一種利用走馬胎葉片快速繁殖種苗的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬植物栽培技術領域，涉及一種利用走馬胎葉片快速繁殖種苗的方法，包括葉片誘導分化不定芽、不定芽繼代增殖、壯苗、生根誘導、移栽和管理過程。本發(fā)明工藝流程簡單，以走馬胎葉片為外植體進行組織培養(yǎng)，可以在短時間獲得大量可用于生產(chǎn)栽培的種苗，且獲得的種苗生理年齡一致，生長整齊，適合工廠化育苗和規(guī)模化栽培，為走馬胎人工種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供技術支持。
【專利說明】
-種利用走馬胎葉片快速繁殖種苗的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬植物栽培技術領域，設及一種走馬胎種苗的繁殖方法，具體是一種利用 走馬胎葉片直接誘導分化不定芽，通過不定芽繼代增殖、壯苗、生根誘導、移栽等過程，獲得 大量種苗的繁殖方法。
【背景技術】
[0002] 走馬胎（Ardisia gigantifolia stapf .)又名大葉紫金牛，為紫金?？?(Myrsinaceae)紫金牛屬(Ardisia)植物。常綠、直立灌木，分布于我國云南、江西、福建、廣 東、廣西等?。▍^(qū)）。多生于海拔1300mW下的山谷、溪旁的疏、密林下潮濕處。走馬胎的根莖 及全株具有桂風濕壯筋骨、活血化疲、消腫止痛、止血生肌等功效，可治療類風濕關節(jié)炎，筋 骨疼痛、跌打損傷、產(chǎn)后疲血、半身不遂等。作為一種民間常用中草藥，隨著近年來需求量的 與日俱增，走馬胎野生資源已日趨枯竭，有些分布點已經(jīng)很難見到走馬胎的蹤影。為滿足市 場需求，人工種植勢在必行，批量種苗繁殖已成為亟待解決的問題。
[0003] 在自然條件下，走馬胎種苗通常利用種子繁殖，也有采用桿插繁殖的方法。據(jù)科研 人員多年研究發(fā)現(xiàn)，走馬胎開花座果率不到5%，且野生資源分散，成熟時間不一致，造成了 種子采集困難等問題，而且種子萌芽需要的時間較長，不利于種苗大量快速繁育;桿插繁殖 耗費植物材料較多，繁殖效率較低，所W，播種和桿插都不能作為走馬胎種苗批量繁殖的方 法。
[0004] 植物組織培養(yǎng)具有原材料需求量少、不受時間和地點限制、繁殖系數(shù)高、可保持母 本優(yōu)良性狀等特點，在植物種苗繁育上廣泛應用。石云平等人采用走馬胎種子無菌播種獲 得無菌植株后，W無菌植株的莖段和芽進行愈傷組織誘導，再通過愈傷組織分化成芽的途 徑獲得不定芽。唐鳳鸞等人選取生長飽滿的種子，經(jīng)過特殊處理促進種子的萌發(fā)獲得幼芽， 再切取幼芽胚軸接入不定芽誘導培養(yǎng)基中獲得不定芽。雖然石云平、唐鳳鸞等人均采用組 織培養(yǎng)技術繁育走馬胎種苗，利用少量的材料即可生產(chǎn)大量性狀一致的種苗，但都存在同 樣的缺點：（1)都W種子為起始材料，因此取材受季節(jié)限制；（2)種子的萌發(fā)時間較長，從取 材到獲得再生植株需要的時間長，使用激素種類較多，步驟比較繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種利用走馬胎葉片快速繁殖種苗的方法，利用走馬胎葉片 進行組織培養(yǎng)，可W在短時間內(nèi)生產(chǎn)大量走馬胎種苗，所得種苗性狀一致，生長整齊，適合 工廠化育苗和規(guī)?；耘唷?br>[0006] 本發(fā)明所采用的技術方案：
[0007] -種利用走馬胎葉片快速繁殖種苗的方法，包括葉片誘導分化不定芽、不定芽繼 代增殖、壯苗、生根誘導、移栽和管理過程，其步驟如下：
[000引1、葉片誘導分化不定芽及增殖過程
