專利名稱：N－乙酰神經(jīng)氨酸的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)利用具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性或N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶活性的微生物，制造N-乙酰神經(jīng)氨酸的制造方法的發(fā)明。
作為N-乙酰神經(jīng)氨酸的制造方法已知有萃取法、分解法、利用酶催化的方法。
作為萃取法有從海燕窩萃取等方法[碳水化合物研究(Carbohydrate Research),56,423(1977)]。
作為分解法有對(duì)大腸桿菌等細(xì)菌生產(chǎn)的N-乙酰神經(jīng)氨酸聚合物多聚乙酰神經(jīng)氨酸進(jìn)行分解等方法[生物化學(xué)雜志(J.Biochem.),82,1425(1977)]。
作為利用酶催化的方法有用N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶、丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺進(jìn)行制造的方法[美國(guó)化學(xué)會(huì)志(J.Am.Chem.Soc.),110,6481(1988)、J.Am.Chem.Soc.,110,7159(1988)]，有在堿性條件下用N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶、丙酮酸和N-乙酰葡糖胺進(jìn)行制造的方法[美國(guó)專利第5,665,574號(hào)]、用N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶、N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶、丙酮酸和N-乙酰葡糖胺進(jìn)行制造的方法[應(yīng)用化學(xué)，國(guó)際英文版(Angew.Chem.Int.Ed.Eng.),30,827(1991)、Carbohydrate Research,306,575(1998)]、用N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺進(jìn)行制造的方法[特開平10-4961、糖生物學(xué)(Glycobiology),7,697(1997)]。
無(wú)論上述N-乙酰神經(jīng)氨酸的哪一種制造方法，由于操作都煩瑣或者是必須使用高價(jià)的原料丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸，所以還沒(méi)有確立N-乙酰神經(jīng)氨酸的成本低廉的制造方法。
到目前為止，有關(guān)利用微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物可能制造N-乙酰神經(jīng)氨酸的記載或提示還沒(méi)有。
關(guān)于N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶，已知有來(lái)自動(dòng)植物的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶，微生物中已知屬于埃希氏菌屬的微生物也具有該酶活性。已知在屬于埃希氏菌屬(Escherichia)的微生物的大腸桿菌(Escherichia coli)中也有編碼該酶的基因nanA[核酸研究(Nucleicacids Res.),13,8843(1985)]。
關(guān)于N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶，已知屬于埃希氏菌屬、奈瑟氏球菌屬、鏈球菌屬的微生物中含有此酶，大腸桿菌中有編碼該酶的基因nauB[細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.),177,312(1995)]。
關(guān)于N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶，已知在豬和大鼠中存在此酶，已就來(lái)自豬的該酶的性質(zhì)進(jìn)行了研究[生物化學(xué)(Biochemistry),17,3363(1970)]、已經(jīng)獲得了編碼該酶的基因[生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),271,16294(1996)]。但到目前為止，具有該酶活性的微生物還不知道。
作為丙酮酸的制造方法已知有利用大腸桿菌的變異株制造丙酮酸的方法[生物科學(xué).生物技術(shù).生物化學(xué)(Biosci.Biotech.Biochem.),58,2164(1994)]。
作為磷酸烯醇式丙酮酸的制造方法有利用屬于酵母屬Saccharomyces微生物制造磷酸烯醇式丙酮酸的方法[特開平6-197778]。
本發(fā)明的目的是提供不添加丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸等高價(jià)原料，廉價(jià)制造N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法。另外還提供不用高價(jià)的N-乙酰甘露糖胺制造N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法。
本發(fā)明人為了解決上述課題進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)通過(guò)利用具有生產(chǎn)丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸能力的微生物由價(jià)格便宜的原料可以高效生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明包括以下(1)～(11)項(xiàng)內(nèi)容。
(1)N-乙酰神經(jīng)氨酸的制造方法，其特征是使水介質(zhì)中①含有具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶或N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶活性的微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物，②在上述①中使用具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性的微生物時(shí)，含有具有丙酮酸生成能力的微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物，在上述①中使用具有N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶活性的微生物時(shí)，含有具有磷酸烯醇式丙酮酸生成能力的微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物，③含有N-乙酰甘露糖胺、以及④丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸生成時(shí)所必需的能源，使N-乙酰神經(jīng)氨酸在該水介質(zhì)中生成、蓄積，從該水介質(zhì)中提取N-乙酰神經(jīng)氨酸。
(2)在上述(1)的制造方法中，N-乙酰甘露糖胺是通過(guò)使水介質(zhì)中含有具有N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶的微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物以及N-乙酰葡糖胺，然后使N-乙酰甘露糖胺在該水介質(zhì)中生成、蓄積得到的。
(3)在上述(2)的制造方法中，具有N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶活性的微生物是帶有重組DNA的微生物，該重組DNA是由編碼N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶的DNA片段與載體重組形成的。
(4)在上述(3)的制造方法中，編碼N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶的DNA是來(lái)自屬于集胞藍(lán)細(xì)菌Synechocystis屬的微生物的DNA。
(5)在上述(3)或(4)的制造方法中，編碼N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶的DNA是以下(a)或(b)中的DNA(a)編碼由序列1記載的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA(b)具有序列2記載的堿基序列的DNA。
(6)在上述(1)～(5)記載的任一種制造方法中，具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性的微生物是屬于埃希氏菌屬或棒桿菌屬的微生物。
(7)在上述(1)～(6)記載的任一種制造方法中，具有N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶活性的微生物是從屬于埃希氏菌屬、奈瑟氏球菌屬、鏈球菌屬的微生物中選出來(lái)的微生物。
(8)在上述(1)～(7)記載的任一種制造方法中，具有丙酮酸生成能力的微生物是從屬于埃希氏菌屬、棒桿菌屬和酵母屬的微生物中選出來(lái)的微生物。
(9)在上述(1)～(8)記載的任一種制造方法中，具有磷酸烯醇式丙酮酸生成能力的微生物是從屬于埃希氏菌屬、棒桿菌屬和酵母屬的微生物中選出來(lái)的微生物。
(10)在上述(6)～(9)記載的任一種制造方法中，屬于埃希氏菌屬的微生物是大腸桿菌Escherichia coli。
