專利名稱：一種用重組基因轉(zhuǎn)染的異體皮膚的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用重組基因轉(zhuǎn)染的異體皮膚，具體地說，本發(fā)明涉及一種用CTLA4Ig重組基因轉(zhuǎn)染的異體皮組織，用于覆蓋燒傷等創(chuàng)面，從而促進創(chuàng)面愈合，減少疤痕形成。
對燒傷創(chuàng)面異體(種)皮膚移植的研究是現(xiàn)代燒傷治療的迫切需要燒傷是一類發(fā)生率及致殘率均較高的特殊類型創(chuàng)傷，其根本問題就是創(chuàng)面問題，如果燒傷創(chuàng)面得不到及時有效的覆蓋、封閉，必將引起患者機體內(nèi)環(huán)境的紊亂、感染及多臟器功能障礙的發(fā)生；此外，還將出現(xiàn)創(chuàng)面的非生理性愈合，使疤痕形成增加，殘疾程度加劇。因此，對燒傷創(chuàng)面的研究一直是燒傷界研究的熱點及難點。
異體皮及異種豬皮早已應(yīng)用于燒傷創(chuàng)面治療中，但由于移植后的免疫排斥反應(yīng)，使它們的應(yīng)用及療效受到了極大地限制。深度燒傷創(chuàng)面需經(jīng)皮膚移植才能愈合，而大面積、特大面積燒傷患者自體皮源嚴重不足，需經(jīng)非自體(異體和異種)皮覆蓋創(chuàng)面，但非自體皮將在短時間內(nèi)(2-4周)被排斥，即使是試圖通過近年發(fā)展起來的微粒皮技術(shù)封閉創(chuàng)面，也需應(yīng)用異體(種)皮覆蓋于微粒皮上，以為自體微粒皮提供合適的生長增生條件，但我們在臨床上發(fā)現(xiàn)在微粒皮還沒有完全生長覆蓋創(chuàng)面前，異體(種)皮就由于免疫排斥等而壞死脫落，使微粒皮失去繼續(xù)生長擴展的環(huán)境，從而使手術(shù)達不到理想的效果。另外，切取自體皮同樣也是一種創(chuàng)傷，很多患者不愿切取自體皮，而希望有其它皮膚代替。所以如何延長燒傷創(chuàng)面異體(種)移植皮膚成活甚至永久成活的研究是現(xiàn)代燒傷治療的迫切需要。
影響器官移植成功的關(guān)鍵是免疫排斥反應(yīng)，迄今，防治移植排斥反應(yīng)的主要對策是通過過各種途徑抑制宿主的免疫功能。也正是由于免疫抑制性藥物如環(huán)皰霉素、FK506、OKT3等的問世，包括皮膚移植在內(nèi)的器官移植取得了長足的進展。但是這些藥物都有一個共同的特點，其抑制機體免疫功能的作用是非特異的、全面持久的，從而易引發(fā)感染、產(chǎn)生腫瘤等嚴重后果。所以近年來醫(yī)學(xué)界提出了特異性免疫耐受理論即機體僅對移植抗原產(chǎn)生耐受，而保留機體的其它免疫功能。目前誘導(dǎo)宿主特異性免疫耐受主要有以下四種方法(1)胸腺中注射供體細胞或MHC抗原；(2)封閉CD4和CD8T淋巴細胞；(3)改造供體的MHC抗原；(4)阻斷T細胞輔助刺激信號系統(tǒng)。其中，阻斷T細胞輔助刺激信號系統(tǒng)被認為是最有前途的方法。從免疫耐受理論出發(fā)，并結(jié)合臨床實際，近來又有人提出了局部免疫耐受(1ocal immunetolerance)理論，即通過各種方法在移植局部環(huán)境中抑制宿主的免疫功能，引發(fā)局部免疫耐受。這樣，既達到延長移植物存活時間，又使對宿主自身免疫功能的影響降到最低程度。這對燒傷治療尤為關(guān)鍵，因燒傷病人，特別是嚴重?zé)齻颊?，免疫功能紊亂，免疫力低下，而致極易并發(fā)感染。如此時再抑制患者的免疫功能，則更易引發(fā)致命性感染等嚴重后果。所以我們綜合阻斷T細胞輔助信號和局部免疫耐受兩個學(xué)術(shù)觀點，并結(jié)合燒傷創(chuàng)面治療實際特點，通過在燒傷創(chuàng)面誘導(dǎo)移植皮膚局部特異性免疫耐受，而達到延長移植異種皮膚成活甚至永久成活的目的。