[0009]取幼嫩的走馬胎葉片，清洗消毒后用無菌紙吸干水分，然后沿與葉脈垂直方向切 成ο. 5~1. Ocm X 1. ο~2. Ocm的小塊接種于誘導培養(yǎng)基上誘導分化不定芽，培養(yǎng)溫度24~26 °C，光照時間10~12h/d，光照強度20~30皿〇1 · πΓ2 · s^;培養(yǎng)8天后，開始在葉片切口處葉 片表面分化不定芽，培養(yǎng)30天后，將分化出不定芽的葉片細切成含有2~4個不定芽的小塊 后再接種于新鮮誘導培養(yǎng)基進行繼代增殖培養(yǎng)，直至形成叢芽。所述誘導培養(yǎng)基是WMS培 養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加6-BA 0.8~2 . Omg/L、IBA0.3~1. Omg/L、薦糖30g/L、卡拉膠 6.5邑/1，口巧直為5.8。
[0010] 2、壯苗培養(yǎng)過程
[0011] 由于不定芽在繼代增殖培養(yǎng)基上繼代增殖形成叢芽后，芽苗不易長高。將叢芽切 割成小叢后轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基上進行壯苗培養(yǎng)。所述壯苗培養(yǎng)基是WMS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng) 基，并添加6-BA 0.2~0.5mg/L、NAA 0 . Img/L、薦糖30g/L、卡拉膠6.5g/L、10 % 挪子水， 地5.8。
[0012] 3、生根誘導過程
[0013] 經(jīng)壯苗培養(yǎng)的不定芽長到2~3cm高時，單株切取，接種于生根培養(yǎng)基上進行生根 培養(yǎng)，培養(yǎng)lOd后，開始從切口處產(chǎn)生不定根，培養(yǎng)1個月后形成良好根系，獲得完整植株。所 述生根培養(yǎng)基是WMS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加 NAA 0.1~0.5mg/L、IBA0.2~1. Omg/L、 薦糖30g/L、卡拉膠6.5g/L，pH 5.8。
[0014] 4、移栽和管理過程
[0015] A.移栽:將生根苗連瓶放置在控溫大棚中煉苗，一周后將苗移出培養(yǎng)瓶外，洗凈小 苗根部的培養(yǎng)基，在600倍液的多菌靈溶液中浸泡30s~Imin后，移栽到經(jīng)多菌靈溶液消毒 好的栽培基質(zhì)上；
[0016] B.栽培基質(zhì)配比及處理:分別取草炭±、挪慷和河沙，按體積比計:草炭±:挪慷： 河沙=3~5:2~4:1的比例混勻，用多菌靈溶液淋透后蓋上薄膜捂3~5d后掲開，用清水淋 透后種苗；
[0017] C.管理:移栽7~lOd后，覆蓋薄膜保濕，基質(zhì)濕度保持80%~90%左右，然后逐漸 降低到70% ;空氣濕度90% W上，然后逐漸降低到60 %~70% ;遮陰60%~70%，然后逐漸 減少到30% ;在控溫大棚中培育6~8個月，待植株生長至高15~20cm，具有5~6片展開葉片 時，可定植到田間；
[0018] D.施肥：15~20d后幼苗生新根，晴天上午采用0.2%~0.3%尿素溶液噴霧后，并 用清水淋洗，每7d施肥1次；
[0019] E.病蟲害防治:利用500倍多菌靈、500倍百菌清、800倍甲霜靈復合防病，利用菊醋 類殺蟲劑除蟲。
[0020] 本發(fā)明工藝流程簡單，W走馬胎葉片為外植體直接誘導分化不定芽，不定芽經(jīng)繼 代增殖、壯苗、不定芽生根、移栽等過程，可W在短時間獲得大量可用于生產(chǎn)栽培的種苗，且 獲得的種苗生理年齡一致，生長整齊，適合工廠化育苗和規(guī)模化栽培，為走馬胎人工種植產(chǎn) 業(yè)的發(fā)展提供技術支持。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。W下實施例用于 說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常 按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0022] -、走馬胎種苗繁殖
