和人恒定區(qū)的抗體。
[0069] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所用的人工基因座包含至少一個(gè)人工恒定區(qū)基因。例如，示例 性的人工C恒定區(qū)基因是編碼人IgG CHl結(jié)構(gòu)域和大鼠 IgG CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū)基 因。因此，此類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有產(chǎn)生免疫球蛋白分子的多樣性庫的能力，所述免疫球蛋白分 子包括具有人獨(dú)特型以及包含人和非人組分兩者的人工恒定區(qū)的抗體。
[0070] 將含有人工Ig基因座的轉(zhuǎn)基因載體引入受體細(xì)胞或細(xì)胞中，然后通過隨機(jī)整合 或者通過革G向整合，整合到該受體細(xì)胞或細(xì)胞的基因組中。
[0071] 對(duì)于隨機(jī)整合，可通過標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)將含有人工Ig基因座的轉(zhuǎn)基因載體引 入受體細(xì)胞中。例如，可以將轉(zhuǎn)基因載體直接注入受精卵母細(xì)胞的原核中。也可以通過在 卵母細(xì)胞受精之前精子與轉(zhuǎn)基因載體的共孵育，將轉(zhuǎn)基因載體引入。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以從受 精的卵母細(xì)胞發(fā)育。引入轉(zhuǎn)基因載體的另一種方式是通過轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞或其他多能細(xì) 胞（例如原始生殖細(xì)胞）而后將經(jīng)基因修飾的細(xì)胞注入發(fā)育中的胚胎中。或者，可以將轉(zhuǎn) 基因載體（裸露的或者與促進(jìn)劑（facilitating reagent)結(jié)合）直接注入發(fā)育中的胚胎 中。最后，從該胚胎產(chǎn)生嵌合轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，該胚胎含有被整合在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的至少一些體細(xì) 胞的基因組中的人工Ig轉(zhuǎn)基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將轉(zhuǎn)基因載體引入細(xì)胞的基因組中 并通過核移植克隆從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞獲得動(dòng)物。
[0072] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將含有人工Ig基因座的轉(zhuǎn)基因隨機(jī)地整合到受體細(xì) 胞（例如受精的卵母細(xì)胞或者發(fā)育中的胚胎）的基因組中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，獲 得這樣的后代，其對(duì)于內(nèi)源性Ig重鏈和/或Ig輕鏈?zhǔn)菬o合子的，因此不能產(chǎn)生內(nèi)源性免疫 球蛋白而能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因免疫球蛋白。
[0073] 對(duì)于靶向整合，可以將轉(zhuǎn)基因載體引入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中，例如胚胎干細(xì)胞、其他 多能細(xì)胞或者已經(jīng)分化的體細(xì)胞。而后，可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)已將轉(zhuǎn)基因整合到動(dòng)物基因 組中的細(xì)胞進(jìn)行選擇。然后可以將選定的細(xì)胞與去核的核移植單位細(xì)胞（例如卵母細(xì)胞 或胚胎干細(xì)胞）進(jìn)行融合，所述核移植單位細(xì)胞是全能的并能夠形成功能性新生兒。融合 是按照得到確認(rèn)的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行的。參見，例如，Cibelli等人，S CienCe(1998) 280:1256 ; Zhou等人Science (2003) 301:1179。卵母細(xì)胞的去核和核移植還可以利用注射吸量管通過 顯微外科手術(shù)實(shí)施。（參見，例如，Wakayama等人，Nature(1998)394:369。）然后將所得的 細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，并且移植到同步受體中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。或者，可以將選定 的經(jīng)基因修飾的細(xì)胞注入到發(fā)育中的胚胎中，所述發(fā)育中的胚胎隨后發(fā)育成嵌合動(dòng)物。
