰胺酶基因工程學(xué)制備方法。本發(fā)明的寡核苷酸探針和引物可用于檢測上述基因，也可應(yīng)用于生物體內(nèi)神經(jīng)酰胺代謝研究等方面。再者，本發(fā)明提供本發(fā)明基因的反義核酸(DNA、RNA)。該基因及其反義核酸可用于調(diào)控生物體內(nèi)的神經(jīng)酰胺酶活性，及可用于神經(jīng)酰胺代謝系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，還提供可用于因神經(jīng)酰胺量異常引起的疾病的治療等的神經(jīng)酰胺量的調(diào)節(jié)方法。
序列表<110>寶酒造株式會社<120>神經(jīng)酰胺酶基因<130>00-011-PCT<140>JP 11/84743<141>1999-3-26<160>18<210>1<211>21<212>PRT<213>小鼠(Mouse)<220><222>7，9，13<223>Xaa為未知的氨基酸<400>1Phe Ser Gly Tyr Tyr Ile Xaa Val Xaa Arg Ala Asp Xaa Thr Gly1 5 10 15Lys Val Asn Asp Ile Asn20<210>2<211>10<212>PRT<213>小鼠(Mouse)<220><222>9<223>Xaa為未知的氨基酸<400>2Ala Ile Ala Thr Asp Thr Val Ala Xaa Met1 5 10<210>3<211>35<212>PRT<213>小鼠(Mouse)<220><222>29，30<223>Xaa為未知的氨基酸<400>3Gly Tyr Leu Pro Gly Gln Gly Pro Phe Val Asn Gly Phe Ala Ser1 5 10 15Ser Asn Leu Gly Asp Val Ser Pro Asn Ile Leu Gly Pro Xaa Xaa20 25 30Val Asn Thr Gly Glu35<210>4<211>17<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>合成的寡核苷酸引物<220><222>6，9，15<223>”n”為G、A、T或C<400>4carggnccnt tygtngc 17<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>合成的寡核苷酸引物<220><222>3，6，15<223>“n”為G、A、T或C<400>5ggnccnagda trttngg 17<210>6<211>38<212>DNA<213>小鼠(Mouse)<400>6gcaggctttg cttcatcaaa tctcggagac gtgtcacc38<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>合成的寡核苷酸引物<400>7ttgatgaagc aaagcctgc 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>合成的寡核苷酸引物<400>8ggtgacacgt ctccgagat 19<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>合成的寡核苷酸引物<400>9taatacgact cactataggg 20<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>合成的寡核苷酸引物<400>10tctgctctaa aagctgc17<210>11<211>3108<212>DNA<213>小鼠(Mouse)<400>11cctgcgccac ttctctctcc cggctcaatc gcggagcctt ttctctcccc cgtctcgccg 60ctgccgccat ctccacccct gcctgcccca ggggtctgtg gacgcccggg cagagagcaa 120gcaccgagct gggcctgctg gagaccggag accagcggcc cgcccgcccg cccgctgcga 180gcctcctgag cagctccgga acagcttact ttctgtttcc atctctttcg gaccgggttg 240gcctctccaa aagccacttc tcctaactct tatcaaggtt caaaggctaa aggtctgtac 300acatgagtgc tggtgtgctt agaggcatcg ggtccctttc agctggagtt gcagtacttg 360tgagtgccat ggaatccaaa ttcggcaaga gatacaatct aaactctcaa ctactccaga 420ttcaaggttc acctcacttt ctggttacca aaggagcttt gcggggccgc tctgacatcc 480agtagatttg gaaacacatt gagaaatcag cctgagcaac ctgcaaggca caaggcacaa 540gattctgcat ggttatttgc tctcccagga ggtgaacact tgttttgatt cacagagtca 600gggttgagat gcccagttgt tcctcatctt ggctcagaag aagcacctag gaataaaagc 660tctaagctgg tattaagtag aatgggctta aagtccacta caggaaacaa cagctagtga 720cagaaatggc aaagcgaacc ttctccacct tggaggcatt cctcattttc cttctggtaa 780taatgacagt catcacagtg gcccttctca ccctcttgtt tgttaccagt