與匹配大鼠3'E的3'端的同源尾連接的URA3以及在上 游與匹配上述人VH6-1的5 '端的尾連接的CEM的pBeIo-CEN-URA載體。在BAC3和Annabe 1 中的人VH6-1區(qū)之間有10. 3kb重疊?？梢詫㈦S后為大鼠 CH區(qū)的人VH6-1-D-JH與Annabel 中的釀酒酵母URA3-起切出為單個約183kb NotI-片段（參見圖1頂部）。
[0110] 通過限制分析和部分測序?qū)AC6-VH3-11、BAC3和Annabel全面檢查它們的真實 性。
[0111] b)IgL 基因座
[0112] 通過重組組裝V λ YAC與含有粘粒的3C λ，獲得在約410kb YAC上的人Ig λ基 因座25。重排和表達(dá)在源于含有完全人Ig λ YAC的一個拷貝的ES細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn) 行驗證38。除去V λ 3-275'的約IOOkb區(qū)，通過產(chǎn)生環(huán)形YAC，將此Ig λ YAC縮短。將載體 pYAC-RC用ClaI和BspEI消化以除去URA3,并與來自含有HYG的pAP 599的Clal/NgoMIV 片段連接。含有來自新載體（pYAC-RC-HYG)的酵母著絲粒和潮霉素標(biāo)記基因的區(qū)的PCR是 用具有與V λ 3-27的5'區(qū)同源的5'端（引物276)并在YAC臂中的ADE2標(biāo)記基因內(nèi)（引 物275)的引物實施的。利用高效乙酸鋰轉(zhuǎn)化方法 42并在含有潮霉素的YH)板上選擇，將 PCR片段（3. 8kb)整合到Ig λ YAC中。從克?。‥picentre MasterPure酵母DNA純化試劑 盒）制備DNA，并利用以下寡核苷酸：243+278和Hyg端R+238,通過PCR分析正確的連接。 制備塞子（Plug) 43,并通過PFGE (0. 8 %瓊脂糖（PFC) (Biorad)凝膠[6V/cm，60秒持續(xù)10小 時和10秒持續(xù)10小時的脈沖時間，8°C )除去酵母染色體，使環(huán)形酵母人工染色體困留在 瓊脂糖塊中44。將塊除去并用NruI消化。簡言之，將塊用過量的限制酶緩沖液以IX最終 濃度在冰上預(yù)孵育1小時。將過量的緩沖液除去，只留下足夠覆蓋塞子的緩沖液，將限制酶 添加至lOOU/ml的最終濃度，并將試管在37°C下孵育4-5小時。通過PFGE使線性化的YAC 跑出塊，從凝膠中以條帶切出，并如下所述進(jìn)行純化。
[0113] 對于人 IgK 基因座，選擇 3 個 BAC(RP11-344F17、RP11-1134E24 和 RP11-156D9， Invitrogen)，其覆蓋從5' Vk 1-17至3' KDE45大于300kb的區(qū)。在消化和序列分析中，鑒 定三個重疊片段：從V κ 1-17至V κ 3-7 (150kb NotI有約14kb重疊），從V κ 3-7至C κ的 3'（158kb NotI有約40kb重疊）以及從Ck至KDE的3'（55kb PacI有40kb重疊）。重 疊區(qū)在被共注入卵母細(xì)胞中時通?？捎欣谶B接整合24。
[0114] 凝膠分析和DNA純化
[0115] 通過限制消化和在常規(guī)0. 7 %瓊脂糖凝膠上分離，對純化的YAC和BAC DNA進(jìn)行 分析46。利用在〇· 5% TBE中的0· 8% PFC Agaraose，以2-20秒轉(zhuǎn)換時間持續(xù)16h，6V/cm， 10mA，在80C通過PFGE (Biorad Chef MapperTM)分離較大的50-200kb片段。純化使所得 片段與從序列分析獲得的預(yù)測大小得以直接比較。通過PCR和測序?qū)Ω淖冞M(jìn)行分析。
[0116] 線性YAC、環(huán)形YAC和BAC片段在消化后，利用ElutrapTM(Schleicher和 Schuell)47從由常規(guī)操作的0.8%瓊脂糖凝膠或者由脈沖場凝膠電泳（PFGE)切下的條帶通 過電洗脫進(jìn)行純化。DNA濃度通常是在約100 μ 1體積中幾 ng/ μ 1。對于多達(dá)約200kb的 片段，使DNA沉淀并再溶解于顯微注射緩沖液（IOmM Tris-HCl pH 7. 5、IOOmM EDTA pH 8 和IOOmM NaCl但沒有精胺/亞精胺）達(dá)到期望的濃度。
