節(jié)物，即在基因座末端的Εμ和3' E (Pettersson等人，Nature, 344, 165 [1990])。 在小鼠中，整個3'調(diào)節(jié)區(qū)（含有1183&、1181，2、118313和1184)的去除容許正常的早期8細 胞發(fā)育但是消除了類別轉(zhuǎn)換重組（Vincent-Fabert等人，Blood, 116, 1895[2010])并 且可能阻礙體細胞超突變的優(yōu)化（Pruzina等人，Protein Engineering, Design and Selection，1，[2011])。當使用轉(zhuǎn)基因的人IgH基因時，實現(xiàn)最佳的同種型表達的調(diào)節(jié) 功能性是特別適合的。具有不完全3' E區(qū)的通常僅提供hsl，2元件的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，即 使在內(nèi)源性IgH基因座被敲除時，也導致在轉(zhuǎn)基因小鼠中令人失望的表達水平。因此，從 在過去20年中生產(chǎn)的構(gòu)建體中已經(jīng)分離出僅僅幾個抗原特異性完全人IgG(Lonberg等 人，Nature 368, 856 [1994] ;Nicholson 等人，J. Immunol.，163, 6898 [1999] ;Davis 等人， Cancer Metastasis Rev. 18, 421 [1999] ;Pruzina等人，Protein Engineering, Design and Selection，1，[2011])。在大鼠 IgH基因座中，僅對3'E區(qū)進行了欠佳地分析。小鼠和 大鼠序列的比較不容許鑒定hs4, hs4為更下游的具有附加重要調(diào)節(jié)序列的關(guān)鍵第4元件 (Chatterjee等人，J. Biol. Chem.，286, 29303[2011])。因為缺乏3'增強子的嵌合多核苷 酸導致受損的同種型轉(zhuǎn)換和低IgG表達，所述本發(fā)明的多核苷酸至少部分地由于包含了此 大鼠3'增強子而有利地提供優(yōu)化的表達。在一個實施方案中，大鼠3'增強子具有包含如 SEQ ID NO: 1所示的序列或其部分或與其基本同源的序列。
[0033] 如本文使用的，具有包含第二序列（例如，SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2等）的一部 分（例如小于整體）或與其基本同源的序列的多核苷酸優(yōu)選地保留該第二序列的生物活性 (例如，保留3'增強子的生物活性以提供免疫球蛋白的優(yōu)化表達和/或同種型轉(zhuǎn)換，能夠重 排以提供人源化嵌合重鏈等）。在一個實施方案中，包含含有SEQ ID NO: 1的一部分或與其 基本同源的序列的核酸包含至少8kB，優(yōu)選至少IOkB的與SEQ ID NO: 1基本同源的連續(xù)核 酸。
[0034] 如本文使用的，"人工Ig基因座"可以指未重排、部分重排或者重排的多核苷酸 (例如，在重鏈的情況中包含V-、D-和/或J區(qū)的序列，或者在輕鏈的情況中包含V-和/ 或J區(qū)的序列，以及對于重鏈和輕鏈之一或兩者，任選地包含恒定區(qū)的序列）。人工Ig基因 座包括人工Ig輕鏈基因座和人工Ig重鏈基因座。在一個實施方案中，本發(fā)明的人工免疫 球蛋白基因座是功能性的并且能夠重排并產(chǎn)生免疫球蛋白鏈的庫。在一個優(yōu)選的實施方案 中，本文公開的多核苷酸的可變結(jié)構(gòu)域或其部分包含呈天然構(gòu)型的基因，即，人Ig基因區(qū) 段的天然存在的序列、人Ig基因區(qū)段的天然存在的序列的簡并形式，以及編碼與由人Ig基 因區(qū)段的天然存在的序列編碼的多肽基本相同的多肽序列的合成序列。在另一個優(yōu)選的實 施方案中，該多核苷酸包含在人中發(fā)現(xiàn)的呈天然構(gòu)型的可變結(jié)構(gòu)域或其部分。例如，編碼如 本文公開的人工Ig重鏈的多核苷酸可以包含呈天然構(gòu)型的至少兩個人V基因、至少兩個D 基因、至少兩個J基因或其組合。