皮膚移植的免疫排斥反應(yīng)是典型的細胞性排斥反應(yīng)，活化的T細胞在皮膚移植排斥反應(yīng)中起著決定性作用。而近年的研究表明，T細胞必須在TCR/MHC識別及輔助刺激信號共同作用下才能完全活化。阻斷輔助刺激信號，將會引起T細胞的無反應(yīng)，或細胞凋亡(apoptosis)。迄今，已發(fā)現(xiàn)多種輔助刺激信號系統(tǒng)，如B7/CD28-CTLA4系統(tǒng)，CD40/CD40L系統(tǒng)，CD95(Fas)/FasL系統(tǒng)等。但迄今的研究認為，在所有的輔助刺激信號系統(tǒng)中，B7/CD28-CTLA4系統(tǒng)的作用最大、最肯定?？扇苄訡TLA4能競爭性阻斷抗原提呈細胞的B7分子與T細胞上的CD28結(jié)合，從而阻斷T細胞的完全活化。研究表明，外源性CTLA4可明顯抑制各種抗原刺激的T細胞的活化。但它并不影響T細胞的細胞毒性等功能，此時的T細胞同樣對入侵的病毒、細菌等具有免疫能力；并且CTLA4只有在應(yīng)用時才阻斷T細胞的活化，沒有持續(xù)及累加效應(yīng)。這些是目前各種正在應(yīng)用的免疫抑制劑無法比擬的。研究表明，CTLA4對以T細胞過度活化為主要原因的自身免疫性疾病等有明顯的治療作用；它還能明顯延長心、腎、胰島等移植器官的成活。在現(xiàn)有技術(shù)中，沒有它在燒傷創(chuàng)面皮膚移植方面的應(yīng)用。同時由于CTLA4的制備、提純困難，全身甚至局部應(yīng)用費用昂貴，且研究發(fā)現(xiàn)，只有當機體內(nèi)的CTLA4一直維持在某一水平，其誘導(dǎo)移植物特異性免疫耐受的能力才最明顯。說明，直接應(yīng)用CTLA4純品不但難度較大，而且效果有限。
本發(fā)明的目的是提供一種用CTLA4Ig重組基因轉(zhuǎn)染的異體皮膚，用于覆蓋、封閉燒傷創(chuàng)面。
本發(fā)明提供了一種用CTLA4Ig重組基因轉(zhuǎn)染并能夠表達CTLA4Ig重組蛋白質(zhì)的異體皮膚。所述的異體皮膚是指來源于不同于燒傷患者的個體的皮膚。它可以是來源于同種的個體，例如其他的人，也可以是來源于不同種的個體，例如豬，羊，牛，馬等。在本發(fā)明中可以使用任何動物物種來源的皮膚，但優(yōu)選使用豬皮膚。所述豬皮膚可以是任何一種品系的豬的皮膚，例如榮昌豬，五指山豬等(以近交或標準品系的豬皮膚為佳)；所述的豬皮膚可以是任何年齡的豬皮膚(以取自小于6個月豬齡的豬皮膚為佳)。
本發(fā)明中所述的CTLA4是人細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4分子胞外區(qū)部分。用于本發(fā)明的CTLA4可以是該分子胞外區(qū)全長的CTLA4，也可以是包括其中一部分的CTLA4片段。本發(fā)明的CTL4最好還包括信號肽。所述的Ig是人免疫球蛋白IgGγ1，其核苷酸序列包括人IgGγ1鉸鏈區(qū)、CH1及CH2區(qū)；CTLA4與Ig的相連方式是鉸鏈區(qū)連接。優(yōu)選的用于本發(fā)明的CTLA4基因具有如圖6所示的核苷酸序列。
為了使重組的CTLA4Ig基因在被轉(zhuǎn)化的組織中進行表達，該基因應(yīng)與可驅(qū)動該基因表達的啟動子有效連接。有效連接是指啟動子與重組基因的連接方式可以使該啟動子能夠引導(dǎo)該重組基因在皮膚細胞中進行表達。本發(fā)明中可以使用任何已知的可以在皮膚細胞中引導(dǎo)外源基因表達的啟動子。這些啟動子可以是SV40、CMV及CAG等，最好為CAG啟動子。
為了轉(zhuǎn)化進皮膚細胞中，重組基因與啟動子連接的重組核苷酸可以被整合在一種載體中。只要能夠保證所述的重組基因在皮膚細胞中表達，可以使用任何其它的方式將重組基因?qū)肫つw細胞。在使用載體時可以使用任何一種已知的可以將重組核酸轉(zhuǎn)化到皮膚細胞中的載體，例如腺病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，優(yōu)選使用腺病毒載體。在腺病毒載體中，重組核酸的整合位點最好是SwaI酶切位點。