gggaccattg 840aaaaccacaa agattcagga aatcactggt tttcaaccac tctgggctcc acgacaaccc 900agccccctcc aattacacag actccaaact tcccttcatt tcggaacttc agtggctact 960acattggcgt tgggagagcg gattgcacag gacaagtgtc agatatcaat ttgatgggct 1020atggcaaaaa tggccagaat gcacggggtc tcctcaccag gctgttcagc cgtgctttta 1080tcttggcgga tccagatggg tcaaatcgaa tggcatttgt gagcgtggaa ctatgtatga 1140tttcccaacg actgaggttg gaggtcctga agagactaga gagtaaatat ggctctctgt 1200atcgaagaga caatgttatc ctgagtgcca ttcacacaca ctctggccca gcagggtttt 1260tccaatatac actctatata ctcgccagcg agggattcag caaccggacc tttcagtaca 1320tagtctctgg gatcatgaag agcattgata tagctcacac aaatcttaaa ccaggcaaaa 1380tctttatcaa caaaggaaat gttgctaatg tgcagatcaa ccgaagcccc tcctcttacc 1440ttctgaatcc acagtcagag agagcaaggt attcttcaaa cacagacaag gaaatgctgg 1500tcttgaaact ggtggatttg aatggagaag acttgggtct tatcagctgg tttgccatcc 1620accccgtgag catgaacaat agcaaccact ttgtgaatag tgacaatatg ggctatgcgg 1620cttacctttt tgagcaagaa aagaacaaag gctatctgcc tggacaggga ccgtttgtag 1680caggctttgc ttcatcaaat ctcggagacg tgtcacccaa cattcttggc ccgcattgtg 1740tcaacacagg ggagtcttgt gacaacgaca agagcacctg tcccaacggt gggcctagca 1800tgtgcatggc cagcggacct ggacaagaca tgtttgagag cacacacatt ataggacgga 1860tcatctatca gaaggccaag gagctgtatg cctctgcctc ccaggaggtg accggcccag 1920tgcttgcagc tcaccagtgg gtgaacatga cagatgtgag cgtccagctc aatgccacac 1980acacagtgaa gacgtgtaaa cctgccctgg gctacagttt tgccgcaggc acaattgatg 2040gagtttcggg cctcaatatt acacagggaa ctacggaagg ggatccattc tgggacactc 2100ttcgggacca gctcttggga aaaccatctg aagagattgt agagtgtcag aaacccaaac 2160caatcctgct tcacagtgga gagctgacga taccacatcc ttggcaacca gatattgttg 2220atgttcagat tgttaccgtt gggtccttgg ccatagctgc tatccctggg gaattaacaa 2280ccatgtcggg acgaagattt cgtgaggcaa ttaaaaaaga atttgcactt tatgggatga 2340aggatatgac cgttgttatc gcaggtctaa gcaatgttta tacacattac attaccacat 2400atgaagaata ccaggctcag cggtacgagg cagcatctac aatctatgga ccacacaccc 2460tgtctgcata catccaactc ttcagagacc ttgctaaggc aattgctacg gacacagtag 2520ccaacatgag cagtggtccc gagcctccat tcttcaaaaa tctaatagct tcacttattc 2580ctaatattgc ggatagagca ccaattggca aacattttgg ggatgtcttg cagccagcaa 2640aacctgaata cagagtggga gaagtggttg aagttatatt tgtaggcgct aacccaaaga 2700attcagcaga gaaccagacc catcaaacct tcctcactgt ggagaaatac gaggactctg 2760tagctgactg gcagataatg tataacgatg cctcctggga gacgaggttt tattggcaca 2820aaggaatact gggtctgagc aatgcaacaa tatactggca tattccagat actgcctacc 2880ctggaatcta cagaataaga tattttggac acaatcggaa gcaggaactt ctgaaacccg 2940ctgtcatact agcatttgaa ggaatttctt ctccttttga agttgtcact acttagtgaa 3000aagttgacag atattgaaga aaagcttttc tctgtgcaca ttatagagtg aattcacaaa 