[0117] 從酵母純化環(huán)形YAC是利用Nucleobond AX基于二氧化娃的陰離子交換樹 脂（Macherey-Nagel，Germany)進(jìn)行的。簡言之，利用裂解酶（zymolyase)或溶細(xì)胞 酶（Iyticase)制備原生質(zhì)球并制成顆粒 2°。然后使細(xì)胞進(jìn)行堿裂解，結(jié)合至AX100柱， 并按照在Nucleobond方法中所述洗脫低拷貝數(shù)質(zhì)粒。利用Plamid - Safe? ATP依 賴性DNA酶（Epicentre Biotechnologies)將污染的酵母染色體的DNA水解，隨后利 用SureClean(Bioline)的進(jìn)行最終清除步驟。然后用環(huán)形YAC轉(zhuǎn)化DHlO電感受態(tài) (electrocompetent)細(xì)胞（Invitrogen)的等分試樣以獲得BAC克隆。對于顯微注射，利用 S印harose 4B-CL過濾步驟48,將插入DNA(150-200kb)從BAC載體DNA (約IOkb)中分離。
[0118] 大鼠的來源和育種
[0119] 將編碼重組免疫球蛋白基因座的純化的DNA再混懸于含有IOmM精胺和IOmM亞精 胺的顯微注射緩沖液中。將DNA以從0. 5至3ng/ μ 1的各種濃度注入受精的卵母細(xì)胞中。
[0120] 將編碼對大鼠免疫球蛋白基因特異的ZFN的質(zhì)粒DNA或mRNA以0. 5至lOng/ul 的各種濃度注入受精的卵母細(xì)胞中。
[0121] 顯微注射在Caliper Life Sciences設(shè)施上進(jìn)行。在國際實驗動物評估和認(rèn) 可委員會（AAALAC)認(rèn)可的動物設(shè)施中，在經(jīng)批準(zhǔn)的動物關(guān)照協(xié)議下，將遠(yuǎn)系雜交種SD/ Hsd(WT)株動物在標(biāo)準(zhǔn)微隔離器（microisolator)籠中飼養(yǎng)。按照14-10小時亮/暗循 環(huán)，隨意進(jìn)食和飲水，飼養(yǎng)大鼠。在與遠(yuǎn)系雜交種SD/Hsd雄性育種之前，對4至5周齡 的SD/Hsd雌性大鼠注射20-25IU PMSG(Sigma-Aldrich)，接著在48小時后注射20-25IU hCG(Sigma-AldriCh)。將受精的1-細(xì)胞階段胚胎收集用于隨后顯微注射。將經(jīng)處理的胚 胎移植到假妊娠的SD/Hsd雌性大鼠從而攜帶至分娩。
[0122] 在 10 - 18 周齡，對多特征（Multi-feature)人 Ig 大鼠 （人 IgH、Ig κ 和 Ig λ 與 大鼠 J Κ0、K KO和λ KO組合）和作為對照的WT進(jìn)行分析。將動物在無特定病原體的條件 下在 Charles River 飼養(yǎng)。
[0123] PCR 和 RT-PCR
[0124] 利用基因組DNA小試劑盒（Genomic DNA Mini Kid) (Bioline)，通過來自尾或耳 夾DNA的PCR，對轉(zhuǎn)基因大鼠進(jìn)行鑒定。對于IgH PCR〈lkb，在以下條件下使用GoTaq Green Master混合物（Promega) :94°C 2分鐘，32x(94°C 30秒，54-670C(關(guān)于引物和具體的退火 溫度，參見補(bǔ)充表1)30秒，72°C 1分鐘），72°C 2分鐘。對于IgHPCR>lkb，在以下條件下 使用 KOD 聚合酶（Novagen) :95°C 2 分鐘，32x(95°C 20 秒，56-620C(補(bǔ)充表 1)20 秒，70°C 90秒），70°C 2分鐘。對于IgK和IgAPCR，全部〈lkb，除了在72°C延伸50秒之外使用以 上條件。
