專(zhuān)利名稱(chēng)：歐米加－海螺毒素變體多肽的基因序列、氨基酸序列以及它們的制備方法和醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及歐米加-海螺毒素(MVIIA)變體多肽的氨基酸及基因序列及這些多肽的制備方法，以及用MVIIA變體多肽治療疼痛及減少神經(jīng)細(xì)胞損傷。
天然歐米加-海螺毒素(MVIIA)是一個(gè)由二十五個(gè)氨基酸組成的多肽[1]，它是N-型鈣離子通道的抑制劑，該離子通道主要分布在神經(jīng)組織上，參與神經(jīng)沖動(dòng)，包括痛覺(jué)的傳導(dǎo)，通過(guò)抑制N-型鈣離子通道的活力可以抑制痛覺(jué)傳導(dǎo)[4、5]，且在神經(jīng)細(xì)胞受到傷害性刺激時(shí)，可以減少或防止神經(jīng)細(xì)胞的損傷及死亡[6、7]。
本發(fā)明所涉及的歐米加-海螺毒素(MVIIA)變體也是一組由二十五個(gè)氨基酸組成的多肽，它們與天然歐米加-海螺毒素(MVIIA)的不同之處在于其第十二位的氨基酸。在天然歐米加-海螺毒素(MVIIA)中，該位點(diǎn)為甲硫氨酸(Met)，而在本發(fā)明所涉及的變體中，該位點(diǎn)為丙氨酸(Ala)，或甘氨酸(Gly)，或亮氨酸(Leu)，或異亮氨酸(Ile)，或纈氨酸(Val)。這些變體也是N-型鈣離子通道的抑制劑，但由于氨基酸組成的變異，使得這些變體獲得了天然多肽母體所不具有的性質(zhì)。
天然海螺毒素可以從海螺中用生物提取的方法獲得，亦可用多肽化學(xué)合成的方法獲得。這二種方法均有局限性，如原料來(lái)源的局限性，或生產(chǎn)成本昂貴等等。天然歐米加-海螺毒素(MVIIA)中的甲硫氨酸(Met)在空氣中易被氧化，其結(jié)果是使該多肽喪失N-型鈣離子通道抑制劑的活力。本發(fā)明包含的內(nèi)容之一為設(shè)計(jì)和產(chǎn)生天然歐米加-海螺毒素(MVIIA)的變體以及制備這些變體多肽的方法，以克服上述缺點(diǎn)。
現(xiàn)有的鎮(zhèn)痛藥物有許多局限性，比如以嗎啡為代表的鴉片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥會(huì)導(dǎo)致人體對(duì)其產(chǎn)生耐受性[2]，為達(dá)到滿意的鎮(zhèn)痛療效，嗎啡的用藥劑量必須不斷增加，而劑量的增加又導(dǎo)致副作用的增加，其二，嗎啡對(duì)某些疼痛，如某些神經(jīng)性疼痛，晚期腫瘤病人的疼痛無(wú)明顯療效。嗎啡的另一缺點(diǎn)是它能導(dǎo)致人體對(duì)它的成癮性及依賴(lài)性[2]。由于缺乏有效且副作用小的鎮(zhèn)痛藥，許多病人的疼痛得不到適當(dāng)?shù)逆?zhèn)痛治療，尤其是手術(shù)后病人的疼痛及以那些對(duì)嗎啡不敏感的病人的疼痛。本發(fā)明包含的另一內(nèi)容是用歐米加-海螺毒素(MVIIA)變體多肽治療疼痛及保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，使其免受損傷。
本發(fā)明的目的就是為了解決上述問(wèn)題，提出一種歐米加-海螺毒素變體多肽的基因序列、氨基酸序列以及它們的制備方法和醫(yī)藥用途。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案Ⅰ．歐米加-海螺毒素(MVIIA)變體多肽的特點(diǎn)天然歐米加-海螺毒素(MVIIA)與本發(fā)明所涉及的其變體的區(qū)別在于第十二位的氨基酸，在天然產(chǎn)物中該位為甲硫氨酸，在本發(fā)明所涉及的變體中為丙氨酸(Ala)，或甘氨酸(Gly)，或亮氨酸(Leu)，或異亮氨酸(Ile)，或纈氨酸(Val)。變體具有如下特性1．某些變體比天然歐米加-海螺毒素(MVIIA)對(duì)N-型膜電位敏感型鈣離子通道(VSCC)具有更強(qiáng)的親和力。實(shí)驗(yàn)表明，12位為丙氨酸取代的變體(Ala12-MVIIA)比天然MVIIA對(duì)VSSC的親和力增加了20％，因此是一個(gè)比天然產(chǎn)物更強(qiáng)的N-型VSCC抑制劑。