[0074] 在一個(gè)實(shí)施方案中，大范圍核酸酶用來使在靶點(diǎn)通過雙鏈DNA裂解進(jìn)行的同源性 重組的頻率升高。為了整合到特異性位點(diǎn)中，可以使用位點(diǎn)特異性大范圍核酸酶。在一個(gè) 實(shí)施方案中，靶向內(nèi)源性Ig基因座的大范圍核酸酶用來使同源性重組和用人工Ig基因座 或其部分替代內(nèi)源性Ig基因座或其部分的頻率升高。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物缺乏 功能性Ig輕鏈基因座并且包含人工Ig重鏈基因座。
[0075] 具有人獨(dú)特型的免疫球蛋白
[0076] -旦制得能夠產(chǎn)生具有人獨(dú)特型的免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，通過用抗原使動(dòng)物 免疫，可以容易地獲得針對(duì)該抗原的免疫球蛋白和抗體制劑。如本文使用的，"多克隆抗血 清組合物"包括親和純化的多克隆抗體制劑。
[0077] 多種抗原可以用來使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物免疫。此類抗原包括但不限于活的、減毒的或死 亡的微生物，例如病毒和單細(xì)胞生物（例如細(xì)菌和真菌），微生物的片段，或者從微生物分 離的抗原性分子。
[0078] 用于使動(dòng)物免疫的優(yōu)選的細(xì)菌抗原包括：從金黃色葡萄球菌純化的抗原例如莢膜 多糖類型5和8、毒力因子的重組形式例如α -毒素、粘連素結(jié)合蛋白、膠原結(jié)合蛋白以及 纖連蛋白結(jié)合蛋白。優(yōu)選的細(xì)菌抗原還包括金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、腸球菌、腸桿菌和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae)的減毒形式，或者 來自這些細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)上清液。可用于免疫的其他細(xì)菌抗原包括：純化的脂多糖（LPS)、 莢膜抗原、莢膜多糖和/或外膜蛋白的重組形式、纖連蛋白結(jié)合蛋白、內(nèi)毒素以及來自銅綠 假單胞菌、腸球菌、腸桿菌和肺炎克雷伯菌的外毒素。
[0079] 用于產(chǎn)生針對(duì)真菌的抗體的優(yōu)選的抗原包括真菌或其外膜蛋白的減毒形式，所述 真菌包括但不限于白色念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌和新型隱球菌。
[0080] 用于免疫以產(chǎn)生針對(duì)病毒的抗體的優(yōu)選的抗原包括包膜蛋白以及病毒的減毒形 式，所述病毒包括但不限于呼吸道合胞病毒（RSV)(特別是F-蛋白）、丙型肝炎病毒（HCV)、 乙型肝炎病毒（HBV)、巨細(xì)胞病毒（CMV)、EBV和HSV。
[0081] 通過用分離的腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞系以及腫瘤相關(guān)的抗原使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物免疫，可 以產(chǎn)生對(duì)癌癥特異的抗體，所述腫瘤相關(guān)的抗原包括但不限于，Her-2-neu抗原（針對(duì)該抗 原的抗體用于治療乳腺癌）；CD20、CD22和CD53抗原（針對(duì)該抗原的抗體用于治療B細(xì)胞 淋巴瘤）、前列腺特異性膜抗原（PMSA)(針對(duì)該抗原的抗體用于治療前列腺癌），以及17-1A 分子（針對(duì)該分子的抗體用于治療結(jié)腸癌）。
[0082] 可以將抗原以任何方便的方式在有或沒有佐劑的情況下施用至轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并且 可以按照預(yù)定的時(shí)間表進(jìn)行施用。