豬皮膚的切取和處理方法是首先取下大張全厚新鮮豬皮，再用鼓式取皮機反制成較厚的中厚皮。然后將Adv-CTLA4Ig體外轉(zhuǎn)染待移植皮膚。
附圖簡要說明


圖1是pCTLA4Ig融合蛋白表達載體構(gòu)建示意圖；圖2是Adv-CTLA4Ig載體構(gòu)建示意圖；圖3是Adv-CTLA4Ig在培養(yǎng)細胞中的表達，A:293細胞；B人成纖維細胞；C:HeLa細胞；圖4表示Adv-CTLA4Ig載體體外傳染大鼠皮膚免疫組化；圖5表示霜劑型Adv-CTLA4Ig載體轉(zhuǎn)染豬皮膚免疫組化；圖6表示CTLA4融合蛋白結(jié)構(gòu)示意圖(A)，以及信號肽和CTLA4胞外區(qū)DNA序列和氨基酸序列(B)。
使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因異體皮膚，為大面積病人的治療爭取了時間；為一些不愿切取自體皮或自體皮源因難的患者燒傷或取皮創(chuàng)面的提供了良好的生長條件，促進了創(chuàng)面的愈合；由于轉(zhuǎn)基因豬皮有效保護了創(chuàng)面而使創(chuàng)面疤痕形成減少。
具體地說，本發(fā)明構(gòu)建的AdV-CTLA4Ig表達載體能轉(zhuǎn)染0.1-0.6厘米厚的、用于移植的皮膚組織，包括豬皮和人皮組織；該AdV-CTLA4Ig轉(zhuǎn)染之豬皮或人皮能表達CTLA4Ig；該AdV-CTLA4Ig轉(zhuǎn)染之豬皮或人皮中游離的AdV-CTLA4Ig能轉(zhuǎn)染創(chuàng)面肉芽組織；該AdV-CTLA4Ig轉(zhuǎn)染之豬皮或人皮可用于人體表損傷的覆蓋，且存活期顯著長于未轉(zhuǎn)染之豬皮或人皮(從10天左右至20天以上)；該AdV-CTLA4Ig轉(zhuǎn)染之豬皮或人皮尤其適用于人體表燒傷創(chuàng)面的覆蓋，包括創(chuàng)面覆蓋的微粒皮的保護。
2)RNA電泳1.5％甲醛變性瓊脂糖凝膠到板制膠，凝固后置1×MOPS電泳液中；5微升RNA樣品與15微升載樣緩沖液，95℃水浴變性2分鐘，50V，電泳，紫外檢測RNA完整性。
3)RNA含量測定RNA樣品稀釋后在紫外分光光度儀上測O.D.260和O.D.280值,RNA濃度(微克/毫升)=O.D.260×40×稀釋倍數(shù)。3．引物設(shè)計通過計算機輔助分析，根據(jù)基因庫中人CTLA-4基因序列，設(shè)計如下三條引物，其中引物1#包括CTLA-4胞外區(qū)N末端7個氨基酸殘基和抑瘤素M信號肽C端15個氨基酸殘基；引物2#對應(yīng)于CTLA-4119-125位氨基酸殘基，并引入BclⅠ酶切位點；引物3#包含抑瘤素M信號肽其余氨基酸殘基并與引物1#的抑瘤素M信號肽部分重疊，在引物3#的5’端引入HindⅢ酶切位點。引物由中科院上海細胞所合成，PAGE純化。引物1#:CTCAGTCTGGTCCTTGACCTCCTGTTTCCAAGCATGGCGA
GCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC引物2#TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTC------BclⅠ引物3#GCAAGCTTCAATGGGTTGACTGCTCACACAGAGGACGCTG——--HindⅢCTCAGTTCGGTCCTTGCATCT4．RT-PCR擴增CTLA-4胞外區(qū)cDNA片段1)cDNA第一鏈合成(逆轉(zhuǎn)錄)將總RNA10微升，oligo(dT12)2微升，ddH2O(DEPC)11.5微升，混勻后65℃水浴變性10分鐘，迅速置冰上，再加入5x逆轉(zhuǎn)錄緩沖液8微升，100mMDTT2微升，RNasin0.5微升，2mM dNTP4微升，AMV2微升，(總體積40微升)，42℃1小時，-20℃保存。