2．變體具有比天然歐米加-海螺毒素(MVIIA)更高的穩(wěn)定性天然歐米加-海螺毒素的稀溶液在空氣中極不穩(wěn)定，其生物活力很快降低或消失。導(dǎo)致該不穩(wěn)定性的原因是因?yàn)槠?2位的甲硫氨酸(Met)被氧化。12位甲硫氨酸被氧化的MVIIA比其還原型的生物活力降低10倍以上。在本發(fā)明所涉及的變體中，12位的甲硫氨酸被不易被氧化的氨基酸取代，使變體在空氣中極其穩(wěn)定，為證實(shí)本發(fā)明而做的實(shí)驗(yàn)表明0．1 mg／ml的天然MVIIA水溶液或生理鹽水溶液在室溫下很快被氧化而失去生物活力，而0．1 mg／ml的12位為丙氨酸的變體(Ala12-MVIIA)水溶液或生理鹽水溶液在室溫下4星期后仍保持其生物活力。
3．變體比天然歐米加-海螺毒素(MVIIA)更利于用本發(fā)明所涉及的原核或真核表達(dá)系統(tǒng)制備相應(yīng)多肽。
本發(fā)明涉及的生產(chǎn)該多肽的方法之一為將變體多肽基因的DNA序列串聯(lián)成基因的多聚體，基因與基因之間放置特定的間隔序列。由此形成的基因多聚體在原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中翻譯成變體多肽的多聚體。該多聚體中各單體多肽之間由含有甲硫氨酸的間隔序列分開(kāi)。利用溴化氰可以斷裂甲硫氨酸的羧基參與形成的肽鍵的特點(diǎn)，將變體多肽的多聚體斷裂成單體(詳見(jiàn)實(shí)例一)。天然歐米加-海螺毒素(MVIIA)的序列中含有一個(gè)甲硫氨酸(第十二位)，因而不能用溴化氰水解的方法制備。Ⅱ．歐米加-海螺毒素(MVIIA)及其變體多肽的制備用基因工程的方法在原核或真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)歐米加-海螺毒素(MVIIA)及其變體多肽為本發(fā)明的內(nèi)容之一。其方法如下在歐米加-海螺毒素及其變體多肽基因的DNA序列5’及3’端分別加上同尾酶的識(shí)別序列，所謂同尾酶是指限制性內(nèi)切酶中具有識(shí)別和水解不同核苷酸順序，但產(chǎn)生相同粘性末端的限制性內(nèi)切酶。由此產(chǎn)生的粘性未端相連后不能再被同尾酶識(shí)別及切割。例如Pst Ⅰ和Nsi Ⅰ分別識(shí)別和水解不同的核苷酸序列，CTGCAG為Pst Ⅰ的識(shí)別序列，ATGCAT為Nsi Ⅰ的識(shí)別序列。二者水解其識(shí)別序列的核苷酸后產(chǎn)生相同的粘性末端TGCA。將這二個(gè)酶形成的粘性末端相連后產(chǎn)生一新的核苷酸序列ATGCAG，它不能被Pst Ⅰ或NsiⅠ再切開(kāi)。通過(guò)重復(fù)同尾酶水解，連接反應(yīng)等步驟，構(gòu)建多肽基因的重復(fù)串聯(lián)多聚體，由此形成的多聚體中，基因單體與單體之間有一段間隔序列，這段序列包括由DNA限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列相連而成的序列，以及根據(jù)需要而在DNA限制性內(nèi)切酶的3’或5’端添加的特定核苷酸序列。將多肽基因的串聯(lián)多聚體用基因工程的方法在原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)成多肽的串聯(lián)多聚體，間隔序列翻譯成的氨基酸將被用來(lái)作為將多肽的串聯(lián)多聚體加工成單體的斷裂及加工位點(diǎn)。多聚體斷裂、加工成單體的方法可以用化學(xué)反應(yīng)或酶切反應(yīng)。
本發(fā)明所涉及的多肽生產(chǎn)方法與其它的方法(如從海螺中提取或用多肽化學(xué)合成法)相比具有如下特點(diǎn)①生產(chǎn)成本低；用本發(fā)明所涉及的方法生產(chǎn)歐米加-海螺毒素(MVIIA)及其變體多肽的成本為用多肽化學(xué)合成法生產(chǎn)成本的1／8-1／16。②對(duì)環(huán)境的污染少。