3060aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 3108<210>12<211>2271<212>DNA<213>小鼠(Mouse)<400>12atggcaaagc gaaccttctc caccttggag gcattcctca ttttccttct ggtaataatg 60acagtcatca cagtggccct tctcaccctc ttgtttgtta ccagtgggac cattgaaaac 120cacaaagatt caggaaatca ctggttttca accactctgg gctccacgac aacccagccc 180cctccaatta cacagactcc aaacttccct tcatttcgga acttcagtgg ctactacatt 240ggcgttggga gagcggattg cacaggacaa gtgtcagata tcaatttgat gggctatggc 300aaaaatggcc agaatgcacg gggtctcctc accaggctgt tcagccgtgc ttttatcttg 360gcggatccag atgggtcaaa tcgaatggca tttgtgagcg tggaactatg tatgatttcc 420caacgactga ggttggaggt cctgaagaga ctagagagta aatatggctc tctgtatcga 480agagacaatg ttatcctgag tgccattcac acacactctg gcccagcagg gtttttccaa 540tatacactct atatactcgc cagcgaggga ttcagcaacc ggacctttca gtacatagtc 600tctgggatca tgaagagcat tgatatagct cacacaaatc ttaaaccagg caaaatcttt 660atcaacaaag gaaatgttgc taatgtgcag atcaaccgaa gcccctcctc ttaccttctg 720aatccacagt cagagagagc aaggtattct tcaaacacag acaaggaaat gctggtcttg 780aaactggtgg atttgaatgg agaagacttg ggtcttatca gctggtttgc catccacccc 840gtgagcatga acaatagcaa ccactttgtg aatagtgaca atatgggcta tgcggcttac 900ctttttgagc aagaaaagaa caaaggctat ctgcctggac agggaccgtt tgtagcaggc 960tttgcttcat caaatctcgg agacgtgtca cccaacattc ttggcccgca ttgtgtcaac 1020acaggggagt cttgtgacaa cgacaagagc acctgtccca acggtgggcc tagcatgtgc 1080atggccagcg gacctggaca agacatgttt gagagcacac acattatagg acggatcatc 1140tatcagaagg ccaaggagct gtatgcctct gcctcccagg aggtgaccgg cccagtgctt 1200gcagctcacc agtgggtgaa catgacagat gtgagcgtcc agctcaatgc cacacacaca 1260gtgaagacgt gtaaacctgc cctgggctac agttttgccg caggcacaat tgatggagtt 1320tcgggcctca atattacaca gggaactacg gaaggggatc cattctggga cactcttcgg 1380gaccagctct tgggaaaacc atctgaagag attgtagagt gtcagaaacc caaaccaatc 1440ctgcttcaca gtggagagct gacgatacca catccttggc aaccagatat tgttgatgtt 1500cagattgtta ccgttgggtc cttggccata gctgctatcc ctggggaatt aacaaccatg 1620tcgggacgaa gatttcgtga ggcaattaaa aaagaatttg cactttatgg gatgaaggat 1620atgaccgttg ttatcgcagg tctaagcaat gtttatacac attacattac cacatatgaa 1680gaataccagg ctcagcggta cgaggcagca tctacaatct atggaccaca caccctgtct 1740gcatacatcc aactcttcag agaccttgct aaggcaattg ctacggacac agtagccaac 1800atgagcagtg gtcccgagcc tccattcttc aaaaatctaa tagcttcact tattcctaat 1860attgcggata gagcaccaat tggcaaacat tttggggatg tcttgcagcc agcaaaacct 1920gaatacagag tgggagaagt ggttgaagtt atatttgtag gcgctaaccc aaagaattca 1980gcagagaacc agacccatca aaccttcctc actgtggaga aatacgagga ctctgtagct 2040gactggcaga taatgtataa cgatgcctcc tgggagacga ggttttattg gcacaaagga 2100atactgggtc tgagcaatgc aacaatatac tggcatattc cagatactgc