2)PCR反應(yīng)先以cDNA第一鏈為模板，以引物1#和2#進行第一輪擴增，條件為cDNA第一鏈5微升，10×PCR緩沖液5微升，10mMdNTP4微升，引物2#和3#各-1微升(終濃度l00nM),ddH2O 29.5微升，95℃變性7分鐘，加Taq酶0.5微升，總體積50微升，循環(huán)條件94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，30個循環(huán)后72℃7分鐘；隨后以第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，以引物2#和3#進行第二輪擴增，反應(yīng)條件同前，2％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。5．質(zhì)粒提取按質(zhì)粒提取試劑盒說明書操作，100微升ddH2O,1洗脫質(zhì)粒DNA。6．大腸桿菌感受態(tài)的、凍存參照《分子克隆》(金冬雁，黎孟楓譯，《分子克隆實驗指南》，第二版北京科學(xué)出版社1996；P852-907)CaCl2制備取大腸桿菌感受態(tài)，加入終濃度10-15％甘油，-70℃凍存。7．質(zhì)粒及重組DNA的轉(zhuǎn)化取凍存大腸桿菌感受態(tài)細菌，加入質(zhì)?；駾NA連接產(chǎn)物1-2微升，輕輕混勻后，冰浴30分鐘，42℃水浴2分鐘，加入900微升LB培養(yǎng)基，37℃水浴60分鐘，取適量涂布于含100微克/毫升氨芐青霉素的LB瓊脂板上。37℃孵箱培養(yǎng)過夜。8．DNA片段的回收按DNA片段回收試劑盒說明書操作。9．PCR擴增片段與Ig融合蛋白表達載體的連接將第二輪PCR擴增產(chǎn)物進行2％瓊脂糖凝膠電泳，回收所需片段，經(jīng)HindⅢ、BclⅠ雙酶切后，與經(jīng)同樣酶切的pX/Ig載體片段載體3∶1的比例，根據(jù)DNA快速連接試劑盒說明連接，轉(zhuǎn)化MC1061感受態(tài)菌，HindⅢ、XbaⅠ酶切鑒定陽性轉(zhuǎn)化克隆插入片段大小。10．序列測定酶切鑒定插入片段大小正確的重組質(zhì)粒，經(jīng)HindⅢ、XbaⅠ雙酶切后定向插入pUC19質(zhì)粒中，采用Sanger雙脫氧測序法，以質(zhì)粒雙鏈DNA為模板，在pUC19通用引物引導(dǎo)下,ABI Prism377全自動測序儀自動測序。
實施例2CTLA-4Ig逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的構(gòu)建(圖2)將pLXSN和pUC19-CTLA-4Ig分別用用EcoRI和HindⅢ進行酶切，然后分別用dATP,dNTP與DNA大腸桿菌聚合酶Klenow片段進行填平，再用BamHI進行酶切，將電泳回收pLXSN的大片段和pUC19-CTLA-4Ig的小片段進行連接，即得到CTLA-4Ig的表達pLXCTLA-4Ig。
實施例3CTLA4Ig腺病毒表達載體的構(gòu)建(圖3)1．將cDNA片段末端平端化。
醇沉cDNA(0.5pmol)離心管中加入10×緩沖液1μl，再加無菌雙蒸水至9μl,70℃ 5分鐘，加入1μl T4DNA多聚酶，輕輕混合，不得劇烈振蕩，37℃中溫育5分鐘，用DNA Dilition緩沖液調(diào)DNA濃度為1μg、50μl，充分混勻。轉(zhuǎn)至冰浴中滅活多聚酶，可直接用于連接反應(yīng)(如不能馬上應(yīng)用，則應(yīng)立即抽提醇沉，再用DNA Dilition緩沖液溶解后儲存于-20℃)。2．將平末端化的cDNA插入pAxCAwt柯氏質(zhì)粒中。將pAxCAwt線性化pAxCAwt 5μl,h緩沖液5μl,SwaI2μl,ddH2O38μl，混勻后25℃溫育2小時；加EDTA液至終濃度為10mM，酚氯仿抽提，加入平末端cDNA片段約0.2μg.，混勻后醇沉，末完全干燥前，加入5μlDNA溶解及5μl連接緩沖液，25℃溫育2小時，醇沉，末完全干燥前加入h緩沖液5μl,SwaI 2μ1,ddH2O至50μl,25℃溫育2小時，以降低野生型病毒及裸病毒出現(xiàn)的可能性。3．用入噬菌體包裝插入了CTLA4基因的粘粒。