(11)上述(6)、(8)或(9)記載的制造方法中，屬于棒桿菌屬的微生物是產(chǎn)氨棒桿菌Corynebacterium ammoniagenes、谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum、嗜乙酰乙酸棒桿菌Corynebacteriumacetoacidophilum。表示N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶表達(dá)質(zhì)粒pYP18的構(gòu)建過(guò)程。表示N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶表達(dá)質(zhì)粒pYP16的構(gòu)建過(guò)程。符號(hào)說(shuō)明Ampr氨芐青霉素抗性基因PLPL啟動(dòng)子cI857cI857阻遏物Placlac啟動(dòng)子slr1975N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶基因nanAN-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因neuBN-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
作為本發(fā)明中使用的具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性的微生物，只要是具有該酶活性的微生物無(wú)論哪一種都可以，例如可以用屬于埃希氏菌屬、棒桿菌屬的微生物。
屬于埃希氏菌屬的微生物有大腸桿菌等。屬于棒桿菌屬的微生物有產(chǎn)氨棒桿菌、谷氨酸棒桿菌、嗜乙酰乙酸棒桿菌。
另外可以用通過(guò)基因重組增強(qiáng)了該酶活性的轉(zhuǎn)化菌。作為轉(zhuǎn)化菌有含有來(lái)自大腸桿菌的nanA基因[Nucleic acids Res.,13,8843(1985)]的重組DNA的微生物，例如大腸桿菌NM522/pTA3菌株。
作為本發(fā)明中使用的具有N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶活性的微生物，只要是具有該酶活性的微生物無(wú)論哪一種都可以，例如可以用屬于埃希氏菌屬、奈瑟氏球菌屬、鏈球菌屬的微生物。
屬于埃希氏菌屬的微生物有大腸桿菌等。
另外可以使用通過(guò)基因重組增強(qiáng)了該酶活性的轉(zhuǎn)化菌。作為轉(zhuǎn)化菌有含有來(lái)自大腸桿菌的neuB基因[J.Bacteriol.,177,312(1995)]的重組DNA的微生物，例如大腸桿菌NM522/pYP18菌株。
作為具有丙酮酸生成能力的微生物，只要是具有丙酮酸生成活性的微生物無(wú)論哪一種都可以用，例如大腸桿菌、產(chǎn)氨棒桿菌、谷氨酸棒桿菌、乙酰乙酸棒桿菌、釀酒酵母Sacchromyces cerevisiae等。另外也可以利用通過(guò)變異手法或基因重組手法增強(qiáng)該活性的微生物。例如可以用Biosci.Biotech.Biochem.,58,2164(1994)記載的大腸桿菌的變異株。
作為具有磷酸烯醇式丙酮酸生成能力的微生物，只要是具有該生成活性的微生物無(wú)論哪一種都可以用，例如大腸桿菌、產(chǎn)氨棒桿菌、谷氨酸棒桿菌、嗜乙酰乙酸棒桿菌、釀酒酵母等。作為釀酒酵母可以用特開平6-197778記載的菌株。另外也可以利用通過(guò)變異手法或基因重組手法增強(qiáng)該活性的微生物。
作為具有N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶活性的微生物，只要是具有該生成活性的微生物無(wú)論哪一種都可以用，例如可以用通過(guò)變異手法或基因重組手法增強(qiáng)該酶活性的重組菌株。作為該轉(zhuǎn)化菌株的具體例子有含有來(lái)自豬的N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶基因的重組DNA(pEPI1)的大腸桿菌(FERM BP-4602美國(guó)專利第5,795,767號(hào))，或含有來(lái)自屬于集胞藍(lán)細(xì)菌Synechocystis屬微生物的N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶基因的重組DNA的大腸桿菌NM522/pYP16菌株等。
作為來(lái)自屬于集胞藍(lán)細(xì)菌屬微生物的N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶基因，具有編碼存在于Synechocystis sp.PCC6803菌株的染色體中的編碼具有序列1所示氨基酸序列的多肽的基因。具體講，是具有序列2所示堿基序列的基因(slr1975)。具有序列1所示的氨基酸序列的多肽和具有序列2所示堿基序列的DNA，就象后面實(shí)施例所述的那樣，是本發(fā)明人首次獲得的產(chǎn)物。
在具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性和丙酮酸生成能力的微生物中，只用其中的一種微生物就可以由N-乙酰甘露糖胺制造N-乙酰神經(jīng)氨酸。在上述活性或生產(chǎn)能力任一方面弱或欠缺的微生物中，可以通過(guò)與能夠禰補(bǔ)上述缺陷的微生物適當(dāng)組合，也能夠制造N-乙酰神經(jīng)氨酸。
N-乙酰神經(jīng)氨酸制造中用的N-乙酰甘露糖胺有市售的標(biāo)準(zhǔn)品。另外可以使用由N-乙酰葡糖胺在堿性條件下通過(guò)化學(xué)方法或使用N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶的酶學(xué)方法進(jìn)行變換得到的N-乙酰甘露糖胺。還可以通過(guò)使水介質(zhì)中含有具有N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶活性的微生物培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物和N-乙酰葡糖胺，生成、積蓄的N-乙酰甘露糖胺，使用含有該N-乙酰甘露糖胺的標(biāo)準(zhǔn)品，或用從該標(biāo)準(zhǔn)品中純化的N-乙酰甘露糖胺。
在具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性和N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶活性以及丙酮酸生成能力的微生物中，只用其中的一種微生物就可以由N-乙酰葡糖胺制造N-乙酰神經(jīng)氨酸。在上述活性或生產(chǎn)能力任一方面弱或欠缺的微生物中，可以通過(guò)與能夠禰補(bǔ)上述缺陷的微生物適當(dāng)組合，也能夠制造N-乙酰神經(jīng)氨酸。
N-乙酰神經(jīng)氨酸制造中用的N-乙酰葡糖胺有市售的標(biāo)準(zhǔn)品。
在具有N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶活性和磷酸烯醇式丙酮酸生成能力的微生物中，只用其中的一種微生物就可以由N-乙酰甘露糖胺制造N-乙酰神經(jīng)氨酸。在上述活性或生產(chǎn)能力任一方面弱或欠缺的微生物中，可以通過(guò)與能夠禰補(bǔ)上述缺陷的微生物適當(dāng)組合，也能夠制造N-乙酰神經(jīng)氨酸。
在具有N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶活性和N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶活性以及磷酸烯醇式丙酮酸生成能力的微生物中，只用其中的一種微生物就可以由N-乙酰葡糖胺制造N-乙酰神經(jīng)氨酸。在上述活性或生產(chǎn)能力任一方面弱或欠缺的微生物中，可以通過(guò)與能夠禰補(bǔ)上述缺陷的微生物適當(dāng)組合，也能夠制造N-乙酰神經(jīng)氨酸。
另外供給N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙酰甘露糖胺生成反應(yīng)用的微生物可以是伴隨增殖狀態(tài)的，也可以是培養(yǎng)結(jié)束后的微生物的培養(yǎng)物或該處理物。
象上述那樣，在N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙酰甘露糖胺的制造中，也可以利用基因重組的微生物，從含有該基因的質(zhì)粒的微生物中進(jìn)行的質(zhì)粒DNA分離純化、質(zhì)粒DNA的限制酶切割、切割后的DNA片段的分離純化、DNA片段的酶促結(jié)合、利用重組DNA進(jìn)行的轉(zhuǎn)化等有關(guān)基因重組的各種操作都是按照眾所周知的方法[例如《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989年)(Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989))(以下簡(jiǎn)稱為《分子克隆》第2版)、《分子生物學(xué)中的常規(guī)操作》Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons(1987-1997)(以下簡(jiǎn)稱為《分子生物學(xué)中的常規(guī)操作)》]進(jìn)行的。另外聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(以下簡(jiǎn)稱為PCR)按照眾所周知的方法[《PCR規(guī)則》PCR Protocols,Academic Press(1990)]進(jìn)行的。
為了使與N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙酰甘露糖胺的制造有關(guān)的基因在宿主內(nèi)表達(dá)，將含有該基因的DNA片段用限制性內(nèi)切酶或PCR進(jìn)行處理作成含有該基因的適當(dāng)長(zhǎng)度的DNA片段后，插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體的啟動(dòng)子下游，然后將插入了上述DNA的表達(dá)載體導(dǎo)入適合該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。
作為宿主細(xì)胞可以使用細(xì)菌、酵母等細(xì)胞，只要是能夠表達(dá)目的基因的宿主細(xì)胞都可以用。