[0083] 為了制備單克隆抗體，將脾細(xì)胞從免疫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中分離并用在與轉(zhuǎn)化細(xì)胞 系的細(xì)胞融合中以用于產(chǎn)生雜交瘤，或者將編碼抗體的cDNA通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù) 克隆并在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)。制備單克隆抗體的方法在本領(lǐng)域中是得到確認(rèn)的。參見，例 如，歐洲專利申請(qǐng) 0 583 980 Al( "Method For Generating Monoclonal Antibodies From Rabbits"）、美國專利號(hào) 4,977,081( "Stable Rabbit-Mouse Hybridomas And Secretion Products Thereof"）、W0 97/16537( "Stable Chicken B-cell Line And Method of Use Thereof"）以及 EP 0 491 057 BI ( "Hybridoma Which Produces Avian Specific Immunoglobulin G"），所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文中。對(duì) 于從克隆的cDNA分子體外產(chǎn)生單克隆抗體，Andris-Widhopf等人，"Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display", J Tmmunol Methods242:159 (2000)和 Burton, D.R·，"Phage display"，Immunotechnologyl:87 (1995) 已經(jīng)進(jìn)行了描述。
[0084] 一旦已經(jīng)產(chǎn)生具有人獨(dú)特型的嵌合單克隆抗體，利用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，可 以容易地將此類嵌合抗體轉(zhuǎn)變成完全人抗體。完全人單克隆抗體在人中不是免疫原性的， 并且適合用于人受試者的治療性治療。
[0085] 本發(fā)明的抗體包括僅重鏈抗體
[0086] 在一個(gè)實(shí)施方案中，用抗原使缺乏功能性Ig輕鏈基因座并包含人工重鏈基因座 的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物免疫以產(chǎn)生與抗原特異性結(jié)合的僅重鏈抗體。
[0087] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供源于此類動(dòng)物的產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞，以及從 中獲得的核酸。還提供從中獲得的雜交瘤。還提供從中獲得的完全僅人重鏈抗體以及編碼 核酸。
[0088] 關(guān)于僅重鏈抗體的教義可在現(xiàn)有技術(shù)找到。例如，參見PCT公布W002085944、 W002085945、W02006008548 和 W02007096779。還參見 US 5, 840, 526 ;US 5, 874, 541 ;US 6, 005, 079 ;US 6, 765, 087 ;US 5, 800, 988 ;EP 1589107 ;W0 9734103 ;和 US 6, 015, 695。
[0089] 藥物組合物
[0090] 在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，將經(jīng)純化的單克隆或多克隆抗體與適合于向患 者施用的適當(dāng)?shù)乃幬镙d體混合，從而提供藥物組合物。
[0091] 用本發(fā)明的藥物組合物治療的患者優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人，但是獸醫(yī)用途 也涵蓋在內(nèi)。
[0092] 可用于本發(fā)明的藥物組合物中的藥學(xué)上可接受的載體可以是任何及所有的溶劑、 分散介質(zhì)、等滲劑等。除非對(duì)受體或?qū)Π谄渲械目贵w的治療有效性有損，任何常規(guī)的介 質(zhì)、試劑、稀釋劑或載體在本發(fā)明的藥物組合物中的使用是適當(dāng)?shù)摹?br>[0093] 所述載體可以是液體、半固體（例如糊劑）或者固體載體。載體的實(shí)例包括油類、 水、鹽溶液、醇、糖、凝膠、脂類、脂質(zhì)體、樹脂、多孔基質(zhì)、粘合劑、填充劑、包衣、防腐劑等，或 其組合。
[0094] 治療方法
[0095] 在本發(fā)明的另一方面，提供用于治療脊椎動(dòng)物，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為靈長類動(dòng) 物的疾病的方法，其中人受試者為一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述方法是通過施用適合于 治療所述疾病的本發(fā)明的純化的抗體組合物進(jìn)行的。
[0096] 所述抗體組合物可以用來結(jié)合并且中和或調(diào)節(jié)人體組織中的抗原性實(shí)體，該抗原 性實(shí)體造成或?qū)е录膊』蛘咭鸩黄谕幕虍惓５拿庖邞?yīng)答。本文將"抗原性實(shí)體"定義 為涵蓋任何可溶的或者細(xì)胞表面結(jié)合的分子，包括蛋白質(zhì)以及細(xì)胞或者引起傳染性疾病的 生物，或者至少能夠與抗體結(jié)合并且優(yōu)選地也能夠刺激免疫應(yīng)答的試劑。