將入噬菌體包裝kit中的提取物離心至管底，加入5μl用TE溶解的2μg質(zhì)粒DNA，加入無菌雙蒸水至終體積為25μl，混勻后離心將提取物及質(zhì)粒DNA離至管底，RT溫育2小時，加入0.5毫升SM緩沖液及25毫升氯仿，輕輕混勻，離心30秒鐘，取出上清至一新的離心管，注意不得取出絮狀物，用SM緩沖液100、1000、10000倍稀釋上清，各取100μl加入100μl用SM緩沖液稀釋至A600為2.0的DH5α(LE392)中，RT吸附、平衡20分鐘，以1/100,1/10涂布Amp抗性的LB平板，37℃溫育過夜(10-16小時)，挑選陽性菌落擴增，提取質(zhì)粒。4．鑒定CTLA4的正確插入質(zhì)粒DNA10μl，緩沖液2μl,SalⅠ1μl,ddH2O 16μl，混勻后37℃溫育2小時，醇沉，末完全干燥前，加入5μlDNA溶解緩沖液及5μl連接緩沖液，混勻后25℃溫育2小時，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，擴增陽性克隆，提取質(zhì)粒，酶切、PCR、Dot Blotting鑒定。5．將陽性克隆質(zhì)粒的進一步擴增將入噬菌體包裝kit中的提取物離心至管底，加入5μl用TE溶解的2μg質(zhì)粒DAN，加入無菌雙蒸水至終體積為25μl，不必混勻，離心將水中的提取物及質(zhì)粒DNA離至管底，RT溫育2小時，加入0.5毫升SM緩沖液及25毫升氯仿，輕輕混合，高速度離心30Sec，取出上清至一新的離心管，注意不得取出絮狀物，用SM緩沖液100、1000、10000倍稀釋上清，各取100μl加入100μl用SM緩沖液稀釋至A600為2.0的DH5α(LE392)中，RT吸附、平衡20分鐘，以1/100,1/10涂布Amp抗性的LB平板，37℃溫育過夜(10-16小時)；將所剩包裝質(zhì)粒加入50毫升含Amp的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，如克隆多于10個以上，則提取質(zhì)粒備用；如克隆少于10個，則棄相應(yīng)的SM緩沖液稀釋上清。6．將正確插入質(zhì)粒與腺病毒大質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞1)將5中提取的質(zhì)粒DNA用HEPES緩沖液調(diào)濃度為100微克/毫升，取45微升加入5微升DNA-TPC,輕輕混合，將其緩慢滴加至含30微升DOTAP的無菌玻璃管中，邊滴邊輕輕混合，再加入HEPES緩沖液約20微升至總體積為100微升，室溫放置15分鐘；另取一瓶融合度接近100％的培養(yǎng)293細胞，去除培養(yǎng)液，加入轉(zhuǎn)染混合液，輕輕搖動，使轉(zhuǎn)染混合液均勻散布，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，去除轉(zhuǎn)染混合液，加入新鮮培養(yǎng)液，于第三天收集培養(yǎng)上清及漂浮細胞。7．篩選陽性細胞克隆293細胞，調(diào)細胞密度至1×105/毫升，再10倍稀釋，取不同稀釋度的細胞接種96孔板，每孔100微升，復(fù)孔，培養(yǎng)每5天后再加入培養(yǎng)液50微升，培養(yǎng)15天后，收集培養(yǎng)8天后細胞才漂浮或破裂孔之上清，盡量收集最大稀釋度孔，將上清行點免疫檢查，提取上清中DNA，行PCR檢查。