作為表達(dá)載體，可以利用在上述宿主細(xì)胞內(nèi)能自主復(fù)制或者能重組到染色體，在能夠轉(zhuǎn)錄目的DNA的位置含有啟動(dòng)子的載體。
用細(xì)菌等原核生物作為宿主細(xì)胞時(shí)，基因表達(dá)載體在原核生物中能自主復(fù)制的同時(shí)，最好是由啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合序列、目的DNA、轉(zhuǎn)錄終止序列構(gòu)成的重組DNA。即使含有控制啟動(dòng)子的基因也可以。
作為表達(dá)載體有pBTrp2、pBTac1、pBTac2、pHelix1(都是ロシツ·ダイアゲノスナイス公司制造的)、pKK233-2、pKK223-3、pGEX(都是Amersham Pharmacia Biotechnology公司出售的)、pSE280(インビトロジエン)、pGEMEX-1(Promega公司制造)、pQE-8、pQE-30(都是キァゲン公司制造)、pET-3(ノバジエン公司制造)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200[農(nóng)業(yè)生物化學(xué)(Agric.Biol.Chem.),48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Pro.Natl.Acad.Sci.,USA),82,4306(1985)]、pBluescript Ⅱ SK+(STRATAGENE公司制造)、pBluescript Ⅱ SK-(STRATAGENE公司制造)、pTrS30[由大腸桿菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制備]、pTrS32[由大腸桿菌JM109/pTrS30(FERM BP-5408)制備]、pUC19[Gene,33,103(1985)]、pSTV28(寶酒造公司制造)、pUC118(寶酒造公司制造)、pPAC31(WO98/12343)、pPA1(特開昭63-233798)、pPA1(特開昭63-233798)等。
作為啟動(dòng)子只要是在大腸桿菌等宿主細(xì)胞中能夠表達(dá)的都可以。例如trp啟動(dòng)子(Ptrp)、lac啟動(dòng)子(Plac)、PL啟動(dòng)子、PR啟動(dòng)子、PSE啟動(dòng)子等、來(lái)自大腸桿菌或噬菌體的啟動(dòng)子、SPO1啟動(dòng)子、SPO2啟動(dòng)子、penP啟動(dòng)子等。而象將兩個(gè)Ptrp直線排列的啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、lacT7啟動(dòng)子、let Ⅰ啟動(dòng)子那樣人為設(shè)計(jì)改變了的啟動(dòng)子也可以利用。
使用將核糖體結(jié)合序列SD(Shine-Dalgarno)序列和起始密碼之間隔有適當(dāng)距離(例如6～18堿基)的質(zhì)粒最理想。
在本發(fā)明的重組DNA中,在目的DNA表達(dá)中不一定需要轉(zhuǎn)錄終止序列，如果設(shè)置，最好是將轉(zhuǎn)錄終止序列設(shè)置在緊靠結(jié)構(gòu)基因的下面。
作為原核生物有屬于埃希氏菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、棒桿菌屬、微桿菌屬、假單孢菌屬的微生物，例如大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌W1485、大腸桿菌NM522、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、無(wú)花果沙雷氏菌Serratia ficaria、居泉沙雷氏菌Serratia fonticola、液化沙雷氏菌Serratia liquefaciens、粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyliliquefaciens、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、解糖短桿菌Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、產(chǎn)氨棒桿菌、谷氨酸棒桿菌ATCC13032、谷氨酸棒桿菌ATCC14067、谷氨酸棒桿菌ATCC13869、嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870、嗜氨微桿菌Microbacteriumammoniaphilum ATCC 15354、Pseudomonas sp.D-0110等。
作為重組DNA的導(dǎo)入方法，只要是能將DNA導(dǎo)入上述宿主細(xì)胞的方法都可以用，例如使用鈣離子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.69,2110(1972)]、原生質(zhì)體法(特開昭63-248394)、電穿孔法[Nucleicacids Res.,16,6127(1988)]等方法。
用酵母菌株作為宿主細(xì)胞時(shí),作為表達(dá)載體可以用YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。
作為啟動(dòng)子，只要是在酵母菌株中能夠表達(dá)的都可以用，例如可以用PHO5啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子、gal 1啟動(dòng)子、gal 10啟動(dòng)子、熱休克多肽啟動(dòng)子、MF α1啟動(dòng)子、CUP 1啟動(dòng)子等。
作為宿主細(xì)胞有屬于酵母屬、裂殖酵母屬Schizosaccharomyces、克魯維酵母屬Kluyveromyces、絲孢酵母屬Tichosporon、許旺酵母屬Schwanniomyces、畢赤酵母屬Pichia、假絲酵母屬Candida的酵母菌株，具體講有釀酒酵母、粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe、乳酸克魯維酵母Kluyveromyces lactis、茁芽絲孢酵母Tichosporonpullulans、河岸許旺酵母Schwanniomyces alluvius、畢赤酵母Pichiapastoris、產(chǎn)朊假絲酵母Candida utilis等。
作為重組DNA的導(dǎo)入方法，只要是能將DNA導(dǎo)入上述酵母的方法都可以用，例如使用電穿孔法[酶學(xué)方法Methods in Enzymol.,194,182(1990)]、原生質(zhì)球法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.81,4889(1984)]、醋酸鋰法[J.Bacteriol.,153,163(1983)]等方法。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法可以按照宿主細(xì)胞培養(yǎng)用的常規(guī)方法進(jìn)行。
作為對(duì)以大腸桿菌等原核生物或酵母等真核生物為宿主得到的轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基，只要是含有該生物能夠消化吸收的碳源、氮源、無(wú)機(jī)物等，能有效進(jìn)行轉(zhuǎn)化菌株培養(yǎng)的培養(yǎng)基，無(wú)論是天然培養(yǎng)基，還是合成的培養(yǎng)基都可以用。
作為碳源只要是該生物能消化吸收的就可以，可以用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有這些糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解產(chǎn)物等碳水化合物、醋酸、丙酸等有機(jī)酸、乙醇、丙醇等醇類。
作為氮源可以用氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸的銨鹽、其它的含氮化合物、以及胨、肉湯、酵母提取液、玉米漿、酪蛋白水解產(chǎn)物、大豆粕和大豆粕水解產(chǎn)物、各種發(fā)酵菌體、以及其消化物。
作為無(wú)機(jī)物可以用磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
培養(yǎng)通常是在振蕩培養(yǎng)或深部通氣攪拌培養(yǎng)等好氧條件下進(jìn)行。培養(yǎng)溫度最好為15～40℃，培養(yǎng)時(shí)間通常為5小時(shí)～7天。培養(yǎng)中pH保持在3.0～9.0。調(diào)pH用無(wú)機(jī)或有機(jī)的酸、堿性溶液、尿素、碳酸鈣、氨等。
另外根據(jù)培養(yǎng)的需要，也可以在培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素或四環(huán)素等抗生素。
對(duì)用含有誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，根據(jù)需要也可以在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物。例如對(duì)用含有l(wèi)ac啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中可以添加異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷等，對(duì)用含有trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中可以添加吲哚丙烯酸等。
作為培養(yǎng)物的處理物有培養(yǎng)物的濃縮物、培養(yǎng)物的干燥物、培養(yǎng)物離心后得到的菌體、該菌體的干燥物、該菌體的冷凍干燥物、該菌體的表面活性劑處理物、該菌體的超聲處理物、該菌體的機(jī)械磨碎處理物、該菌體的溶劑處理物、該菌體的酶處理物、該菌體的蛋白級(jí)分物、該菌體的固定化物或從該菌體提取的酶標(biāo)準(zhǔn)品等。