實(shí)例一具體示范了用本發(fā)明所涉及的方法制備歐米加-海螺毒素(MVIIA)變體多肽的方法之一。在該例中，第12位的氨基酸為丙氨酸(Ala)，變體多肽的代號(hào)為Ala12-MVIIA。Ⅲ．用歐米加-海螺毒素變體多肽治療疼痛歐米加-海螺毒素(MVIIA)及其變體多肽是N-型膜電位敏感型鈣離子通道(VSCC)的抑制劑。該離子通道僅存在于神經(jīng)細(xì)胞上，主要分布在胞體，樹(shù)突，樹(shù)突體及突觸前端。其功能為調(diào)節(jié)去極化導(dǎo)致的鈣流入，從而控制一系列細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度依賴(lài)性的過(guò)程，如神經(jīng)細(xì)胞的興奮性，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[3]，第二信使系統(tǒng)的激活及基因轉(zhuǎn)錄。歐米加-海螺毒素(MVIIA)及其變體多肽鎮(zhèn)痛的機(jī)制之一是通過(guò)抑制N-型VSCC而抑制痛覺(jué)傳入神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)，從而阻止痛覺(jué)信號(hào)的傳導(dǎo)。
用歐米加-海螺毒素及其變體多肽作鎮(zhèn)痛治療具有如下特點(diǎn)1．具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛效率其鎮(zhèn)痛效率比目前臨床上使用的最強(qiáng)的鎮(zhèn)痛藥嗎啡高1000倍以上，且鎮(zhèn)痛效果可以維持很長(zhǎng)時(shí)間。臨床實(shí)驗(yàn)表明骨轉(zhuǎn)移的腫瘤病人在對(duì)嗎啡已不再敏感以后，通過(guò)蛛網(wǎng)膜下腔給予0．02微克Ala12-MVIIA(12位為丙氨酸的MVIIA變體)，疼痛消失，且無(wú)疼痛狀態(tài)維持了72小時(shí)。
2．歐米加-海螺毒素(MVIIA)變體多肽不導(dǎo)致人體對(duì)其的耐受性，因而在連續(xù)使用時(shí)不需要增加劑量。
3．副作用小。以嗎啡為代表的鴉片類(lèi)(opioids)鎮(zhèn)痛藥導(dǎo)致人體對(duì)其的耐受性，用藥劑量需不斷增加，因而副作用也不斷增加。歐米加-海螺毒素變體多肽具有較專(zhuān)一的作用位點(diǎn)，且用藥劑量少，鎮(zhèn)痛效果強(qiáng)，因而副作用小。
4．無(wú)成癮性，可以長(zhǎng)期使用。
用歐米加-海螺毒素作鎮(zhèn)痛治療的適用癥即可以是對(duì)鴉片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥敏感的疼痛，也可以是對(duì)鴉片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥不敏感的疼痛。
用歐米加-海螺毒素治療疼痛的給藥途徑可以是任意一種有療效的給藥途徑，舉例如下1．蛛網(wǎng)膜下腔給藥，2．硬膜外給藥，3．口服，4．鼻粘膜給藥，5．通過(guò)皮膚表面吸收，6．將藥品直接給在疼痛部位或其附近，如傷口及神經(jīng)等附近。7．血管內(nèi)給藥，8．肌肉注射給藥，等等。
根據(jù)各種給藥途徑的特點(diǎn)，可以采取一些措施以增加療效。如使用脂質(zhì)體、表面活性劑、高滲鹽溶液、多聚體離子交換等方法，以增加多肽對(duì)硬膜、皮膚、鼻粘膜等的通透性；口服給藥時(shí)，可以將多肽包在微膠囊中。某些給藥途徑可以用輸液泵連續(xù)給藥，如硬膜外或蛛網(wǎng)膜下腔給藥；某些給藥途徑可以將多肽緩慢釋放，如通過(guò)表皮吸收給藥，或?qū)⒍嚯陌裨趥诘目p線中。
用歐米加-海螺毒素變體多肽治療疼痛的幾個(gè)實(shí)例如下1．手術(shù)后病人的鎮(zhèn)痛手術(shù)病人往往在術(shù)前已有蛛網(wǎng)膜下腔插管，術(shù)后將變體多肽一次性，或間斷，或連續(xù)給入蛛網(wǎng)膜下腔，用以控制疼痛。
2．腫瘤病人晚期疼痛的治療這些病人往往已對(duì)鴉片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥不敏感。可以通過(guò)輸液泵將變體多肽輸入硬膜外或蛛網(wǎng)膜下腔；可以連續(xù)給藥，也可以由病人自控給藥，或間斷給藥。