8．將陽性克隆在293細胞中擴增將陽性克隆上清稀釋成0.5毫升，加入80％融合、培養(yǎng)293細胞的3.5cm培養(yǎng)皿中，均勻散布，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每15分鐘，輕輕搖晃一次，培養(yǎng)1小時后，加入2毫升培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72小時，收集上清及漂浮細胞，用此上清同樣感染293細胞，而擴增腺病毒表達載體，收集腺病毒，-80℃冰箱保存。
實施例4Adv-CTLA4Ig對體外培養(yǎng)細胞的轉(zhuǎn)染1．CTLA4Ig腺病毒載體的制作293包裝細胞培養(yǎng)至70％-90％融合后，0.1MPBS漂洗細胞3次后加入重組腺病毒原液直接感染，37℃CO2恒溫培養(yǎng)箱1小時后，取出加入含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)3天后收集細胞及上清，在液氮反復(fù)凍融5次后，4℃10000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，0.22um膜除菌，-70℃保存?zhèn)溆?。使用時，將轉(zhuǎn)染液調(diào)PH為7.2。2．病毒滴度的測定空斑實驗法將293細胞以2×106細胞/孔接種于6孔板，培養(yǎng)20至24小時后，以0.3毫升/孔加入將用無血清DMEM依次10倍稀釋的病毒液。細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染1小時(每15分鐘輕輕搖晃一次，以使病毒均一散布。)。棄去病毒液后，每孔加入1毫升含0.5％細胞用低熔點瓊脂糖及5％胎牛血清的完全DMEM細胞培養(yǎng)液覆蓋。7天后觀察。以鏡下可區(qū)分的細胞病變作為蝕斑形成單位(Plaque Forming Unite,PFU)。用接近100％細胞出現(xiàn)病變的病毒稀釋度，代入以下公式計算病毒滴度病毒滴度(PFU)=[12×105稀釋度×10個病毒/細胞]÷0.3毫升(因大約每10個病毒感染一個細胞，在7天后細胞出現(xiàn)完全病變)。3．轉(zhuǎn)染取生長狀態(tài)良好，增殖活躍的293細胞，用胰蛋白酶消化計數(shù)，按1.5×105細胞滴于蓋玻片中央，放于37℃CO2恒溫培養(yǎng)箱1小時(注意防止細胞干片)，待細胞貼壁后加入含5％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液10mL/培養(yǎng)皿，培養(yǎng)12小時即可進行轉(zhuǎn)染。即先用無菌吸頭取出培養(yǎng)液，消毒0.1MPBS輕輕柔洗細胞片1次后按1mL/蓋玻片/培養(yǎng)皿加入轉(zhuǎn)染液，放入37℃CO2恒溫培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)染2、4、6、8、9小時，繼之37℃0.1MPBS洗細胞3次，換用含5％小牛血清的DMEM常規(guī)培養(yǎng)至12、18、24、36、60小時。同樣轉(zhuǎn)染人成纖維細胞、表皮細胞及HeLa細胞。4．免疫組化法檢測細胞CTLA-4Ig表達將上述轉(zhuǎn)染的293細胞、人成纖維細胞、表皮細胞及血管內(nèi)皮細胞在預(yù)定時間終止，用0.1MPBS洗3次后，用4％多聚甲醛(pH7.3)固定8小時、0.1MPBS浸泡8小時，隨后進行免疫組化檢測CTLA-4Ig表達。同時用未轉(zhuǎn)染相應(yīng)細胞做空白對照。5．轉(zhuǎn)染細胞形態(tài)觀察及活性檢測取出轉(zhuǎn)染細胞玻片，甩干培養(yǎng)基后立即滴4％苔盼藍染3鐘后觀察，死亡細胞染成蘭色，活細胞不被染色。在顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細胞形態(tài)及活性變化。發(fā)現(xiàn)CTLA-4Ig腺病毒感染腺病毒包裝細胞293細胞，3-5天左右感染的細胞在局部開始包膜收縮、變圓、粘附性降低，然后漂起，并可呈串珠樣排列。由于局部細胞的脫落漂起而出現(xiàn)無細胞區(qū)，區(qū)周邊有細胞附著即病毒病變空斑。而以腺病毒感染人成纖維細胞、HeLa胞后則未見細胞形態(tài)改變及空斑形成，顯示重組腺病毒是一種復(fù)制性缺陷病毒，在無E1表達的細胞內(nèi)不能復(fù)制，也證明了腺病毒攜帶的CTLA-4Ig不與宿主基因整合，故無基因毒性。6．轉(zhuǎn)染細胞CTLA-4Ig的定性、定量、定位表達顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細胞免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)棕黃色陽性棵粒見于細胞漿。在高倍鏡下記數(shù)100個細胞記錄其中的陽性細胞數(shù)。發(fā)現(xiàn)293細胞轉(zhuǎn)染1小時后再培養(yǎng)8小時CTLA-4Ig開始表達，36小時后所有細胞均呈強陽性；人成纖維細胞及表皮細胞在轉(zhuǎn)染4小時后培養(yǎng)12小時開始表達，36小時達高峰，陽性表達率為50％，提示腺病毒載體能有效轉(zhuǎn)染皮膚組織。并發(fā)現(xiàn)腺病毒滴度、細胞種類、轉(zhuǎn)染時間、培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)染細胞的CTLA-4Ig表達均有顯著影響。腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率呈濃度依耐性(將滴度為7×108PFU/毫升的腺病毒稀釋15倍HeLa、人成纖維細胞無CTLA-4Ig表達，而滴度為7×108PFU/毫升時轉(zhuǎn)染培養(yǎng)足夠時間HeLa、人成纖維均有陽性表達)，說明病毒滴度對于提高轉(zhuǎn)染效率至關(guān)重要。在一定時間范圍內(nèi)，相同滴度的轉(zhuǎn)染液，轉(zhuǎn)染時間、培養(yǎng)時間延長，陽性表達細胞數(shù)越多。在達到足夠轉(zhuǎn)染時間，細胞可有100％陽性表達。結(jié)果還顯示所構(gòu)建腺病毒表達載體對不同細胞的轉(zhuǎn)染效率不同，293細胞轉(zhuǎn)染效率最高，HeLa細胞次之80％，成纖維轉(zhuǎn)染效率最低，60％細胞陽性染色。對照組未轉(zhuǎn)染細胞均未見棕黃色陽性細胞，表明正常細胞無CTLA-4Ig表達(見圖3)。
實施例5Adv-CTLA4Ig體外轉(zhuǎn)染待移植皮膚(Ⅰ)用DMEM培養(yǎng)液調(diào)重組腺病毒載體滴度至5×108/L，將取自6個月齡的榮昌豬的皮膚塊放入其中于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于培養(yǎng)后不同時相點取皮膚組織塊行冰凍切片，免疫組織化學(xué)檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染6小時后就可見有目的蛋白CTLA4Ig的表達，在培養(yǎng)后24、36小時可見CTLA4Ig表達進一步增加，在轉(zhuǎn)染后48、72小時后見CTLA4Ig的表達不再增加。鏡下見CTLA4Ig主要在成纖維細胞及毛囊上皮細胞表達(見圖4)。Adv-CTLA4Ig體外轉(zhuǎn)染待移植皮膚(Ⅱ)用將滴度為2×109/L的霜劑型重組腺病毒載體直接涂于皮膚真皮面后，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于培養(yǎng)后不同時相點取皮膚組織塊行冰凍切片，免疫組織化學(xué)檢查。結(jié)果與(Ⅰ)類似(見圖5)。