在N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙酰甘露糖胺的生成中用的微生物量，就所用的各種微生物來(lái)說(shuō)，濕菌體為1～500g/l，理想的是1～300g/l。
作為丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸生成中用的能源，只要是促進(jìn)生成的能源都可以用，葡萄糖或果糖比較合適。這些能源通常使用的濃度為10～300g/l。
作為丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸生成中用的水介質(zhì)，有水、磷酸鹽、碳酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、Tris等緩沖液、甲醇、乙醇等醇類、醋酸乙酯等酯類、丙酮等酮類、乙酰胺等酰胺類。另外N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙酰甘露糖胺生成中用的微生物培養(yǎng)基、培養(yǎng)物等也可以作為水介質(zhì)。
在N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙酰甘露糖胺的生成中根據(jù)需要也可添加植酸等螯合劑、表面活性劑或有機(jī)溶劑。
作為表面活性劑有聚環(huán)氧乙烷·十八(烷)胺(例如ナイミ-ンS-215，日本油脂公司制)等非離子表面活性劑、溴化十六烷基三甲基氨或烷基二甲基芐基氯化銨(例如Cation F2-40E、日本油脂公司制造)等陽(yáng)離子表面活性劑、十二烷酰·肌氨酸苷(ラゥロイルザルコミネ-ト)等陰離子表面活性劑、烷基二甲基胺(例如叔胺FB、日本油脂公司制造)等三級(jí)胺類等，只要是促進(jìn)N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙酰甘露糖胺的生成的都可以用，可以用一種或數(shù)種混合用。所用的表面活性劑的濃度通常為0.1～50g/l。
作為有機(jī)溶劑，有二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮、醋酸乙酯等，通常的使用濃度為0.1～50ml/l。
N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙酰甘露糖胺的生成反應(yīng)是在水介質(zhì)中pH5～10、理想的是pH6～8、20～50℃的條件下進(jìn)行1～96小時(shí)。
為了促進(jìn)該生成反應(yīng)，可添加腺嘌呤、腺苷-5′-一磷酸(AMP)、腺苷-5′-三磷酸、(ATP)硫酸鎂、氯化鎂等。通常使用的腺嘌呤、AMP、ATP濃度為0.01～100mmol/l。
水介質(zhì)中生成的N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙酰甘露糖胺的定量分析可以用Dionex公司制造的糖分析裝置進(jìn)行[分析生物化學(xué)，Anal.Biochem.,189,151(1990)]。
反應(yīng)液中生成的N-乙酰神經(jīng)氨酸或N-乙酰甘露糖胺的提取可以通過(guò)使用活性碳或離子交換樹脂等通常用的方法進(jìn)行。
以下給出本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。實(shí)施例1．來(lái)自大腸桿菌的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因表達(dá)菌株的構(gòu)建按照《分子生物學(xué)中的常規(guī)操作》記載的方法對(duì)大腸桿菌W3110(ATCC27325)培養(yǎng)后，分離純化該微生物的染色體DNA。
利用パ-セプティブ·バイオシステムズ公司制造的8905型DNA合成儀分別合成序列3和序列4記載的DNA引物。
以大腸桿菌W3110(ATCC27325)菌株的染色體DNA作模板，上述合成的DNA為引物，進(jìn)行PCR用含有染色體DNA0.1μg、引物各0.5μmol/l、Pfu DNA聚合酶(STRATAGENE公司制造)2.5單位、Pfu DNA聚合酶用×10緩沖液(STRATAGENE公司制造)4μl、脫氧NTP各200μmol/l的反應(yīng)液40μl，進(jìn)行30輪循環(huán)反應(yīng)，每循環(huán)反應(yīng)過(guò)程為94℃-1分鐘、42℃-2分鐘、72℃-3分鐘。
取該反應(yīng)液的1/10量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)目的片段擴(kuò)增后，添加與剩下的反應(yīng)液等量的TE[10mmol/l Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/l EDTA]飽和酚/氯仿(1vol/1vol)，進(jìn)行混合。將該混合液離心分離后，向得到的上層液中加入2倍容量的冷乙醇，混合。于-80℃下放置30分鐘。然后離心得到DNA沉淀。
將該DNA沉淀溶解于20μl的TE中。取該溶解液5μl，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ切DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，利用genecleanⅡ試劑盒(Bio101公司制造)回收1.2kb片段。用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ切0.2μg的pUC19DNA[Gene,33,103(1985)]，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，回收2.7kb片段。
使用連接反應(yīng)試劑盒于16℃對(duì)上述回收的1.2kb和2.7kb的片段進(jìn)行連接反應(yīng)(進(jìn)行16小時(shí))。用該連接反應(yīng)液按照上述眾所周知的方法對(duì)具有丙酮酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌NM522菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將該轉(zhuǎn)化菌株涂布于含有氨芐青霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基后，于30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
從繁殖起來(lái)的轉(zhuǎn)化菌株的菌落獲得帶有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因nanA的轉(zhuǎn)化菌株大腸桿菌NM522/pTA3。按照常規(guī)方法從該菌株中提取質(zhì)粒，得到N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因表達(dá)質(zhì)粒pTA3。通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化可以確認(rèn)該質(zhì)粒的構(gòu)造(


圖1)。實(shí)施例2．N-乙酰神經(jīng)氨酸的生產(chǎn)將實(shí)施例1中得到的大腸桿菌NM522/pTA3接種于加入了含有氨芐青霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基125ml的容積為1L的帶有折流板的三角燒瓶中，在28℃,220rpm的條件下培養(yǎng)17個(gè)小時(shí)。將該培養(yǎng)液125ml接種于由葡萄糖10g/l、細(xì)菌胰蛋白胨(バクトトリプトン)(デイフコ公司制造)12g/l、酵母提取液(デイフコ公司制造)24g/l、KH2PO4 2.3g/l、K2HPO4 12.5g/l、氨芐青霉素50μg/ml組成的液體培養(yǎng)基(沒(méi)調(diào)pH)2.5L的5L容積的培養(yǎng)槽，于37℃、600rpm、通氣量2.5L/分的條件下培養(yǎng)6小時(shí)。培養(yǎng)過(guò)程中，用28％氨水將培養(yǎng)液的pH維持在7.0。另外根據(jù)培養(yǎng)過(guò)程中的需要添加葡萄糖。將該培養(yǎng)液離心分離，獲得濕菌體。根據(jù)需要可以將該濕菌體于-20℃下保存，使用前解凍。
向200ml容積的燒杯中加入由大腸桿菌NM522/pTA3濕菌體50g/l、果糖65g/l、N-乙酰甘露糖胺40g/l、KH2PO425g/l、MgSO4·7H2O5g/l、植酸5g/l、ナイミ-ン S-215 4g/l、二甲苯10ml/l組成的反應(yīng)液30ml，該反應(yīng)液用磁力攪拌器攪拌(900rpm)，于32℃反應(yīng)25小時(shí)。反應(yīng)中用4N NaOH將該反應(yīng)液的pH維持在7.2，根據(jù)需要添加果糖、KH2PO4。
反應(yīng)結(jié)束后，用ダイオネツクス公司制造的糖分析儀(DX-500)分析反應(yīng)的生成物，確認(rèn)反應(yīng)液中生成了0.34g/l的N-乙酰神經(jīng)氨酸。實(shí)施例3．來(lái)自大腸桿菌的N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因表達(dá)菌株的構(gòu)建按照記載的分子生物學(xué)中的常規(guī)操作方法對(duì)大腸桿菌K235(ATCC13027)進(jìn)行培養(yǎng)后，分離純化該微生物的染色體DNA。
利用パ-セプティブ·バイオシステムズ公司制造的8905型DNA合成儀分別合成序列5和序列6記載的DNA引物。
以大腸桿菌K235(ATCC13027)菌株的染色體DNA作模板，上述合成的DNA為引物，進(jìn)行PCR用含有染色體DNA 0.1μg、引物各0.5μmol/l、Pfu DNA聚合酶(STRATAGENE公司制造)2.5單位、Pfu DNA聚合酶用×10緩沖液(STRATAGENE公司制造)4μl、脫氧NTP各200μmol/l的反應(yīng)液40μl，進(jìn)行30輪循環(huán)反應(yīng)，每循環(huán)反應(yīng)過(guò)程為94℃-1分鐘、42℃-2分鐘、72℃-3分鐘。