3．神經(jīng)性疼痛的治療這些病人的疼痛往往很劇烈，且對(duì)鴉片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥不敏感?？梢酝ㄟ^(guò)蛛網(wǎng)膜下腔或硬膜外用輸液泵給藥的方式，長(zhǎng)期連續(xù)給藥，或病人自控給藥，也可以將變體多肽直接給入病變的神經(jīng)附近。Ⅳ用歐米加-海螺毒素及其變體多肽保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞病理情形下，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷及死亡的重要原因，缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷或死亡即是實(shí)例之一。N-型膜電位敏感型鈣離子通道(VSCC)是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高的途徑之一。歐米加-海螺毒素變體多肽是N-型VSCC的抑制劑，它通過(guò)抑制N-型VSCC從而抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高[8]。為證實(shí)本發(fā)明而做的實(shí)驗(yàn)表明大鼠大腦全球性缺氧15分鐘后，通過(guò)靜脈一次性給入Ala12-MVIIA 5 mg／kg，神經(jīng)細(xì)胞的死亡可以減少5-8倍，且15分鐘缺氧處理后恢復(fù)給氧6小時(shí)至24小時(shí)給入Ala12-MVIIA，均可觀察到類(lèi)似的結(jié)果。
本發(fā)明涉及了用歐米加-海螺毒素變體多肽治療任何原因造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷，尤其包括缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷。導(dǎo)致缺氧的原因很多，腦中風(fēng)和腦創(chuàng)傷為二個(gè)實(shí)例。給藥途徑可以是任何一種能達(dá)到療效的方法，但靜脈給藥是一個(gè)最簡(jiǎn)便易行的途徑。
實(shí)例一 用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Ala12-MVIIA(12位為丙氨酸的歐米加-海螺毒素MVIIA)1．Ala12-MVIIA單體基因的構(gòu)建Ala12-MVIIA基因單體用DNA合成儀合成。所有氨基酸的密碼子均選用在大腸桿菌中有較高表達(dá)效率的密碼子，合成產(chǎn)物用HPLC純化。
2．Ala12-MVIIA表達(dá)基因的構(gòu)建為了在大腸桿菌中表達(dá)Ala12-MVIIA的多聚體，需在Ala12-MVIIA基因單體的5’及3’端添加一核苷酸序列，其中包括克隆時(shí)需要的限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，供多體加工成單體時(shí)使用的氨基酸的密碼子等。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)完成單體基因5’及3’端的修飾，PCR的引物序列如下5’引物5’C A T A T G C T G C A G A T G T G C A A A G G T A A A G G TG C TNde Ⅰ Pst Ⅰ Met 123 4 56Ala12-MVIIA3’引物5’C T C G A G A T G C A T A C C G C A T T T A C C G G A A C G G C A G GA A C CXho ⅠNsi Ⅰ Gly 25 24 23 22 21 20 19 18Ala12-MVIIA5’引物包括了二個(gè)限制性內(nèi)切酶(Nde Ⅰ及Pst Ⅰ)的識(shí)別及切割位點(diǎn)，甲硫氨酸的密碼子，Ala12-MVIIA第一到第五氨基酸的核苷酸序列。3’引物包含了二個(gè)限制性內(nèi)切酶(Xho Ⅰ及Nsi Ⅰ)的識(shí)別及切割位點(diǎn)，甘氨酸的密碼子，Ala12-MVIIA第18到25位氨基酸的核苷酸序列。甲硫氨酸和甘氨酸是將Ala12-MVIIA多聚體加工成單體時(shí)的加工／斷裂位點(diǎn)。