[0023] 實施例一
[0024] 1、葉片誘導分化不定芽過程
[0025] 采集幼嫩的走馬胎葉片，清洗消毒后用無菌紙吸干水分，然后沿與葉脈垂直方向 切成0.5cm X 1. Ocm的小塊50塊，接種于誘導培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.8mg/L+IBA0.3mg/L+薦糖 30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH值為5.8)上誘導分化不定芽，培養(yǎng)溫度24~26°C，光照時間10~ 12h/d，光照強度20~30皿〇1 · πΓ2 · s^;培養(yǎng)10天左右，開始在葉片切口處葉片表面分化不 定芽，培養(yǎng)30天后，每塊葉片分化不定芽數(shù)為5~20個，將分化出不定芽的葉片細切成含有3 個不定芽的小塊100塊，然后再接種于新鮮誘導培養(yǎng)基進行繼代增殖培養(yǎng)，直至形成叢芽。
[0026] 2、壯苗培養(yǎng)過程
[0027] 將叢芽切割成小叢后轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L+薦糖 30g/L+卡拉膠6.5g/L+l 0 %挪子水上進行壯苗培養(yǎng)，pH值為5.8)上進行壯苗培養(yǎng)。
[002引 3、生根誘導過程
[0029] 經(jīng)壯苗培養(yǎng)的不定芽長到2~3cm高時，單株切取200株，接種于生根培養(yǎng)基(MS+ NAA 0.1 mg/L+IBAO. 2mg/L+薦糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，抑值為5.8。）上進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng) lOd后，開始從切口處產(chǎn)生不定根，培養(yǎng)1個月后形成良好根系，獲得完整植株。
[0030] 4、移栽和管理過程
[0031] A.移栽:將150株根系完整的生根苗連瓶放置在控溫大棚中煉苗，一周后將苗移出 培養(yǎng)瓶外，洗凈小苗根部的培養(yǎng)基，在600倍液的多菌靈溶液中浸泡30s~Imin后，移栽到經(jīng) 多菌靈溶液消毒好的栽培基質(zhì)上；
[0032] B.栽培基質(zhì)配比及處理:分別取草炭±、挪慷和河沙，按體積比計:草炭±:挪慷： 河沙=3:2:1的比例混勻，用多菌靈溶液淋透后蓋上薄膜捂4d后掲開，用清水淋透后種苗；
[0033] C.管理:移栽8d后，覆蓋薄膜保濕，基質(zhì)濕度保持80 %~90 %左右，然后逐漸降低 到70% ;空氣濕度90% W上，然后逐漸降低到60%~70%;遮陰60%~70%，然后逐漸減少 到30%;在控溫大棚中培育6~8個月，待植株生長至高15~20cm，具有5~6片展開葉片時， 可定植到田間；
[0034] D.施肥：15~20d后幼苗生新根，晴天上午采用0.2%~0.3%尿素溶液噴霧后，并 用清水淋洗，每7d施肥1次；
[0035] E.病蟲害防治:利用500倍多菌靈、500倍百菌清、800倍甲霜靈復合防病，利用菊醋 類殺蟲劑除蟲。
[0036] 實施例二
[0037] 1、葉片誘導分化不定芽過程
[0038] 采集幼嫩的走馬胎葉片，清洗消毒后用無菌紙吸干水分，然后沿與葉脈垂直方向 切成0.7cm X 1.5cm的小塊50塊，接種于誘導培養(yǎng)基(MS+6-BA 1.5mg/L+IBA0.6mg/L+薦糖 30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH值為5.8)上誘導分化不定芽，培養(yǎng)溫度24~26°C，光照時間10~ 12h/d，光照強度20~30皿〇1 · πΓ2 · s^;培養(yǎng)8天左右，開始在葉片切口處葉片表面分化不 定芽，培養(yǎng)30天后，每塊葉片分化不定芽數(shù)為8~23個，將分化出不定芽的葉片細切成含有2 個不定芽的小塊100塊，然后再接種于新鮮誘導培養(yǎng)基進行繼代增殖培養(yǎng)，直至形成叢芽。