取該反應(yīng)液的1/10量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)目的片段擴(kuò)增后，添加與剩下的反應(yīng)液等量的TE飽和酚/氯仿(1vol/1vol)，進(jìn)行混合。將該混合液離心分離后，向得到的上層液中加入2倍容量的冷乙醇，混合。于-80℃下放置30分鐘。然后離心得到DNA沉淀。
將該DNA沉淀溶解于20μl的TE中。取該溶解液5μl，用限制性內(nèi)切酶ClaⅠ和BamHⅠ切DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，利用genecleanⅡ試劑盒(Bio101公司制造)回收1.1kb片段。用限制性內(nèi)切酶ClaⅠ和BamHⅠ切0.2μg的pPAC31 DNA(WO98/12343)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，回收5.5kb片段。
使用連接反應(yīng)試劑盒于16℃對(duì)上述回收的1.1kb和5.5kb的片段進(jìn)行連接反應(yīng)(進(jìn)行16小時(shí))。用該連接反應(yīng)液按照上述眾所周知的方法對(duì)具有磷酸烯醇式丙酮酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌NM522菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將該轉(zhuǎn)化菌株涂布于含有氨芐青霉素50μg／ml的LB瓊脂培養(yǎng)基后，與30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
從繁殖起來(lái)的轉(zhuǎn)化菌株的菌落獲得帶有N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因neuB的轉(zhuǎn)化菌株大腸桿菌NM522/pYP18。根據(jù)常規(guī)方法從該菌株中提取質(zhì)粒，得到N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因表達(dá)質(zhì)粒pYP18。通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化可以確認(rèn)該質(zhì)粒的構(gòu)造(圖2)。實(shí)施例4．N-乙酰神經(jīng)氨酸的生產(chǎn)將實(shí)施例3中得到的大腸桿菌NM522/pYP18接種于加入了含有氨芐青霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基125ml的容積為1L的帶有折流板的三角燒瓶中，在28℃,220rpm的條件下培養(yǎng)17個(gè)小時(shí)。將該培養(yǎng)液125ml接種于由葡萄糖10g/l、細(xì)菌胰蛋白胨(デイフコ公司制造)12g/l、酵母提取液(デイフコ公司制造)24g/l、KH2PO42.3g/l、K2HPO412.5g/l、氨芐青霉素50μg/ml組成的液體培養(yǎng)基(沒(méi)調(diào)pH)2.5L的5L容積的培養(yǎng)槽，于37℃下培養(yǎng)4小時(shí)后，再于40℃下、600rpm、通氣量2.5L/分的條件下培養(yǎng)3小時(shí)。培養(yǎng)過(guò)程中，用28％氨水將培養(yǎng)液的pH維持在7.0。另外根據(jù)培養(yǎng)過(guò)程中的需要添加葡萄糖。
將該培養(yǎng)液離心分離，獲得濕菌體。根據(jù)需要可以將該濕菌體于-20℃下保存，使用前解凍。
向200ml容積的燒杯中加入由大腸桿菌NM522/pYP18濕菌體50g/l、果糖65g/l、N-乙酰甘露糖胺40g/l、KH2PO425g/l、MgSO4·7H2O5g/l、植酸5g/l、ナイミ-ン S-215 4g/l、二甲苯10ml/l組成的反應(yīng)液30ml，該反應(yīng)液用磁力攪拌器攪拌(900rpm)，于32℃反應(yīng)19小時(shí)。反應(yīng)中用4N NaOH將該反應(yīng)液的pH維持在7.2，根據(jù)需要添加果糖、KH2PO4。
反應(yīng)結(jié)束后，用ダイオネツクス公司制造的糖分析儀(DX-500)分析反應(yīng)的生成物，確認(rèn)反應(yīng)液中生成了1.4g/l的N-乙酰神經(jīng)氨酸。實(shí)施例5．N-乙酰神經(jīng)氨酸的生產(chǎn)將實(shí)施例3中得到的大腸桿菌NM522/pYP18菌株按照實(shí)施例2記載的方法進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)離心分離獲得濕菌體。根據(jù)需要可以將該溫菌體于-20℃下保存，使用前解凍。
將產(chǎn)氨棒桿菌ATCC21170菌株接種于加入了由如下試劑組成的液體培養(yǎng)基(用10N NaOH將pH調(diào)到7.2)25ml的容積為300ml的帶有折流板的三角燒瓶中，在28℃,220rpm的條件下培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)。組成液體培養(yǎng)基的試劑有葡萄糖50g/l、聚蛋白胨(ポリペプトン)(日本制藥公司制造)10g/l、酵母提取液(Oriental酶母公司制造)10g/l、尿素5g/l、(NH4)2SO45g/l、KH2PO41g/l、K2HPO43g/l、MgSO4·7H2O1g/l、CaCl2·2H2O 0.1g/l、FeSO4·7H2O 10mg/l、ZnSO4·7H2O 10mg/l、MnSO4·4～6H2O 20mg/l、L-半胱氨酸20mg/l、D-泛酸鈣10mg/l、維生素B1 5mg/l、煙酸5mg/l、以及生物素30μg/l。
將培養(yǎng)液20ml接種于加有與上述同樣組成的液體培養(yǎng)基250ml的容積為2L的帶有折流板的三角燒瓶中，在28℃,220rpm的條件下培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)。得到的培養(yǎng)液用作種子液。
將該種子培養(yǎng)液250ml接種于加入了由如下試劑組成的液體培養(yǎng)基(用10N NaOH將pOOH調(diào)到7.2)2.25L的容積為5L的培養(yǎng)槽中，在32℃,600rpm、通氣量2.5L/分的條件下培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)。培養(yǎng)過(guò)程中，用氨水將培養(yǎng)液的pH維持在6.8。組成液體培養(yǎng)基的試劑為葡萄糖150g/l、肉湯(極東制藥公司制造)5g/l、KH2PO410g/l、K2HPO410g/l、MgSO4·7H2O 10g/l、CaCl2·2H2O 0.1g/l、FeSO4·7H2O 20mg/l、ZnSO4·7H2O 10mg/l、MnSO4·4～6H2O 20mg/l(另外滅菌)、β-丙氨酸15mg/l(另外滅菌)、L-半胱氨酸20mg/l、生物素100μg/l、尿素2g/l、以及維生素B1 5mg/l(另外滅菌)。
將該培養(yǎng)液離心分離，獲得濕菌體。根據(jù)需要可以將該濕菌體于-20℃下保存，使用前解凍。
向200ml容積的燒杯中加入由大腸桿菌NM522/pYP18濕菌體50g/l、產(chǎn)氨棒桿菌ATCC21170菌株濕菌體150g/l、果糖65g/l、N-乙酰甘露糖胺40g/l、KH2PO425g/l、MgSO4·7H2O 5g/l、植酸5g/l、ナイミ-ン S-215 4g/l、二甲苯10ml/l組成的反應(yīng)液30ml，該反應(yīng)液用磁力攪拌器攪拌(900rpm)，于32℃反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)中用4N NaOH將該反應(yīng)液的pH維持在7.2，根據(jù)需要添加果糖、KH2PO4。
反應(yīng)結(jié)束后，用ダイオネツクス公司制造的糖分析儀(DX-500)分析反應(yīng)的生成物，確認(rèn)反應(yīng)液中生成蓄積了3.1g/l的N-乙酰神經(jīng)氨酸。實(shí)施例6．來(lái)自集胞藍(lán)細(xì)菌的N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶基因表達(dá)菌株的構(gòu)建以來(lái)自豬的N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶的氨基酸序列[J.Biol.Chem.,271,16294(1996)]作為搜索項(xiàng)，于基因庫(kù)(Genbank)的Blast Search和作為Synechocystis sp.(PCC6803)菌株的基因組序列的數(shù)據(jù)庫(kù)的CyanoBase(http:∥www.kazusa.or.jp/cyano/)中進(jìn)行同源性檢索(Similarity Search)，檢索結(jié)果表明該氨基酸序列與來(lái)自和作為腎素結(jié)合蛋白(renin-binding protein)記載的Synechocystis sp.(PCC6803)的序列(slr1975)具有很高的同源性。
按照基因微生物學(xué)雜志(J.Gen.Microbiol.),111,1(1979)記載的方法對(duì)Synechocystis sp.(PCC6803)培養(yǎng)后，按《分子生物學(xué)中的常規(guī)操作方法》中記載方法分離純化該微生物的染色體DNA。
利用パ-セプティブ·バイオシステムズ公司制造的8905型DNA合成儀分別合成序列7和序列8記載的DNA引物。以Synechocystis sp.(PCC6803)的染色體DNA作模板，按照實(shí)施例1記載的方法進(jìn)行PCR操作。
取該反應(yīng)液的1/10量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)目的片段擴(kuò)增后，添加與剩下的反應(yīng)液等量的TE飽和酚/氯仿(1vol/1vol)，進(jìn)行混合。
將該混合液離心分離后，向得到的上層液中加入2倍容量的冷乙醇，混合。于-80℃下放置30分鐘。然后離心得到DNA沉淀。
將該DNA沉淀溶解于20μl的TE中。