以DNA合成儀合成的Ala12-MVIIA單體基因?yàn)槟０澹?’及3’引物為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，將純化后的反應(yīng)產(chǎn)物，即Ala12-MVIIA基因單體，用TA克隆的方法克隆到TA 2-1質(zhì)粒中，所得質(zhì)粒為Ala12-MVIIA／TA質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E coli Top10中，制備Ala12-MVIIA／TA質(zhì)粒DNA并通過(guò)序列測(cè)定驗(yàn)證其正確性。
3．Ala12-MVIIA基因多聚體的構(gòu)建將Ala12-MVIIA／TA質(zhì)粒用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切割，得到二個(gè)DNA片段含有TA載體質(zhì)粒的TA／BamH Ⅰ，Xho Ⅰ片段及含有Ala12-MVIIA基因單體的Ala12-MVIIA／BamH Ⅰ，Xho Ⅰ片段。
將分離純化的Ala12-MVIIA／BamH Ⅰ，Xho Ⅰ片段分成二部分一部分用Pst Ⅰ酶切割，另一部分用Nsi Ⅰ酶切割。Pst Ⅰ和Nsi Ⅰ為同尾酶，即它們識(shí)別和切割不同的DNA序列，但產(chǎn)生同樣的粘性末端。將含有這兩個(gè)酶產(chǎn)生的粘性末端的DNA片段連接在一起即形成Ala12-MVIIA基因的二體，且不再能被Pst Ⅰ或Nsi Ⅰ中的任何一個(gè)酶切開(kāi)。將Ala12-MVIIA基因雙體克隆到TA載體質(zhì)粒的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ位點(diǎn)之間，即形成含有Ala12-MVIIA基因的二體的質(zhì)粒Ala12-MVIIA Ⅱ／TA質(zhì)粒。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E．coli Top 10以擴(kuò)增、制各質(zhì)粒DNA。
以Ala12-MVIIAII／TA為起始單元，從重復(fù)上述步驟即得到含有Ala12-MVIIA基因四體Ala12-MVIIA ⅣV／TA質(zhì)粒。以Ala12-MVIIA Ⅳ／TA為起始單元，重復(fù)上述步驟即可得到八體基因多聚體Ala12-MVIIA Ⅷ／TA質(zhì)粒。測(cè)定八聚體的DNA序列以證明其正確性。
4．多聚體Ala12-MVIIA Ⅷ／pET29a表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將Ala12-MVIIA基因八聚體從Ala12-MVIIA Ⅷ／TA質(zhì)粒中用Nde Ⅰ及XhoⅠ切出，重新克隆到表達(dá)質(zhì)粒pET 29a的Nde Ⅰ及Xho Ⅰ位點(diǎn)之間。
將Ala12-MVIIA Ⅷ／pET29a轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中即形成工程菌Ala12-MVIIA Ⅷ／pET29a／BL21(DE3)。
5．Ala12-MVIIA多肽多聚體的表達(dá)及純化挑取工程菌Ala12-MVIIA Ⅷ／pET29a／BL21(DE3)單菌落培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜菌按2％按種至液體培養(yǎng)基如LB中，在37℃培養(yǎng)至0D600=0．8，加入0．5mM IPTG誘導(dǎo)Ala12-MVIIA八聚體多肽的表達(dá)，誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，然后離心收集菌體。