實施例6Adv-CTLA4Ig轉(zhuǎn)染豬皮在鼠燒傷創(chuàng)面的應(yīng)用1．將上述用Adv-CTLA4Ig轉(zhuǎn)染豬皮膚縫植于燒傷Balb/c小鼠背部2×2cm切痂創(chuàng)面。術(shù)后發(fā)現(xiàn)(1)移植皮膚局部及周邊組織有CTLA4Ig的表達。
(2)Adv-CTLA4Ig轉(zhuǎn)染的豬皮存活時間平均為21天，最長超過28天。而對照組存活時間為8到9天；(3)Adv-CTLA4Ig轉(zhuǎn)染的異體皮膚所覆蓋的肉芽組織也表達CTLA4Ig。2．將上述用Adv-CTLA4Ig轉(zhuǎn)染豬皮膚縫植于燒傷Wistar大鼠背部3×4cm切痂創(chuàng)面。實驗發(fā)現(xiàn)(1)移植皮膚局部及周邊組織有CTLA4Ig的表達。
(2)Adv-CTLA4Ig轉(zhuǎn)染的異體移植皮膚存活時間平均為17天，而對照組存活時間為8到9天；(3)Adv-CTLA4Ig轉(zhuǎn)染的異體皮膚所覆蓋的肉芽組織也表達CTLA4Ig實施例7Adv-CTLA4Ig轉(zhuǎn)染豬皮在人燒傷創(chuàng)面的應(yīng)用將以上所制轉(zhuǎn)基因豬皮應(yīng)用于不同情況的燒傷患者，所用最大面積達0.4M2，最小為4×5cm．所移植轉(zhuǎn)基因豬皮在燒傷創(chuàng)面成活好，最長存活時間長達37天，其它病例在移植后不同時間均因治療需要而手術(shù)切除，切除時其生長良好。
權(quán)利要求
1．一種用CTLA4Ig重組基因轉(zhuǎn)染的、并能夠表達CTLA4Ig重組蛋白質(zhì)的異體皮膚。
2．按照權(quán)利要求1所述的異體皮膚，其特征在于，它來源于人皮膚，豬皮膚，羊皮膚，牛皮膚，馬皮膚。
3．按照權(quán)利要求1所述的異體皮膚，其特征在于，它來源于豬皮膚。
4．按照權(quán)利要求3所述的異體皮膚，其特征在于，它來源于小于6個月齡的榮昌豬皮膚。
5．按照權(quán)利要求1所述的異體皮膚，其特征在于，所述的CTLA4Ig重組基因中的CTL4部分編碼如下的氨基酸序列-25MGVLLTQRTLLSLVL-10 -1 +1ALLFPSMASMAMHVA+10 +20QPAVVLASSRGIASF+30VCEYASPGKATEVRV+40 +50TVLRQADSQVTEVCA+60ATYMMGNELTFLDDS+70+80ICTGTSSGNQVNLTI+90QGLRAMDTGLYICIC+100+110ELMYPPPYYLGIGNG+120+125TQIYVIDPEPCPDSD
6．按照權(quán)利要求1所述的異體皮膚，其特征在于，所述的CTLA4Ig重組基因是與SV40、CMV或CAG啟動子有效連接的。
7．按照權(quán)利要求1所述的異體皮膚，其特征在于，所述的CTLA4Ig重組基因是與CAG啟動子有效連接的，該與啟動子有效連接的重組基因被整合在腺病毒載體的SwaI位點。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用CTLA4Ig重組基因轉(zhuǎn)染的、并能夠表達CTLA4Ig重組蛋白質(zhì)的異體皮膚。本發(fā)明的異體皮膚可用于覆蓋、封閉燒傷創(chuàng)面,促進創(chuàng)面的愈合并減少創(chuàng)面疤痕形成。
文檔編號C12N15/12GK1315207SQ00103528
公開日2001年10月3日 申請日期2000年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月27日
發(fā)明者吳軍, 魏泓, 易紹萱, 羅高興, 賀偉峰, 周立新, 陳烯煒, 張寧 申請人:重慶西南醫(yī)院