[0039] 2、壯苗培養(yǎng)過程
[0040] 將叢芽切割成小叢后轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.3mg/L+NAA 0.1mg/L+薦糖 30g/L+卡拉膠6.5g/L+l 0 %挪子水上進行壯苗培養(yǎng)，pH值為5.8)上進行壯苗培養(yǎng)。
[0041] 3、生根誘導過程
[0042] 經(jīng)壯苗培養(yǎng)的不定芽長到2~3cm高時，單株切取200株，接種于生根培養(yǎng)基(MS+ NAA 0.3mg/L+IBA0.5mg/L+薦糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，抑值為5.8。）上進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng) lOd后，開始從切口處產(chǎn)生不定根，培養(yǎng)1個月后形成良好根系，獲得完整植株。
[0043] 4、移栽和管理過程
[0044] A.移栽:將150株根系完整的生根苗連瓶放置在控溫大棚中煉苗，一周后將苗移出 培養(yǎng)瓶外，洗凈小苗根部的培養(yǎng)基，在600倍液的多菌靈溶液中浸泡30s~Imin后，移栽到經(jīng) 多菌靈溶液消毒好的栽培基質(zhì)上；
[0045] B.栽培基質(zhì)配比及處理:分別取草炭±、挪慷和河沙，按體積比計:草炭±:挪慷： 河沙=5:2:1的比例混勻，用多菌靈溶液淋透后蓋上薄膜捂4d后掲開，用清水淋透后種苗；
[0046] C.管理:移栽9d后，覆蓋薄膜保濕，基質(zhì)濕度保持80 %~90 %左右，然后逐漸降低 到70% ;空氣濕度90% W上，然后逐漸降低到60%~70%;遮陰60%~70%，然后逐漸減少 到30%;在控溫大棚中培育6~8個月，待植株生長至高15~20cm，具有5~6片展開葉片時， 可定植到田間。
[0047] D.施肥：15~20d后幼苗生新根，晴天上午采用0.2 %~0.3 %尿素溶液噴霧后，并 用清水淋洗，每7d施肥1次；
[0048] E.病蟲害防治:利用500倍多菌靈、500倍百菌清、800倍甲霜靈復合防病，利用菊醋 類殺蟲劑除蟲。
[0049] 實施例Ξ
[0050] 1、葉片誘導分化不定芽過程
[0051] 采集幼嫩的走馬胎葉片，清洗消毒后用無菌紙吸干水分，然后沿與葉脈垂直方向 切成0.8cm X 1.8cm的小塊50塊，接種于誘導培養(yǎng)基(MS+6-BA 2. Omg/L+IBA 1.0mg/L+薦糖 30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH值為5.8)上誘導分化不定芽，培養(yǎng)溫度24~26°C，光照時間10~ 12h/d，光照強度20~30皿〇1 · πΓ2 · s^;培養(yǎng)8天左右，開始在葉片切口處葉片表面分化不 定芽，培養(yǎng)30天后，每塊葉片分化不定芽數(shù)為8~25個，將分化出不定芽的葉片細切成含有2 個不定芽的小塊100塊，然后再接種于新鮮誘導培養(yǎng)基進行繼代增殖培養(yǎng)，直至形成叢芽。 [0化2] 2、壯苗培養(yǎng)過程
[0053]將叢芽切割成小叢后轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+薦糖 30g/L+卡拉膠6.5g/L+l 0 %挪子水上進行壯苗培養(yǎng)，pH值為5.8)上進行壯苗培養(yǎng)。