取該溶解液5μl，用限制性內(nèi)切酶ClaⅠ和BamHⅠ切DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，利用genecleanⅡ試劑盒(Bio101公司制造)回收1.2kb片段。
用限制性內(nèi)切酶ClaⅠ和BamHⅠ切0.2μg的pPAC31 DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，回收5.5kb片段。
使用連接反應(yīng)試劑盒于16℃對(duì)上述回收的1.2kb和5.5kb的片段進(jìn)行連接反應(yīng)(進(jìn)行16小時(shí))。
用該連接反應(yīng)液按照上述眾所周知的方法對(duì)大腸桿菌NM522菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將該轉(zhuǎn)化菌株涂布于含有氨芐青霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基后，與30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。
從繁殖起來(lái)的轉(zhuǎn)化菌株的菌落獲得編碼來(lái)自Synechocystis sp.的N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶的轉(zhuǎn)化菌株大腸桿菌NM522/pYP16。根據(jù)常規(guī)方法從該菌株中提取質(zhì)粒，得到表達(dá)質(zhì)粒pYP16。通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化可以確認(rèn)該質(zhì)粒的構(gòu)造(圖3)。
實(shí)施例7．N-乙酰神經(jīng)氨酸的生產(chǎn)將在實(shí)施例1得到的大腸桿菌NM522/pTA3按照實(shí)施例2記載的方法進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)離心獲得濕菌體。根據(jù)需要可以將該濕菌體于-20℃下保存，使用前解凍。
將實(shí)施例6中得到的大腸桿菌NM522/pYP16菌株接種于加入了含有氨芐青霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基125ml的容積為1L的帶有折流板的三角燒瓶中，在28℃,220rpm的條件下培養(yǎng)17個(gè)小時(shí)。將該培養(yǎng)液125ml接種于由葡萄糖10g/l、細(xì)菌蛋白胨(バクトトリプトン)(デイフコ公司制造)12g/l、酵母提取液(デイフコ公司制造)24g/l、KH2PO42.3g/l、K2HPO412.5g/l、氨芐青霉素50μg/ml組成的液體培養(yǎng)基(沒(méi)調(diào)pH)2.5L的5L容積的培養(yǎng)槽，于30℃培養(yǎng)4小時(shí)后，再于40℃、600rpm、通氣量2.5L/分的條件下培養(yǎng)3小時(shí)。培養(yǎng)過(guò)程中，用28％氨水將培養(yǎng)液的pH維持在7.0。另外根據(jù)培養(yǎng)過(guò)程中的需要添加葡萄糖。
將該培養(yǎng)液離心分離，獲得濕菌體。根據(jù)需要可以將該濕菌體于-20℃下保存，使用前解凍。
按照實(shí)施例5記載的方法培養(yǎng)產(chǎn)氨棒桿菌ATCC21170菌株，經(jīng)離心獲得濕菌體。根據(jù)需要可以將該濕菌體于-20℃下保存，使用前解凍。
向200ml容積的燒杯中加入由大腸桿菌NM522/pTA3濕菌體50g/l、大腸桿菌NM522/pYP16濕菌體50g/l、產(chǎn)氨棒桿菌ATCC 21170濕菌體150g/l、果糖65g/l、N-乙酰葡糖胺180g/l、KH2PO425g/l、MgSO4·7H2O 5g/l、植酸5g/l、ナイミ-ン S-215 4g/l、二甲苯10ml/l組成的反應(yīng)液30ml，該反應(yīng)液用磁力攪拌器攪拌(900rpm)，于32℃反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)中用4N NaOH將該反應(yīng)液的pH維持在7.2，根據(jù)需要添加果糖、KH2PO4。
反應(yīng)結(jié)束后，用ダイオネツクス公司制造的糖分析儀(DX-500)分析反應(yīng)的生成物，確認(rèn)反應(yīng)液中生成了1.0g/l的N-乙酰神經(jīng)氨酸。實(shí)施例8．N-乙酰神經(jīng)氨酸的生產(chǎn)將在實(shí)施例3得到的大腸桿菌NM522/pYP18以及在實(shí)施例6得到大腸桿菌NM522/pYP16菌株按照實(shí)施例4和7記載的方法分別進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)離心獲得濕菌體。根據(jù)需要可以將該濕菌體于-20℃下保存，使用前解凍。
向200ml容積的燒杯中加入由大腸桿菌NM522/pYP16濕菌體50g/l、大腸桿菌NM522/pYP18濕菌體50g/l、果糖65g/l、N-乙酰葡糖胺180g/l、KH2PO425g/l、MgSO4·7H2O 5g/l、植酸5g/l、ナイミ-ン S-215 4g/l、二甲苯10ml/l組成的反應(yīng)液30ml，該反應(yīng)液用磁力攪拌器攪拌(900rpm)，于32℃反應(yīng)11小時(shí)。反應(yīng)中用4N NaOH將該反應(yīng)液的pH維持在7.2，根據(jù)需要添加果糖、KH2PO4。
反應(yīng)結(jié)束后，用ダイオネツクス公司制造的糖分析儀(DX-500)分析反應(yīng)的生成物，確認(rèn)反應(yīng)液中生成了1.3g/l的N-乙酰神經(jīng)氨酸。
實(shí)施例9．N-乙酰神經(jīng)氨酸的生產(chǎn)將實(shí)施例3中得到的大腸桿菌NM522/pYP18以及實(shí)施例6得到的大腸桿菌NM522/pYP16菌株按照實(shí)施例4和7記載的方法分別進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)離心獲得濕菌體。根據(jù)需要可以將該濕菌體于-20℃下保存，使用前解凍。
按照實(shí)施例5記載的方法培養(yǎng)產(chǎn)氨棒桿菌ATCC21170菌株，經(jīng)離心獲得溫菌體。根據(jù)需要可以將該濕菌體于-20℃下保存，使用前解凍。
向200ml容積的燒杯中加入由大腸桿菌NM522/pYP16濕菌體50g/l、大腸桿菌NM522/pYP18濕菌體50g/l、產(chǎn)氨棒桿菌ATCC21170濕菌體150g/l、果糖65g/l、N-乙酰葡糖胺180g/l、KH2PO425g/l、MgSO4·7H2O 5g/l、植酸5g/l、ナイミ-ン S-215 4g/l、二甲苯10ml/l組成的反應(yīng)液30ml，該反應(yīng)液用磁力攪拌器攪拌(900rpm)，于32℃反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)中用4N NaOH將該反應(yīng)液的pH維持在7.2，根據(jù)需要添加果糖、KH2PO4。
反應(yīng)結(jié)束后，用ダイオネツクス公司制造的糖分析儀(DX-500)分析反應(yīng)的生成物，確認(rèn)反應(yīng)液中生成了4.3g/l的N-乙酰神經(jīng)氨酸。實(shí)施例10．N-乙酰神經(jīng)氨酸的生產(chǎn)將實(shí)施例3中得到的大腸桿菌NM522/pYP18以及實(shí)施例6得到的大腸桿菌NM522/pYP16菌株按照實(shí)施例4和7記載的方法分別進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)離心獲得濕菌體。根據(jù)需要可以將該濕菌體于-20℃下保存，使用前解凍。
按照實(shí)施例5記載的方法培養(yǎng)產(chǎn)氨棒桿菌ATCC21170菌株，經(jīng)離心獲得溫菌體。根據(jù)需要可以將該濕菌體于-20℃下保存，使用前解凍。
向200ml容積的燒杯中加入由大腸桿菌NM522/pYP16濕菌體50g/l、大腸桿菌NM522/pYP18濕菌體50g/l、產(chǎn)氨棒桿菌ATCC21170濕菌體150g/l、葡萄糖100g/l、N-乙酰葡糖胺180g/l、腺嘌呤5g/l、KH2PO415g/l、MgSO4·7H2O 5g/l、植酸5g/l、ナイミ-ン S-215 4g/l、二甲苯10ml/l組成的反應(yīng)液30ml，該反應(yīng)液用磁力攪拌器攪拌(900rpm)，于32℃反應(yīng)22小時(shí)。反應(yīng)中用4N NaOH將該反應(yīng)液的pH維持在7.2，根據(jù)需要添加葡萄糖、KH2PO4。
反應(yīng)結(jié)束后，用ダイオネツクス公司制造的糖分析儀(DX-500)分析反應(yīng)的生成物，確認(rèn)反應(yīng)液中生成了12.3g/l的N-乙酰神經(jīng)氨酸。利用本發(fā)明可以不用添加丙酮酸等高價(jià)原料而能有效地制造N-乙酰神經(jīng)氨酸。
本發(fā)明所獲得的各微生物的保藏情況如下大腸桿菌NM522/pTA3(Escherichia coli NM522/pTA3)菌株于2000年8月28交日本國(guó)工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(地址日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目3番，郵政編碼305-8566)保藏，保藏號(hào)FERM BP-7284。
大腸桿菌NM522/pYP18(Escherichia coli NM522/pYP18)菌株于2000年8月28交日本國(guó)工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(地址日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目3番，郵政編碼305-8566)保藏，保藏號(hào)FERM BP-7283。