[0125] 使用RiboPure血液試劑盒（Ambion)從血液提取RNA，并使用RNASpin小試劑盒從 脾、骨髓或淋巴結(jié)中提取RNA。（GE Healthcare)。使用Oligo dT和Promega反轉(zhuǎn)錄酶在 42 °C持續(xù)1小時制備cDNA。GAPDH PCR反應(yīng)（寡核苷酸429-430)測定濃度。
[0126] 使用具有大鼠 yCH2的VH前導(dǎo)引物或者大鼠 yCH2引物（補(bǔ)充表1)，設(shè)置 RT-PCR。用 GoTaq Green Master 混合物擴(kuò)增是 94°C 2 分鐘，34x(94°C 30 秒，55-65°C 30秒，72°C 50-60秒），72°C 2分鐘。將具有預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物通過凝膠或者 QuickClean(Bioline)純化，并直接測序或者克隆到pGemT(Promega)中。
[0127] 蛋白質(zhì)純化
[0128] 按照操協(xié)議所描述的，在抗IgM親和基質(zhì)（BAC B.V.，荷蘭， CaptureSelect#2890. 05)上純化IgM。相似地，按照協(xié)議，在抗L鏈親和基質(zhì) (CaptureSelect 抗 Ig κ #0833 和抗 Ig λ #0849)上純化人 Ig κ 和 Ig λ。
[0129] 對于大鼠 IgG純化29，使用蛋白A和蛋白G瓊脂糖 (Innova，Cambridge, UK，#851-0024和#895-0024)。將血清與樹脂一起孵育，并在溫和的混 合下在0.1 M磷酸鈉（對于蛋白G pH 7和對于蛋白A pH 8)下促進(jìn)結(jié)合。用該混合物填 充Poly-pr印柱（Bio-Rad)，并用PBS ρΗ7· 4充分地洗滌。洗脫緩沖液是0· IM檸檬酸鈉 pH 2. 5,中和緩沖液是IM Tris-HCl pH 9
[0130] 在4-15 % SDS-PAGE上進(jìn)行電泳，并且利用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色。麗標(biāo)準(zhǔn) 是 HyperPage 預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（HyperPage Prestained Protein Marker) (#BI0-33066,Bioline)。
[0131] 流式細(xì)胞術(shù)分析和FISH
[0132] 將細(xì)胞懸液清洗并在PBS-I % BSA-0. 1 %疊氮化物中調(diào)節(jié)至5x105個細(xì)胞 /100 μ 1。利用小鼠抗大鼠 IgM FITC-標(biāo)記的 mAb (MARM4, Jackson Immunoresearch Laboratories)與抗B細(xì)胞CD45R(大鼠 B220)-PE-綴合的mAb (His 24, BD biosciences)或 者抗IgD-PE-綴合的mAb (MARD-3, Abd Serotec)組合，鑒定不同的B細(xì)胞子集。利用FACS CantoII 流式細(xì)胞儀和 FlowJo 軟件（Becton Dickinson, Pont de Claix,法國）進(jìn)行分析。
[0133] 利用所述純化的IgH和IgL C-區(qū)BAC，在固定的血液淋巴細(xì)胞上實施熒光原位雜 交。49
[0134] 免疫、細(xì)胞融合和親和力測定
[0135] 用在 CFA 中的 125yg PG、在 CFA 中的 150yg hGHR、在 CFA 中的 200 yg Tau/KLH、 在CFA中的150 μ g HEL、在CFA中的150 μ g 0VA，在尾根處進(jìn)行免疫，并如所述在22天后將 髂內(nèi)側(cè)淋巴結(jié)細(xì)胞與小鼠 P3X63Ag8. 653骨髓瘤細(xì)胞融合為了多重免疫，將蛋白125 μ g PG或HEL、或者100 μ g hGHR或CD14在GERBU佐劑（www. Gerbu. com)中按如下進(jìn)行腹膜內(nèi) 施用：第0天、第14天、第28天和第41天沒有佐劑，然后在4天后使脾細(xì)胞與P3x63Ag8. 653 細(xì)胞融合。42