[0097] 作為單一療法或者與化療法聯(lián)合，針對(duì)傳染物的抗體組合物的施用導(dǎo)致傳染性顆 粒的消除?？贵w的單次施用使傳染性顆粒的數(shù)量通常降低10至100倍，更普遍地大于1000 倍。相似地，在患有惡性疾病的患者中，作為單一療法或者與化療法聯(lián)合使用的抗體療法使 惡性細(xì)胞的數(shù)量通常降低10至100倍，或者大于1000倍。治療可以在延長的時(shí)間量中重 復(fù)以確保傳染性顆粒、惡性細(xì)胞等的完全消除。在一些情況中，在不存在可檢測量的傳染性 顆粒或不期望的細(xì)胞的情況下，用抗體制劑治療可以繼續(xù)延長的時(shí)間。
[0098] 相似地，對(duì)于免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，抗體療法的使用可以由治療性抗體的單次或多次 施用組成。在不存在任何疾病癥狀的情況下，治療可以繼續(xù)延長的時(shí)間。
[0099] 本主題治療可以以足以抑制傳染性疾病或惡性疾病的劑量與化療法聯(lián)用。在自身 免疫性疾病患者或移植受者中，抗體療法可以以足以抑制免疫反應(yīng)的劑量與免疫抑制療法 聯(lián)用。 實(shí)施例
[0100] 在對(duì)人免疫球蛋白（Ig)基因座為轉(zhuǎn)基因的小鼠中，完全人抗體的遞送的次優(yōu)效 能已歸因于人膜IgH鏈的恒定區(qū)和小鼠細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制之間不完善的相互作用。為了避 免此問題，我們在此描述人源化大鼠株（OmniRat?)，其攜帶嵌合人/大鼠 IgH基因座[包含 22個(gè)人Vh、全部的人D和Jh區(qū)段，呈天然構(gòu)型但連接到大鼠 C 因座]連同完全人輕鏈基 因座[12個(gè)連接至J κ-C κ的V κ和16個(gè)連接至J λ-C λ的V λ ]。通過設(shè)計(jì)者鋅指核酸 酶使內(nèi)源性大鼠 Ig基因座沉默。在免疫后，在產(chǎn)生高親和血清IgG方面，OmniRat與正常 大鼠同樣有效地表現(xiàn)。包含具有亞納摩爾（sub-nanomolar)抗原親和力的完全人可變區(qū)并 且攜帶廣泛的體細(xì)胞突變的單克隆抗體可以容易地獲得-與來自正常大鼠的常規(guī)抗體的 產(chǎn)量相似。
[0101] 材料和方法
[0102] 在YAC和BAC上修飾的人I g基因座的構(gòu)建
[0103] a) IgH 基因座
[0104] 人IgH V基因被2個(gè)BAC覆蓋：含有跨越從VH4-39至VH3-23隨后VH3-11的真 實(shí)區(qū)（authentic region)的BAC6-VH3-11(從可商購獲得的BAC克隆3054M17CITB進(jìn)行修 飾）以及含有跨越從VH3-11至VH6-1的真實(shí)區(qū)的BAC3(811L16RPCI-11)。被稱為Annabel 的BAC是通過將大鼠 CH區(qū)基因緊鄰連接到人VH6-1-Ds-JHs區(qū)的下游進(jìn)行構(gòu)建的（圖1)。 含有人或大鼠 IgH基因座的部分的所有BAC克隆購自Invitrogen。
[0105] 將BAC6-VH3-11和Annabel二者最初在釀酒酵母中構(gòu)建為環(huán)形YAC(cYAC)并進(jìn)一 步核查并作為BAC在大腸桿菌中供養(yǎng)。構(gòu)建細(xì)節(jié)可以在www. ratltd. net查到。
[0106] 不同于YAC，BAC質(zhì)粒制備物產(chǎn)生大量期望的DNA。為了將線性的YAC轉(zhuǎn)變成 cYAC或者用重疊端將DNA片段組裝成釀酒酵母中的單個(gè)cYAC，其還可以作為BAC在大 腸桿菌中供養(yǎng)，構(gòu)建了兩個(gè)自我復(fù)制的釀酒酵母/大腸桿菌穿梭載體PBelo-CEN-URA和 pBeIo-CEN-HYG。簡言之，將釀酒酵母CEM作為AvrII片段從pYAC-RC39切出并連接到 SpeI -線性化pAP5994°。所得的質(zhì)粒含有克隆在釀酒酵母URA3和潮霉素抗性表達(dá)盒（HygR) 之間的CEN4。從該質(zhì)粒，將含有URA3隨后CEM的ApaLI - BamHI片段或者含有CEM隨 后HygR的PmlI - SphI片段切出，并連接到ApaLI和BamHI或者HpaI和SphI雙重消化的 pBACBeloll (New England Biolabs)從而得到 pBelo-CEN-URA 和 pBelo-CEN-HYG。