大腸桿菌NM522/pYP16(Escherichia coli NM522/pYP16)菌株于2000年8月28交日本國(guó)工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(地址日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目3番，郵政編碼305-8566)保藏，保藏號(hào)FERM BP-7282。
序列表&#60110&#62 協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社&#60120&#62 N-乙酰神經(jīng)氨酸的制造方法&#60130&#62 H11-0691N2&#60140&#62&#60141&#62&#60160&#62 8&#60170&#62 PatentIn Ver. 2.0&#60210&#62 1&#60211&#62 391&#60212&#62 PRT&#60213&#62 Synechocystis sp. (PCC6803)&#60400&#62 1Met Ile Ala His Arg Arg Gln Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Tyr Gln Ala1 5 10 15Leu His Gln Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Lys Tyr Ser Leu Asp Arg20 25 30Gln Gly Gly Gly Tyr Phe Thr Cys Leu Asp Arg Lys Gly Gln Val Phe35 40 45Asp Thr Asp Lys Phe Ile Trp Leu Gln Asn Arg Gln Val Trp Gln Phe50 55 60Ala Val Phe Tyr Asn Arg Leu Glu Pro Lys Pro Gln Trp Leu Glu Ile65 70 75 80Ala Arg His Gly Ala Asp Phe Leu Ala Arg His Gly Arg Asp Gln Asp85 90 95Gly Asn Trp Tyr Phe Ala Leu Asp Gln Glu Gly Lys Pro Leu Arg Gln100 105 110Pro Tyr Asn Val Phe Ser Asp Cys Phe Ala Ala Met Ala Phe Ser Gln115 120 125Tyr Ala Leu Ala Ser Gly Ala Gln Glu Ala Lys Ala Ile Ala Leu Gln130 135 140Ala Tyr Asn Asn Val Leu Arg Arg Gln His Asn Pro Lys Gly Gln Tyr145 150 155 160Glu Lys Ser Tyr Pro Gly Thr Arg Pro Leu Lys Ser Leu Ala Val Pro165 170 175Met Ile Leu Ala Asn Leu Thr Leu Glu Met Glu Trp Leu Leu Pro Pro180 185 190Thr Thr Val Glu Glu Val Leu Ala Gln Thr Val Arg Glu Val Met Thr195 200 205Asp Phe Leu Asp Pro Glu Ile Gly Leu Met Arg Glu Ala Val Thr Pro210 215 220Thr Gly Glu Phe Val Asp Ser Phe Glu Gly Arg Leu Leu Asn Pro Gly225 230 235 240His Gly Ile Glu Ala Met Trp Phe Met Met Asp Ile Ala Gln Arg Ser245 250 255Gly Asp Arg Gln Leu Gln Glu Gln Ala Ile Ala Val Val Leu Asn Thr260 265 270Leu Glu Tyr Ala Trp Asp Glu Glu Phe Gly Gly Ile Phe Tyr Phe Leu275 280 285Asp Arg Gln Gly His Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Asp Gln Lys Leu290 295 300Trp Trp Val His Leu Glu Thr Leu Val Ala Leu Ala Lys Gly His Gln305 310 315 320Ala Thr Gly Gln Glu Lys Cys Trp Gln Trp Phe Glu Arg Val His Asp325 330 335Tyr Ala Trp Ser His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly340 345 350Tyr Leu Asn Arg Arg Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Lys Gly Gly Lys355 360 365Trp Lys Gly Cys Phe His Val Pro Arg Ala Leu Trp Leu Cys Ala Glu370 375 380Thr Leu Gln Leu Pro Val Ser385 390&#60210&#62 2&#60211&#62 1173&#60212&#62 DNA&#60213&#62 Synechocystis sp. (PCC6803)&#60400&#62 2atg att gcc cat cgc cgt cag gag tta gcc cag caa tat tac cag gct 48Met Ile Ala His Arg Arg Gln Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Tyr Gln Ala1 5 10 15tta cac cag gac gta ttg ccc ttt tgg gaa aaa tat tcc ctc gat cgc 96Leu His Gln Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Lys Tyr Ser Leu Asp Arg20 25 30cag ggg ggc ggt tac ttt acc tgc tta gac cgt aaa ggc cag gtt ttt 144Gln Gly Gly Gly Tyr Phe Thr Cys Leu Asp Arg Lys Gly Gln Val Phe35 40 45gac aca gat aaa ttc att tgg tta caa aac cgt cag gta tgg cag ttt 192Asp Thr Asp Lys Phe Ile Trp Leu Gln Asn Arg Gln Val Trp Gln Phe50 55 60gcc gtt ttc tac aac cgt ttg gaa cca aaa ccc caa tgg tta gaa att 240Ala Val Phe Tyr Asn Arg Leu Glu Pro Lys Pro Gln Trp Leu Glu Ile65 70 75 80gcc cgc cat ggt gct gat ttt tta gct cgc cac ggc cga gat caa gac 288Ala Arg His Gly Ala Asp Phe Leu Ala Arg His Gly Arg Asp Gln Asp85 90 95ggt aat tgg tat ttt gct ttg gat cag gaa ggc aaa ccc ctg cgt caa 336Gly Asn Trp Tyr Phe Ala Leu Asp Gln Glu Gly Lys Pro Leu Arg Gln100 105 110ccc tat aac gtt ttt tcc gat tgc ttc gcc gcc atg gcc ttt agt caa 384Pro Tyr Asn Val Phe Ser Asp Cys Phe Ala Ala Met Ala Phe Ser Gln115 120 125tat gcc tta gcc agt ggg gcg cag gaa gct aaa gcc att gcc ctg cag 432Tyr Ala Leu Ala Ser Gly Ala Gln Glu Ala Lys Ala Ile Ala Leu Gln130 135 140gcc tac aat aac gtc cta cgc cgt cag cac aat ccc aaa ggt caa tac 480Ala Tyr Asn Asn Val Leu Arg Arg Gln His Asn Pro Lys Gly Gln Tyr145 150 155 160gag aag tcc tat cca ggt act aga ccc ctc aaa tcc ctg gcg gtg ccg 528Glu Lys Ser Tyr Pro GIy Thr Arg Pro Leu Lys Ser Leu Ala Val Pro165 170 175atg att tta gcc aac ctc acc ctg gag atg gaa tgg tta tta ccg cct 576Met Ile Leu Ala Asn Leu Thr Leu Glu Met Glu Trp Leu Leu Pro Pro