[0136] 按照所述使用Biacore 2000,抗原直接被固定，通過表面等離子共振對結(jié)合動力 學(xué)進(jìn)行分析
[0137] 補(bǔ)充表1
[0138] 檢測人IgH和IgL整合和表達(dá)的PCIf和RT-PCR #條件
[0139]
[0142] *對于從耳和尾夾提取DNA，使用基因組DNA小試劑盒（Bioline)。對于Ikb或尺 寸更小的PCR，在以下條件下使用GoTaq Green Master混合物（Promega) :94°C 2分鐘， 32x (94°C 30 秒，Tm-5 (以下）30 秒，72°C 1 分鐘[對于 Ig ic / λ 為 50 秒])，72°C 2 分鐘。將 退火溫度設(shè)定在最低引物 Tm_5°C (www. sigmagenosys. com/calc/DNACalc. asp)。對于 PCR > lkb，在以下條件下使用KOD聚合酶（Novagen) :95°C 2分鐘，32x(95°C 20秒，Tm-520秒， 70°C 90 秒），70°C 2 分鐘。

[0147] 〃使用RiboPure血液試劑盒（Ambion)從血液中提取RNA。使用RNASpin小試劑 盒（GE Healthcare)從脾、骨髓或淋巴結(jié)中提取RNA。使用寡核苷酸dT和Promega反轉(zhuǎn)錄 酶在42°C持續(xù)1小時下制備cDNA。對使用GoTaq Green Master混合物的PCR設(shè)定如下： 94°C 2 分鐘，34x (94°C 30 秒，Tm-5 30 秒，72°C 1 分鐘[對于 Ig K / λ 為 50 秒])，72°C 2 分 鐘。
[0148] 引物


[0152] 結(jié)果
[0153] 人IgH和IgL基因座
[0154] 人Ig基因座的構(gòu)建采用已確立的技術(shù)來使用YAC和BAC組裝大DNA區(qū)段％19' 24-26。 如同在大腸桿菌中的多重BAC修飾，頻繁缺失重復(fù)區(qū)例如轉(zhuǎn)換序列和增強(qiáng)子，開發(fā)了一種 方法用以將釀酒酵母中具有重疊端的序列組裝為環(huán)形YAC (cYAC)并隨后將此類cYAC轉(zhuǎn)變 成BAC。YAC的優(yōu)點包括它們的大尺寸、易于在酵母宿主中同源改變以及序列穩(wěn)定性，而在 大腸桿菌中繁殖的BAC提供易于制備和高收率的優(yōu)點。此外，與在YAC中相比，在BAC中可 以更好地實現(xiàn)詳細(xì)的限制性內(nèi)切酶圖譜和測序分析。
[0155] 序列分析和消化鑒定所關(guān)注的基因簇并確?；蜃暾院凸δ苄?，以保證DNA 重排并在廣泛的區(qū)中轉(zhuǎn)換。人IgH(隨后為大鼠 C基因的人VH、D和JH區(qū)段）、IgK和 IgA基因座的布局在圖la-c中示出。如前所示，重疊區(qū)在被共注入卵母細(xì)胞中時通?？?有利于連接整合 24。因此，BAC6-VH3-ll、182kb AsiSI-AscI 片段、BAC3、173kb NotI 片段和 BAC3-lN12M5I8(Hu-大鼠 Annabel)、193kb NotI片段的插入，導(dǎo)致完全功能性轉(zhuǎn)基因 IgH基 因座在大鼠基因組中的重建。相似地，將人IgK基因座通過同源重疊進(jìn)行整合。將人IgA 基因座完整分離作為約300kb YAC，并完全插入到大鼠染色體中。通過轉(zhuǎn)錄分析來鑒定整合 成功，此表明從注射的基因座的最5'至最3'端的V(D)J-C重組。通過qPCR(未示出）鑒 定出多個拷貝，并且可能發(fā)生首至尾整合。在所有情況中，通過育種產(chǎn)生具有單-位點整合 的轉(zhuǎn)基因動物。
[0156] 育種為純合性