[0107] 為了構(gòu)建 BAC6-VH3-11，首先將兩個(gè)片段 115kb NotI-PmeI 和 IlOkb RsrII-SgrAI 從BAC克隆3054M17CITB切出。前一片段的3'端與后者的5'端重疊22kb。將NotI-PmeI 片段連接到含有來自PYAC-RC的釀酒酵母CEM以及TRP1/ARS1的NotI-BamHI YAC臂，并 將RsrII-SgrAI片段連接到含有也來自pYAC-RC的釀酒酵母URA3的SgrAI-BamHI YAC臂。 隨后，通過原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化，將連接混合物轉(zhuǎn)化到釀酒酵母AB1380細(xì)胞41，并且選擇URA+TRP+ 酵母克隆。含有從人VH4-39至VH3-23的線性區(qū)的被稱為YAC6的克隆，通過Southern印 跡分析進(jìn)行確認(rèn)。通過在VH3-23的3'添加10. 6kb片段并轉(zhuǎn)變成cYAC，將YAC6進(jìn)一步延 伸。該10. 6kb延伸含有人VH3-11并且也發(fā)生在BAC3的5'端。為了 YAC6的修飾，我們構(gòu) 建了 pBel〇HYG-YAC6+BAC3(5'）。簡言之，通過PCR制備具有重疊端的3個(gè)片段：1) '填充 (stuff) '片段，其含有由HpaI位點(diǎn)側(cè)接的釀酒酵母TRP1-ARS1，其中在YAC6中5'尾匹配 VH4-39的上游序列并且3 '尾匹配VH3-23的下游（利用長寡核苷酸561和562以及pYAC-RC 作為模板），2) 10. 6kb延伸片段，其具有如上所述的匹配VH3-23的下游序列的5'尾和在它 的3'端的單一 AscI位點(diǎn)（利用長寡核苷酸570和412以及人基因組DNA作為模板），以 及3)pBel〇-CEN-HYG載體，其具有下游與匹配10. 6延伸片段的3'端的同源尾連接的CEM 以及上游與匹配如上所述的VH4-39的上游序列的尾連接的HygR(利用長寡核苷酸414和 566以及pBelo-CEN-HYG作為模板）。隨后，通過與原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化相關(guān)的同源性重組，將3 個(gè)PCR片段組裝進(jìn)在釀酒酵母中賦予HYGR和TRP+的小cYAC，并將此cYAC進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成 BAC pBeloHYG-YAC6+BAC3 (5'）。最后，將 HpaI 消化的 pBeloHYG-YAC6+BAC3 (5'）用來轉(zhuǎn)化 攜帶YAC6的酵母細(xì)胞，并通過同源性重組產(chǎn)生僅賦予HYGR的cYAC BAC6-VH3-11。通過轉(zhuǎn) 化，參見以下，將此cYAC作為BAC引入大腸桿菌中。將BAC6-VH3-11中的人VH基因切出為 約182kb AsiSI (天然存在于HygR中）- AscI片段，并將BAC3中的VH基因切出為約173kb NotI-片段（圖1頂部）。
[0108] 對(duì)于C區(qū)與VH重疊的組裝，必須將人VH6-1-D-JH區(qū)緊鄰隨后為大鼠 C的最后JH 的下游的大鼠基因組序列連接從而得到cYAC/BAC。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，制備5個(gè)重疊限制和 PCR片段；人VH6-15'的6. Ikb片段（利用寡核苷酸383和384以及人基因組DNA作為模 板）；含有從BACl (RP11645E6)切出的人VH6-1-D-JH區(qū)的約78kb PvuI-PacI片段；將人JH6 與緊鄰最后JH的下游的大鼠基因組序列連接并含有大鼠 μ編碼序列的部分（利用寡核苷 酸488和346以及大鼠基因組DNA作為模板）的8. 7kb片段；約52kb NotI-PmeI片段，該 片段含有從BAC M5(CH230-408M5)切出的真實(shí)大鼠 μ、δ和Y2c區(qū)；以及具有在下游與匹 配大鼠 γ 2c區(qū)的3'端的同源尾連接的URA3以及在上游與匹配所述人VH6-1的5'區(qū)的尾 連接的CEM的pBelo-CEN-URA載體（利用長寡核苷酸385和550以及pBelo-CEN-URA作 為模板）。在釀酒酵母中通過同源性重組的正確組裝是通過PCR進(jìn)行分析的，并將來自正確 克隆的純化的cYAC轉(zhuǎn)變成大腸桿菌中的BAC。
[0109] 對(duì)于Annabel的組裝，使用以上含有人VH6-1-D-JH、隨后的真實(shí)大鼠 μ、δ和 γ 2c區(qū)的cYAC/BAC的部分，以及PCR片段。五個(gè)重疊片段含有如上所述的在人VH6-1的 5'端處的6. Ikb片段；包含人VH6-1-D-JH且其后緊隨最后JH的下游大鼠基因組序列并 含有大鼠 Cy的部分的約83kb SpeI片段；將大鼠 μ的3'端與大鼠 γ 1的5'端連接 的5. 2kb片段（利用寡核苷酸490和534以及大鼠基因組DNA作為模板）；含有從BAC 18(〇1230-162108)切出的真實(shí)大鼠丫1、丫213、6、（1和3118!1增強(qiáng)子區(qū)的約1181* NotI-SgrAI片段；以及具有在下游