用pET29a表達(dá)載體所表達(dá)的產(chǎn)物的C末端帶有6個(gè)組氨酸(His)，因而可以用Ni-Sephorose親和層析純化Ala12-MVIIA八聚體多肽，產(chǎn)物經(jīng)SDS電泳鑒定純度在90％以上，Ala12-MVIIA Ⅷ／pET29a質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物如下 溴化氰Amidase斷裂位點(diǎn)作用位點(diǎn)6．Ala12-MVIIA多肽多聚體的化學(xué)裂解及單體純化將純化后的Ala12-MVIIA多聚體按1 mg／ml的濃度溶于溴化氰溶液中，溴化氰溶液用70％的甲酸配制，濃度為5 mg／ml。將Ala12-MVIIA多聚體的溴化氰溶液在室溫置通風(fēng)櫥中反應(yīng)24小時(shí)，以斷裂甲硫氨酸的羧基參與形成的肽鍵，本例中為Met-Cys之間的肽鍵。反應(yīng)完畢后加入8倍體積的10M NaOH以中和溴化氰。將裂解產(chǎn)物超濾，脫鹽，凍干。RP-HPLC純化。加5mM的β-Me 40℃ 6小時(shí)。稀釋100倍，敞口避光空氣氧化數(shù)日，用艾倫試劑測(cè)量無(wú)游離巰基時(shí)，透析，超濾濃縮后溶于磷酸緩沖液中，用Amidase斷裂由甘氨酸(Gly)氨基參與形成的肽鍵，在本例中為Cys-Gly，其反應(yīng)結(jié)果是使半胱氨酸的羧基酰胺化，反應(yīng)結(jié)束后加三氯醋酸終止反應(yīng)。RP-HPLC純化。附圖
是Ala12-MVIIA基因雙體的構(gòu)建示意圖。如附圖將二端加有限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的Ala12-MVIIA基因DNA單體克隆到TA 2-1載體質(zhì)粒中，所得質(zhì)粒為Ala12-MVIIA／TA。用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ將Ala12-MVIIA基因切出，并進(jìn)一步用Nsi Ⅰ或Pst Ⅰ消化，將酶切產(chǎn)物與經(jīng)BamH Ⅰ和Xho Ⅰ切割的TA 2-1質(zhì)粒用連接酶相連，其產(chǎn)物為含有Ala12-MVIIA基因雙體的質(zhì)粒Ala12-MVIIA Ⅱ／TA。附件天然歐米加-海螺毒素(MVIIA)及本發(fā)明所涉及的其變體多肽的氨基酸序列。序列Ⅰ(Ala12-MVIIA)C K G K G A K C S R L A Y D C C T G S C R S G K C序列ⅡC K G K G A K C S R L G Y D C C T G S C R S G K C序列ⅢC K G K G A K C S R L L Y D C C T G S C R S G K C序列ⅣC K G K G A K C S R L I Y D C C T G S C R S G K C序列ⅤC K G K G A K C S R L V Y D C C T G S C R S G K C天然歐米加-海螺毒素(MVIIA)C K G K G A K C S R L M Y D C C T G S C R S G K C參考文獻(xiàn)1．Olivera Bm．，Gray WR．，Zeikus R．，McIntosh JM．，Varga J．，RivierJ．，Santos V．，Cruz LJ． (1985)Peptide Neurotoxins from fish-hunting cone snails． Science 2301338-432．Wang YX．，Gao D．，Pettus M．，Phillips C．，BowersoxSS．(2000)Interactions of intrathecally administeredziconotide，a selective blocker of neuronal N-type voltage-sensitive calcium channels， with morphine on nociceptions inrats．Pain84271-2813．SeagarM．，Takahashi M． Interactions between presynaptic calciumchannels and proteins implicated in synaptic vesicle tratfickingand exocytosis．