[0化4] 3、生根誘導過程
[0055]經(jīng)壯苗培養(yǎng)的不定芽長到2~3cm高時，單株切取200株，接種于生根培養(yǎng)基(MS+ NAA 0.5mg/L+IBAl. 0mg/L+薦糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH值為5.8)上進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng) lOd后，開始從切口處產(chǎn)生不定根，培養(yǎng)1個月后形成良好根系，獲得完整植株。
[0化6] 4、移栽和管理過程
[0057] A.移栽:將150株根系完整的生根苗連瓶放置在控溫大棚中煉苗，一周后將苗移出 培養(yǎng)瓶外，洗凈小苗根部的培養(yǎng)基，在600倍液的多菌靈溶液中浸泡30s~Imin后，移栽到經(jīng) 多菌靈溶液消毒好的栽培基質(zhì)上；
[005引B.栽培基質(zhì)配比及處理:分別取草炭±、挪慷和河沙，按體積比計:草炭±:挪慷： 河沙=5:4:1的比例混勻，用多菌靈溶液淋透后蓋上薄膜捂4d后掲開，用清水淋透后種苗；
[0059] C.管理:移栽8d后，覆蓋薄膜保濕，基質(zhì)濕度保持80 %~90 %左右，然后逐漸降低 到70% ;空氣濕度90% W上，然后逐漸降低到60%~70%;遮陰60%~70%，然后逐漸減少 到30%;在控溫大棚中培育6~8個月，待植株生長至高15~20cm，具有5~6片展開葉片時， 可定植到田間；
[0060] D.施肥：15~20d后幼苗生新根，晴天上午采用0.2%~0.3%尿素溶液噴霧后，并 用清水淋洗，每7d施肥1次；
[0061] E.病蟲害防治:利用500倍多菌靈、500倍百菌清、800倍甲霜靈復合防病，利用菊醋 類殺蟲劑除蟲。
[0062] 二、種苗繁殖效果鑒定
[0063] 1.走馬胎葉片分化效果鑒定
[0064] 為鑒定走馬胎葉片分化及增殖效果，對上述實施例的分化及增殖情況進行觀察， 統(tǒng)計葉片分化數(shù)、增殖數(shù)，計算分化率、增值系數(shù)，結(jié)果見表1。
[0065] 表1走馬胎葉片分化及增殖情況
[0066]
[0067] 上述葉片分化及增殖效果表明，本發(fā)明W改良的MS培養(yǎng)基進行誘導分化不定芽， 分化率可達100%，且后續(xù)增殖效果明顯，增殖系數(shù)達到8.0W上，具有較好的分化率和增殖 系數(shù)。
[0068] 2.不定芽生根效果鑒定
[0069] 為鑒定不定芽的生根效果，對上述實施例的不定芽生根情況進行觀察，統(tǒng)計生根 數(shù)，計算生根率，結(jié)果見表2。
[0070] 表2不定芽的生根情況
[0071]
[0072] ~上述不定芽生根效果表明，本發(fā)明W
改良的MS培養(yǎng)基(MS+NAA+IBA+薦糖+卡拉膠) 對不定芽進行誘導生根，在短時間內(nèi)（1個月左右)誘導出完整根系，生根率達95% W上。
[0073] 3.生根苗苗圃移栽效果鑒定
[0074] 為鑒定生根苗的移栽成活效果，對上述實施例的生根苗苗圃移栽生長情況進行觀 察，統(tǒng)計成活數(shù)，計算生根率，結(jié)果見表3。
[0075] 表3生根苗的移栽生長情況
[0076]
[0077] 上述移栽效果表明，本發(fā)明W誘導出良好根系的生根苗進行苗圃移栽，W草炭±、 挪慷和河沙的混合物為栽培基質(zhì)，具有較高的生根苗移栽成活率，達到90% W上，可W滿足 批量種苗繁殖，為走馬胎人工種植提供支持。