180 185 190act acc gtg gaa gag gtg ttg gcc caa acc gtc aga gaa gtg atg acg 624Thr Thr Val Glu Glu Val Leu Ala Gln Thr Val Arg Glu Val Met Thr195 200 205gat ttc ctc gac cca gaa ata gga tta atg cgg gaa gcg gtg acc ccc 672Asp Phe Leu Asp Pro Glu Ile Gly Leu Met Arg Glu Ala Val Thr Pro210 215 220aca gga gaa ttt gtt gat agt ttt gaa ggg cgg ttg ctc aac cca gga 720Thr Gly Glu Phe Val Asp Ser Phe Glu Gly Arg Leu Leu Asn Pro Gly225 230 235 240cac ggc att gaa gcc atg tgg ttc atg atg gac att gcc caa cgc tcc 768His Gly Ile Glu Ala Met Trp Phe Met Met Asp Ile Ala Gln Arg Ser245 250 255ggc gat cgc cag tta cag gag caa gcc att gca gtg gtg ttg aac acc 816Gly Asp Arg Gln Leu Gln Glu Gln Ala Ile Ala Val Val Leu Asn Thr260 265 270ctg gaa tat gcc tgg gat gaa gaa ttt ggt ggc ata ttt tat ttc ctt 864Leu Glu Tyr Ala Trp Asp Glu Glu Phe Gly Gly Ile Phe Tyr Phe Leu275 280 285gat cgc cag ggc cac cct ccc caa caa ctg gaa tgg gac caa aag ctc 912Asp Arg Gln Gly His Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Asp Gln Lys Leu290 295 300tgg tgg gta cat ttg gaa acc ctg gtt gcc cta gcc aag ggc cac caa 960Trp Trp Val His Leu Glu Thr Leu Val Ala Leu Ala Lys Gly His Gln305 310 315 320gcc act ggc caa gaa aaa tgt tgg caa tgg ttt gag cgg gtc cat gat 1008Ala Thr Gly Gln Glu Lys Cys Trp Gln Trp Phe Glu Arg Val His Asp325 330 335tac gcc tgg agt cat ttc gcc gat cct gag tat ggg gaa tgg ttt ggc 1056Tyr Ala Trp Ser His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly340 345 350tac ctg aat cgc cgg gga gag gtg tta ctc aac cta aaa ggg ggg aaa 1104Tyr Leu Asn Arg Arg Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Lys Gly Gly Lys355 360 365tgg aaa ggg tgc ttc cac gtg ccc cga gct ctg tgg ctc tgt gcg gaa 1152Trp Lys Gly Cys Phe His Val Pro Arg Ala Leu Trp Leu Cys Ala Glu370 375 380act ctc caa ctt ccg gtt agt 1173Thr Leu Gln Leu Pro Val Ser385 390&#60210&#62 3&#60211&#62 24&#60212&#62 DNA&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 合成DNA&#60400&#62 3gtgtaagctt tctgtatggg gtgt24&#60210&#62 4&#60211&#62 26&#60212&#62 DNA&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 合成DNA&#60400&#62 4gcagggatcc caaccaggca gcggaa26&#60210&#62 5&#60211&#62 32&#60212&#62 DNA&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 合成DNA&#60400&#62 5tttatcgata ttaattaggg ggaatgaatg ag 32&#60210&#62 6&#60211&#62 33&#60212&#62 DNA&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 合成DNA&#60400&#62 6tttggatcct cattattccc cctgattttt gaa 33&#60210&#62 7&#60211&#62 36&#60212&#62 DNA&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 合成DNA&#60400&#62 7taaatcgata tttgtatgat tgcccatcgc cgtcag36&#60210&#62 8&#60211&#62 36&#60212&#62 DNA&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 合成DNA&#60400&#62 8aaaggatcct taactaaccg gaagttggag agtttc3權(quán)利要求
1．N-乙酰神經(jīng)氨酸的制造方法，其特征是使水介質(zhì)中①含有具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶或N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶活性的微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物，②在上述①中使用具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性的微生物時(shí)，含有具有丙酮酸生成能力的微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物，在上述①中使用具有N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶活性的微生物時(shí)，含有具有磷酸烯醇式丙酮酸生成能力的微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物，③含有N-乙酰甘露糖胺、以及④丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸生成時(shí)所必需的能源，使N-乙酰神經(jīng)氨酸在該水介質(zhì)中生成、蓄積，從該水介質(zhì)中提取N-乙酰神經(jīng)氨酸。
2．權(quán)利要求1記載的制造方法，N-乙酰甘露糖胺是通過(guò)使水介質(zhì)中含有具有N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶活性的微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物以及N-乙酰葡糖胺，然后使N-乙酰甘露糖胺在該水介質(zhì)中生成、蓄積得到的。
3．權(quán)利要求2記載的制造方法，具有N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶活性的微生物是帶有重組DNA的微生物，該重組DNA是由編碼N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶的DNA片段與載體重組形成的。
4．權(quán)利要求3記載的制造方法，編碼N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶的DNA是來(lái)自屬于集胞藍(lán)細(xì)菌屬的微生物的DNA。
5．權(quán)利要求3或4記載的制造方法，編碼N-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶的DNA是以下(a)或(b)中的DNA(a)編碼由序列1記載的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA，(b)具有序列2記載的堿基序列的DNA。
6．權(quán)利要求1～5記載的任一種制造方法，具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性的微生物是屬于埃希氏菌屬或棒桿菌屬的微生物。
7．權(quán)利要求1～6記載的任一種制造方法，具有N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶活性的微生物是從屬于埃希氏菌屬、奈瑟氏球菌屬、鏈球菌屬的微生物中選出來(lái)的微生物。
8．權(quán)利要求1～7記載的任一種制造方法，具有丙酮酸生成能力的微生物是從屬于埃希氏菌屬、棒桿菌屬和酵母屬的微生物中選出來(lái)的微生物。
9．權(quán)利要求1～8記載的任一種制造方法，具有磷酸烯醇式丙酮酸生成能力的微生物是從屬于埃希氏菌屬、棒桿菌屬和酵母屬的微生物中選出來(lái)的微生物。
10．權(quán)利要求6～9記載的任一種制造方法，屬于埃希氏菌屬的微生物是大腸桿菌。
11．權(quán)利要求6、8或9記載的制造方法，屬于棒桿菌屬的微生物是產(chǎn)氨棒桿菌、谷氨酸棒桿菌、嗜乙酰乙酸棒桿菌。
全文摘要
本發(fā)明提供不用添加丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸等高價(jià)原料,而能便宜地制造N－乙酰神經(jīng)氨酸的方法。N－乙酰神經(jīng)氨酸的制造方法,是在水介質(zhì)中培養(yǎng)具有N－乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶或N－乙酰神經(jīng)氨酸合成酶活性的微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物等,使N－乙酰神經(jīng)氨酸在水介質(zhì)中生成、蓄積,從該水介質(zhì)中提取N－乙酰神經(jīng)氨酸。
文檔編號(hào)C12N9/88GK1286308SQ0012640
公開日2001年3月7日 申請(qǐng)日期2000年8月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月30日
發(fā)明者小泉聰司, 田畑和彥, 遠(yuǎn)藤?gòu)胤? 尾崎明夫 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社