Journal of Bioenergelics and Biomembranes30(4)347-564．White DM．，Cousins MJ．(1998) Effect of subcutaneousadministration of calcium channel blockers on nerve injury-induced hyperalgesia． Brain Research 801(1-2)50-85．Malmberg AB．，Yaksh TL．(1995)Effect of continuous intrathecalinfusion of omega-conopeptides，N-type calcium-channel blockers，on behavior and antinociception in the formalin and hot-platetests in rats． Pain 60(1) 83-906．Imaizumi T．，Kocsis JD．，Waxman SG．(1999)The role of voltage gatedCa2+channels in anoxic injury of spinal cord white matter．BrainResearch 817 (1-2) 84-927．Takizawa S．，Matsushima K．，F(xiàn)ujita H．，Nanri K．，Ogawa S．，Shinohara Y．(1995)A selective N-type calcium channel antagonistreduces extracellular glutamate release and infarct volume infocal cerebral ischemia．Journal of Cerebral Blood flow andMetabolism 15 (4) 611-88．Samii A．，Badie H．，F(xiàn)u K．，Luther RR．，Hovda DA．(1999) Effectsof an N-type calcium channel antagonist (SNX 111；Ziconotide)oncalcium-45 accumulation following fluid-percussion infury．Journal of Neurotrauma 16(10)879-92．
權(quán)利要求
1．一種歐米加-海螺毒素變體多肽的氨基酸序列Ⅰ，其特征在于將天然歐米加-海螺毒素的第12位的甲硫氨酸(Met)改為丙氨酸(Ala)，其氨基酸序列Ⅰ為1 5 101520 25C K G K G A K C S R L A Y D C C T G S C R S G K C
2．一種歐米加-海螺毒素變體多肽的氨基酸序列Ⅱ，其特征在于將天然歐米加-海螺毒素的第12位的甲硫氨酸(Met)改為甘氨酸(Gly)，其氨基酸序列Ⅱ?yàn)? 51015 20 25C K G K G A K C S R L G Y D C C T G S C R S G K C
3．一種歐米加-海螺毒素變體多肽的氨基酸序列Ⅲ，其特征在于將天然歐米加-海螺毒素的第12位的甲硫氨酸(Met)改為亮氨酸(Leu)，其氨基酸序列Ⅲ為1 51015 20 25C K G K G A K C S R L L Y D C C T G S C R S G K C
4．一種歐米加-海螺毒素變體多肽的氨基酸序列Ⅳ，其特征在于將天然歐米加-海螺毒素的第12位的甲硫氨酸(Met)改為異亮氨酸(Ile)，其氨基酸序列Ⅳ為1 51015 20 25C K G K G A K C S R L I Y D C C T G S C R S G K C
5．一種歐米加-海螺毒素變體多肽的氨基酸序列Ⅴ，其特征在于將天然歐米加-海螺毒素的第12位的甲硫氨酸(Met)改為纈氨酸(Val)，其氨基酸序列Ⅴ為15 10 15 20 25C K G K G A K C S R L V Y D C C T G S C R S G K C
6．翻譯產(chǎn)物的氨基酸序列分別為序列Ⅰ，序列Ⅱ，序列Ⅲ，序列Ⅳ，序列Ⅴ的DNA序列。