[0078] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術原理的前提下，還可W做出若干改進和潤飾，運些改進和潤飾 也應視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種利用走馬胎葉片快速繁殖種苗的方法，其特征在于，包括葉片誘導分化不定芽、 不定芽繼代增殖、壯苗、生根誘導、移栽和管理過程，其步驟如下： 1) 、葉片誘導分化不定芽過程 取幼嫩的走馬胎葉片，清洗消毒后用無菌紙吸干水分，然后沿與葉脈垂直方向切成0.5 ~I .OcmX 1 ·0~2.0cm的小塊接種于誘導培養(yǎng)基上誘導分化不定芽，培養(yǎng)溫度24~26°C，光 照時間10~12h/d，光照強度20~30μπι 〇1 · πΓ2 · ?Γ1;培養(yǎng)8天后，開始在葉片切口處葉片表 面分化不定芽，培養(yǎng)30天后，將分化出不定芽的葉片細切成含有2~4個不定芽的小塊后再 接種于新鮮誘導培養(yǎng)基進行繼代增殖培養(yǎng)，直至形成叢芽;所述誘導培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基 為基本培養(yǎng)基，并添加6-ΒΑ0 · 5~2 · Omg/L、IBAO · 1~1 · Omg/L、鹿糖30g/L、卡拉膠6 · 5g/L，pH 值為5.8; 2) 、壯苗培養(yǎng)過程 將叢芽切割成小叢后轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基上進行壯苗培養(yǎng);所述壯苗培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng) 基為基本培養(yǎng)基，并添加6-BA0 · 1~0 · 5mg/L、NAA0 · lmg/L、鹿糖30g/L、卡拉膠6 · 5g/L、10% 椰子水，pH5.8; 3) 、生根誘導過程 經(jīng)壯苗培養(yǎng)的不定芽長到2~3cm高時，單株切取，接種于生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)， 培養(yǎng)IOd后，開始從切口處產(chǎn)生不定根，培養(yǎng)1個月后形成良好根系，獲得完整植株;所述生 根培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加 NAAO . 1~0.5mg/L、IBAO . 1~1.0 mg/L、蔗糖 30g/L、卡拉膠6.5g/L，pH 5.8; 4) 、移栽和管理過程 A. 移栽:將生根苗連瓶放置在控溫大棚中煉苗，一周后將苗移出培養(yǎng)瓶外，洗凈小苗根 部的培養(yǎng)基，在600倍液的多菌靈溶液中浸泡30s~Imin后，移栽到經(jīng)多菌靈溶液消毒好的 栽培基質(zhì)上； B. 栽培基質(zhì)配比及處理：分別取草炭土、椰糠和河沙，按體積比計：草炭土 :椰糠:河沙 =3~5:2~4:1的比例混勻，用多菌靈溶液淋透后蓋上薄膜捂3~5d后揭開，用清水淋透后 種苗； C. 管理:移栽7~IOd后，覆蓋薄膜保濕，基質(zhì)濕度保持80%~90%左右，然后逐漸降低 到70%;空氣濕度90%以上，然后逐漸降低到60%~70%;遮陰60%~70%，然后逐漸減少 到30%;在控溫大棚中培育6~8個月，待植株生長至高15~20cm，具有5~6片展開葉片時， 可定植到田間； D. 施肥：15~20d后幼苗生新根，晴天上午采用0.2%~0.3%尿素溶液噴霧后，并用清 水淋洗，每7d施肥1次； E. 病蟲害防治：利用500倍多菌靈、500倍百菌清、800倍甲霜靈復合防病，利用菊酯類殺 蟲劑除蟲。
【文檔編號】A01H4/00GK105918121SQ201610266120
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月22日
【發(fā)明人】符運柳, 王加賓, 黃碧蘭, 李志英, 徐立, 李克烈
【申請人】中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所