ctaccctgga 2160atctacagaa taagatattt tggacacaat cggaagcagg aacttctgaa acccgctgtc 2220atactagcat ttgaaggaat ttcttctcct tttgaagttg tcactactta g 2271<210>13<211>756<212>PRT<213>小鼠(Mouse)<400>13Met Ala Lys Arg Thr Phe Ser Thr Leu Glu Ala Phe Leu Ile Phe1 5 10 15Leu Leu Val Ile Met Thr Val Ile Thr Val Ala Leu Leu Thr Leu20 25 30Leu Phe Val Thr Ser Gly Thr Ile Glu Asn His Lys Asp Ser Gly35 40 45Asn His Trp Phe Ser Thr Thr Leu Gly Ser Thr Thr Thr Gln Pro50 55 60Pro Pro Ile Thr Gln Thr Pro Asn Phe Pro Ser Phe Arg Asn Phe65 70 75Ser Gly Tyr Tyr Ile Gly Val Gly Arg Ala Asp Cys Thr Gly Gln
80 85 90Val Ser Asp Ile Asn Leu Met Gly Tyr Gly Lys Asn Gly Gln Asn95 100 105Ala Arg Gly Leu Leu Thr Arg Leu Phe Ser Arg Ala Phe Ile Leu110 115 120Ala Asp Pro Asp Gly Ser Asn Arg Met Ala Phe Val Ser Val Glu125 130 135Leu Cys Met Ile Ser Gln Arg Leu Arg Leu Glu Val Leu Lys Arg140 145 150Leu Glu Ser Lys Tyr Gly Ser Leu Tyr Arg Arg Asp Asn Val Ile155 160 165Leu Ser Ala Ile His Thr His Ser Gly Pro Ala Gly Phe Phe Gln170 175 180Tyr Thr Leu Tyr Ile Leu Ala Ser Glu Gly Phe Ser Asn Arg Thr185 190 195Phe Gln Tyr Ile Val Ser Gly Ile Met Lys Ser Ile Asp Ile Ala200 205 210His Thr Asn Leu Lys Pro Gly Lys Ile Phe Ile Asn Lys Gly Asn215 220 225Val Ala Asn Val Gln Ile Asn Arg Ser Pro Ser Ser Tyr Leu Leu230 235 240Asn Pro Gln Ser Glu Arg Ala Arg Tyr Ser Ser Asn Thr Asp Lys245 250 255Glu Met Leu Val Leu Lys Leu Val Asp Leu Asn Gly Glu Asp Leu260 265 270Gly Leu Ile Ser Trp Phe Ala Ile His Pro Val Ser Met Asn Asn275 280 285Ser Asn His Phe Val Asn Ser Asp Asn Met Gly Tyr Ala Ala Tyr290 295 300Leu Phe Glu Gln Glu Lys Asn Lys Gly Tyr Leu Pro Gly Gln Gly305 310 315Pro Phe Val Ala Gly Phe Ala Ser Ser Asn Leu Gly Asp Val Ser320 325 330Pro Asn Ile Leu Gly Pro His Cys Val Asn Thr Gly Glu Ser Cys335 340 345Asp Asn Asp Lys Ser Thr Cys Pro Asn Gly Gly Pro Ser Met Cys350 355 360Met Ala Ser Gly Pro Gly Gln Asp Met Phe Glu Ser Thr His Ile365 370 375Ile Gly Arg Ile Ile Tyr Gln Lys Ala Lys Glu Leu Tyr Ala Ser380 385 390Ala Ser Gln Glu Val Thr Gly Pro Val Leu Ala Ala His Gln Trp395 400 405Val Asn Met Thr Asp Val Ser Val Gln Leu Asn Ala Thr His Thr410 415 420Val Lys Thr Cys Lys Pro Ala Leu Gly Tyr Ser Phe Ala Ala Gly425 430 435Thr Ile Asp Gly Val Ser Gly Leu Asn Ile Thr Gln Gly Thr Thr440 445 450Glu Gly Asp Pro Phe Trp Asp Thr Leu Arg Asp Gln Leu Leu Gly455 460 465Lys Pro Ser Glu Glu Ile Val Glu Cys Gln Lys Pro Lys Pro Ile470 475 480Leu Leu His Ser Gly Glu Leu Thr Ile Pro His Pro Trp Gln Pro485 490 495Asp Ile Val Asp Val Gln Ile Val Thr Val Gly Ser Leu Ala Ile500 505 510Ala Ala Ile Pro Gly Glu Leu Thr Thr Met Ser Gly Arg Arg Phe