[0157] 通過DNA顯微注射到卵母細(xì)胞中衍生出轉(zhuǎn)基因大鼠，它們的育種和免疫與小鼠相 似。但是，僅是最近才報道了獲得基因敲除的ZFN技術(shù)利用ZFN KO技術(shù)通過Jh缺失 使大鼠 IgH基因座沉默已經(jīng)有描述11并且描述大鼠 IgL基因座的沉默、Ck的靶向和J-CA 基因的缺失的原稿正在準(zhǔn)備中。我們獲得具有整合的人Ig基因座和沉默的內(nèi)源性Ig產(chǎn)生 的多個建立者（founder);對全部建立者通過PCR和FISH進(jìn)行分析，對完全轉(zhuǎn)基因座整合 進(jìn)行選擇和品種間雜交（表2)。幾個建立者大鼠攜帶低轉(zhuǎn)基因座拷貝數(shù)；根據(jù)Cy和Ca 產(chǎn)物的qPCR(未示出）確定OmniRat中的大鼠 C-基因 BAC可能以5個拷貝被完全整合。通 過在許多種系中單一位置插入的FISH鑒定，證實BAC混合物的散布或多重整合是罕見的； 實現(xiàn)了育種為純合性的優(yōu)點。
[0158] 表2 :產(chǎn)生的大鼠系：轉(zhuǎn)基因整合、敲除和基因使用
[0160] 使攜帶個體人轉(zhuǎn)基因座_IgH、IgK和Ig λ -的大鼠與Ig基因座KO大鼠成功雜交 為純合性。這樣產(chǎn)生出高效的新型多特征系（OmniRats?)，其具有大于400kb的人V h-D-Jh 區(qū)，所述人Vh-D-Jh區(qū)含有22個功能性Vh和約116kb的大鼠 C區(qū)。DNA重排、表達(dá)水平、類 型轉(zhuǎn)換和超突變在不同的建立者之間非常相似，并且與wt大鼠相似。這大概由于相關(guān)的大 鼠恒定區(qū)容納幾個C，并且3' E (增強(qiáng)子控制）區(qū)呈真實構(gòu)型。
[0161] 在敲除背景下的B細(xì)胞發(fā)育
[0162] 為了評價引入的人Ig基因座是否能夠重建正常的B細(xì)胞發(fā)育，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分 析。在脾和骨髓淋巴細(xì)胞中，對特定的分化階段進(jìn)行分析（圖2)，這之前顯示在JK0/JK0大 鼠中缺乏B細(xì)胞發(fā)育 ' 并且在κ KO/κ KO中以及在λ KO/λ KO動物中沒有相應(yīng)的IgL表 達(dá)（數(shù)據(jù)未示出）。最突出的是，與Wt動物相比，在OmniRat中B細(xì)胞發(fā)育的完全恢復(fù)，其 中在骨髓和脾中有相似數(shù)量的B220(⑶45R)+淋巴細(xì)胞。在大比例的⑶45R+B細(xì)胞中的IgM 表達(dá)標(biāo)志著完全重建的免疫系統(tǒng)。在OmniRat和wt動物之間，脾細(xì)胞的尺寸和形狀分離不 能區(qū)別，因此在用大鼠 C區(qū)表達(dá)人獨(dú)特型的轉(zhuǎn)基因大鼠中得到成功恢復(fù)。此外，小SlgG+淋 巴細(xì)胞群存在于OmniRat中（圖2右側(cè)）。
[0163] 對其他OmniRat淋巴細(xì)胞組織的分析表明它們與wt對照不能區(qū)另I」，例如，T-細(xì)胞 子集完全得以保留（數(shù)據(jù)未示出），這進(jìn)一步支持最佳免疫功能已經(jīng)完全恢復(fù)的觀點。
[0164] 多樣性人H-和L-鏈轉(zhuǎn)錄體
[0165] 使用來自具有功能性內(nèi)源Ig基因座的轉(zhuǎn)基因大鼠的血液淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞，實 施全面轉(zhuǎn)錄分析。從特定的人正向至Cy或Cy反向引物的RT-PCR表明人VHDjj9 使用。對于L-鏈分析組，特定的人Vk或νλ正向引物與Ck或CA反向引物一起使用。 結(jié)果（表3)顯示視為功能性的全部整合的人V h基因的使用21與D區(qū)段和全部J 段的多 樣性使用相結(jié)合。
[0166]
[0167] 在JK0/JK0背景下的類型轉(zhuǎn)換和超突變的分析（圖3)表明，這些必需的并且高度 適合的機(jī)制在OmniRat中完全可操作。來自PBL的IgG轉(zhuǎn)換產(chǎn)物的擴(kuò)增揭示在大多數(shù)細(xì)胞 (約80% )中并且在近乎相等數(shù)量的γ?和y2b H-鏈中，有廣泛的突變率（>2個aa改 變）。還鑒定出小百分比的轉(zhuǎn)換序列y2a和2c(圖3)，