7．用原核或真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備歐米加-海螺毒素(MVIIA)及其變體多肽。
8．一種歐米加-海螺毒素(MVIIA)及其變體多肽的制備方法，其特征在于在DNA水平上，將歐米加-海螺毒素(MVIIA)及其變體多肽的基因串聯(lián)成多聚體，用原核或真核表達(dá)系統(tǒng)制備歐米加-海螺毒素(MVIIA)及其變體多肽的串聯(lián)多聚體。
9．按權(quán)利要求書(shū)8所述的歐米加-海螺毒素(MVIIA)及其變體多肽的制備方法，其特征在于利用DNA限制性內(nèi)切酶中的同尾酶具有識(shí)別和水解不同核苷酸序列，但產(chǎn)生相同的粘性末端，且當(dāng)二者的粘性末端相連后不能再被同尾酶識(shí)別及切割的特點(diǎn)，在MVIIA及其變體基因DNA序列的5’端及3’端分別加上同尾酶的識(shí)別序列，通過(guò)重復(fù)用同尾酶水解，連接反應(yīng)等步驟，構(gòu)建MVIIA及其變體基因的串聯(lián)多聚體。
10．按權(quán)利要求書(shū)8所述的歐米加-海螺毒素(MVIIA)及其變體多肽的制備方法，其特征在于根據(jù)歐米加-海螺毒素(MVIIA)及其變體多肽的氨基酸及DNA序列的特點(diǎn)，在構(gòu)建其基因的重復(fù)串聯(lián)多聚體時(shí)利用同尾酶本身的識(shí)別序列，或在同尾酶識(shí)別序列的5’端或3’端加入適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄校瑥亩勾?lián)重復(fù)的各MVIIA及其變體單體基因間存在特定的間隔序列，這些間隔核苷酸序列在翻譯成氨基酸后，成為將歐米加-海螺毒素(MVIIA)及其變體多肽的多聚體加工成單體多肽的斷裂、加工位點(diǎn)。
11．按權(quán)利要求書(shū)10所述的歐米加-海螺毒素(MVIIA)及其變體多肽的制備方法，其特征在于用化學(xué)或酶學(xué)方法將歐米加-海螺毒素(MVIIA)及其變體基因的串聯(lián)多聚體的表達(dá)產(chǎn)物，即多肽的串聯(lián)多聚體斷裂或切割，加工成單體多肽。
12．一種歐米加-海螺毒素變體多肽的醫(yī)藥用途，其特征在于它用于鎮(zhèn)痛治療，例如手術(shù)后鎮(zhèn)痛，腫瘤病人的鎮(zhèn)痛，愛(ài)滋病人的鎮(zhèn)痛，神經(jīng)性疼痛的治療，燒傷及燙傷病人的鎮(zhèn)痛等等。
13．一種歐米加-海螺毒素變體多肽的醫(yī)藥用途，其特征在于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，以減少或防止神經(jīng)細(xì)胞的損傷及死亡，造成神經(jīng)細(xì)胞損傷或死亡的原因可以為任意一種，尤其包括由于缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷，腦中風(fēng)及創(chuàng)傷為二個(gè)實(shí)例。
14．按權(quán)利要求書(shū)12和13所述的歐米加-海螺毒素變體多肽的醫(yī)藥用途，其特征在于治療疼痛及神經(jīng)細(xì)胞損傷的給藥途徑可以為任何一種能達(dá)到療效的方式，例如蛛網(wǎng)膜下腔給藥，硬膜外給藥，疼痛部位局部給藥，通過(guò)體表吸收的方式給藥，血管內(nèi)給藥，腹腔給藥等等。
全文摘要
本發(fā)明涉及歐米加－海螺毒素(MⅦA)變化多肽的氨基酸及基因序列及這些多肽的制備方法,以及用MⅦA變體多肽治療疼痛及減少神經(jīng)細(xì)胞損傷。它將天然歐米加－海螺毒素的第12位的甲硫氨酸改為丙氨酸或甘氨酸或異亮氨酸或纈氨酸,并在DNA水平上,將歐米加－海螺毒素及其變體多肽的基因串聯(lián)成多聚體,用原核或真核表達(dá)系統(tǒng)制備歐米加－海螺毒素及其變體多肽的串聯(lián)多聚體。
文檔編號(hào)C12N15/79GK1280136SQ00109828
公開(kāi)日2001年1月17日 申請(qǐng)日期2000年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月10日
發(fā)明者劉蓓鈁, 劉建寧 申請(qǐng)人:劉建寧