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350 355 360Gly Thr Ile Asp Gly Val Ser Gly Leu Asn Ile Thr Gln Gly Thr365 370 375Thr Glu Gly Asp Pro Phe Trp Asp Thr Leu Arg Asp Gln Leu Leu380 385 390Gly Lys Pro Ser Glu Glu Ile Val Glu Cys Gln Lys Pro Lys Pro395 400 405Ile Leu Leu His Ser Gly Glu Leu Thr Ile Pro His Pro Trp Gln410 415 420Pro Asp Ile Val Asp Val Gln Ile Val Thr Val Gly Ser Leu Ala425 430 435Ile Ala Ala Ile Pro Gly Glu Leu Thr Thr Met Ser Gly Arg Arg440 445 450Phe Arg Glu Ala Ile Lys Lys Glu Phe Ala Leu Tyr Gly Met Lys455 460 465Asp Met Thr Val Val Ile Ala Gly Leu Ser Asn Val Tyr Thr His470 475 480Tyr Ile Thr Thr Tyr Glu Glu Tyr Gln Ala Gln Arg Tyr Glu Ala485 490 495Ala Ser Thr Ile Tyr Gly Pro His Thr Leu Ser Ala Tyr Ile Gln500 505 510Leu Phe Arg Asp Leu Ala Lys Ala Ile Ala Thr Asp Thr Val Ala515 520 525Asn Met Ser Ser Gly Pro Glu Pro Pro Phe Phe Lys Asn Leu Ile530 535 540Ala Ser Leu Ile Pro Asn Ile Ala Asp Arg Ala Pro Ile Gly Lys545 550 555His Phe Gly Asp Val Leu Gln Pro Ala Lys Pro Glu Tyr Arg Val560 565 570Gly Glu Val Val Glu Val Ile Phe Val Gly Ala Asn Pro Lys Asn575 580 585Ser Ala Glu Asn Gln Thr His Gln Thr Phe Leu Thr Val Glu Lys590 595 600Tyr Glu Asp Ser Val Ala Asp Trp Gln Ile Met Tyr Asn Asp Ala605 610 615Ser Trp Glu Thr Arg Phe Tyr Trp His Lys Gly Ile Leu Gly Leu620 625 630Ser Asn Ala Thr Ile Tyr Trp His Ile Pro Asp Thr Ala Tyr Pro635 640 645Gly Ile Tyr Arg Ile Arg Tyr Phe Gly His Asn Arg Lys Gln Glu650 655 660Leu Leu Lys Pro Ala Val Ile Leu Ala Phe Glu Gly Ile Ser Ser665 670 675Pro Phe Glu Val Val Thr Thr680<210>15<211>2049<212>DNA<213>小鼠(Mouse)<400> 15ttcagtggct actacattgg cgttgggaga gcggattgca caggacaagt gtcagatatc 60aatttgatgg gctatggcaa aaatggccag aatgcacggg gtctcctcac caggctgttc 120agccgtgctt ttatcttggc ggatccagat gggtcaaatc gaatggcatt tgtgagcgtg 180gaactatgta tgatttccca acgactgagg ttggaggtcc tgaagagact agagagtaaa 240tatggctctc tgtatcgaag agacaatgtt atcctgagtg ccattcacac acactctggc 300ccagcagggt ttttccaata tacactctat atactcgcca gcgagggatt cagcaaccgg 360acctttcagt acatagtctc 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1.一種基因，其核酸的堿基序列選自下列核酸構(gòu)成的組(A)一種核酸，它編碼的多肽具有序列表的序列號14中所述的氨基酸序列或其一部分序列、且具有神經(jīng)酰胺酶活性；(B)一種核酸，它具有序列表的序列號15中所述的堿基序列或其一部分序列、且編碼具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽；(C)一種核酸，它編碼的多肽具有序列表的序列號14所述的氨基酸序列中至少1個氨基酸殘基發(fā)生缺失、添加、插入或置換的氨基酸序列、且具有神經(jīng)酰胺酶活性；(D)一種核酸，它具有序列表的序列號15所述的堿基序列中至少1個堿基發(fā)生缺失、添加、插入或置換的堿基序列、且編碼具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽；以及，(E)一種核酸，它可在嚴格條件下與上述(A)-(D)任一項所述的核酸的互補鏈雜交，且編碼具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽；(F)一種核酸，通過密碼子的簡并性與上述(A)-(E)任一項所述的核酸具有不同的堿基序列，且編碼具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其編碼的多肽的神經(jīng)酰胺酶活性可通過以下步驟進行檢測(a)將基因的表達產(chǎn)物在反應(yīng)混和液中，37℃溫育30分鐘，使之反應(yīng)的步驟；以及，(b)檢測所得反應(yīng)物中C12-NBD-脂肪酸的生成的步驟；上述反應(yīng)混合液的組成為，在20μl 25mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，含有550pmol的C12-NBD-神經(jīng)酰胺及1.0％(W/V)膽酸鈉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因，其編碼的多肽至少具有以下性質(zhì)(i)作用水解神經(jīng)酰胺生成鞘氨基醇堿和脂肪酸；(ii)底物特異性水解N-酰基神經(jīng)鞘氨醇，對半乳糖基神經(jīng)酰胺、硫苷脂、GM1a、神經(jīng)鞘磷脂無作用；(iii)最適pH7.0-8.0；(iv)在含0.1％Polidocanol的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，37℃處理24小時時，未見活性下降；但60℃處理1小時時，活性降低到處理前的約30％左右。
4.一種重組DNA，它含有權(quán)利要求1-3任一項中所述的基因。
5.一種微生物、動物細胞或植物細胞用表達載體，它含有權(quán)利要求1-3任一項中所述的基因或權(quán)利要求4中所述的重組DNA。
6.一種轉(zhuǎn)化體，它攜有權(quán)利要求5中所述的表達載體。
7.一種具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽的制備方法，其特征在于，在適于神經(jīng)酰胺酶基因表達、且適于生產(chǎn)該基因編碼的多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求6中所述的轉(zhuǎn)化體，從所得培養(yǎng)物中提取具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽。
8.一種多肽，它具有序列表的序列號14中所述的氨基酸序列或其一部分序列，且具有神經(jīng)酰胺酶活性。
9.一種多肽，它由權(quán)利要求1-3任一項中所述的基因編碼，且具有神經(jīng)酰胺酶活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的多肽，其神經(jīng)酰胺酶活性可通過以下步驟進行檢測(a)將基因的表達產(chǎn)物在反應(yīng)混和液中，37℃溫育30分鐘，使之反應(yīng)的步驟；以及，(b)檢測所得反應(yīng)物中C12-NBD-脂肪酸的生成的步驟；上述反應(yīng)混合液的組成為，在20μl 25mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，含有550pmol的C12-NBD-神經(jīng)酰胺及1.0％(W/V)膽酸鈉。
11.一種反義DNA，它與權(quán)利要求1-3任一項中所述的基因或其一部分互補。
12.一種反義RNA，它與權(quán)利要求1-3任一項中所述的基因或其一部分互補。
13.一種表達載體，它含有權(quán)利要求11中所述的反義DNA。
14.一種寡核苷酸探針或引物，它可與權(quán)利要求1-3任一項中所述的基因或其互補鏈特異性雜交。
15.一種抗體或其片斷，它可與權(quán)利要求8-10任一項中所述的多肽特異性結(jié)合。
16.一種編碼具有神經(jīng)酰胺酶活性多肽的基因的檢測方法，它使用了權(quán)利要求14中所述的寡核苷酸探針和/或引物。
17.一種用于檢測編碼具有神經(jīng)酰胺酶活性多肽的基因的試劑盒，它含有權(quán)利要求14中所述的寡核苷酸探針和/或引物。
18.一種具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽的檢測方法，它使用了權(quán)利要求15中所述的抗體或其片斷。
19.一種用于檢測具有神經(jīng)酰胺酶活性的多肽的試劑盒，它含有權(quán)利要求15中所述的抗體或其片斷。
20.一種細胞內(nèi)和/或組織內(nèi)神經(jīng)酰胺量的調(diào)節(jié)方法，其特征在于，將權(quán)利要求1-3任一項中所述的基因或其反義核酸導(dǎo)入細胞和/或組織內(nèi)，并由此來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)和/或組織內(nèi)神經(jīng)酰胺量。
全文摘要
本發(fā)明涉及哺乳類來源的中性/堿性神經(jīng)酰胺酶,與之特異性結(jié)合的抗體,編碼該神經(jīng)酰胺酶的基因,與該基因特異性雜交的探針和引物,該神經(jīng)酰胺酶的基因工程學(xué)制備方法,該神經(jīng)酰胺酶或基因的檢測方法以及細胞內(nèi)和/或組織內(nèi)神經(jīng)酰胺量的調(diào)節(jié)方法。本發(fā)明可提供可用于神經(jīng)酰胺結(jié)構(gòu)和功能分析的脂質(zhì)工程學(xué)試劑,及可在與神經(jīng)酰胺代謝相關(guān)的疾病中應(yīng)用。
文檔編號C12N1/21GK1351659SQ00807972
公開日2002年5月29日 申請日期2000年3月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月26日
發(fā)明者伊東信 申請人:寶酒造株式會社