[0035] 在一個優(yōu)選的實施方案中，人工Ig基因座包含非人C區(qū)基因并且能夠產(chǎn)生包括具 有非人C區(qū)的嵌合免疫球蛋白的免疫球蛋白庫。在一個實施方案中，人工Ig基因座包含人 C區(qū)基因并且能夠產(chǎn)生包括具有人C區(qū)的免疫球蛋白的免疫球蛋白庫。在一個實施方案中， 人工Ig基因座包含"人工恒定區(qū)基因"，其是指組成源于人和非人恒定區(qū)基因的核苷酸序 列的恒定區(qū)基因。例如，示例性人工C恒定區(qū)基因是編碼人IgG CHl結(jié)構(gòu)域和大鼠 IgG CH2 和CH3結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū)基因。
[0036] 在一個優(yōu)選的實施方案中，人工Ig基因座包含3'增強子序列，其包括hsl，2、 hs3a、hs3b以及hs3b的下游序列（500-2500nt)。在轉(zhuǎn)基因動物中，包含從Calpha至3'hs3b 的全長約30kb 3' E區(qū)的人工基因座導致高水平IgG表達、廣泛超突變以及大量的具有高 (PM)親和力的抗原特異性雜交瘤。然而，較短的增強子序列減低Ig表達。
[0037] 在一個優(yōu)選的實施方案中，人工Ig基因座包含圖Ia中所示的3'增強子序列。此 序列源于大鼠 Ig重鏈基因座并且含有從Calapha至3' hs3b的3'區(qū)的約30kb。大鼠3' 增強子序列的序列如SEQ ID NO: 1所示。在另一個實施方案中，人工Ig基因座包含含有如 SEQ ID NO: 1所示的序列或其一部分或與其基本同源的序列。
[0038] 在一些實施方案中，人工Ig重鏈基因座缺乏CHl或者容許所得的免疫球蛋白包圍 典型的免疫球蛋白的等效序列：分子伴侶聯(lián)合。此類人工基因座在缺乏功能性Ig輕鏈基因 座的轉(zhuǎn)基因動物中提供僅重鏈抗體的產(chǎn)生，并因此不表達功能性Ig輕鏈。將此類人工Ig 重鏈基因座用于在本文涵蓋的方法中以產(chǎn)生缺乏功能性Ig輕鏈基因座并且包含人工Ig重 鏈基因座的轉(zhuǎn)基因動物，該動物能夠產(chǎn)生僅重鏈抗體。或者，可以將人工Ig基因座原位操 作以破壞CHl或等效區(qū)，并產(chǎn)生人工Ig重鏈基因座，其提供僅重鏈抗體的產(chǎn)生。關(guān)于在輕 鏈缺陷小鼠中僅重鏈抗體的產(chǎn)生，參見例如Zou等人，JEM，204:3271-3283, 2007。
[0039] 所謂"人獨特型"是指存在于由免疫球蛋白V-基因區(qū)段編碼的人抗體上的多肽序 列。如本文使用的，術(shù)語"人獨特型"包括人抗體的天然存在的序列，以及與在天然存在的 人抗體中發(fā)現(xiàn)的多肽基本相同的合成序列。所謂"基本"是指氨基酸序列同一性的程度是 至少約85% -95%。優(yōu)選地，氨基酸序列同一性的程度大于90%，更優(yōu)選大于95%。
[0040] 所謂"嵌合抗體"或"嵌合免疫球蛋白"是指包含人免疫球蛋白多肽序列的一部分 (或者由人Ig基因區(qū)段編碼的多肽序列）和非人免疫球蛋白多肽序列的一部分的免疫球蛋 白分子。本發(fā)明的嵌合免疫球蛋白分子是具有非人Fc-區(qū)或者人工Fc-區(qū)和人獨特型的免 疫球蛋白?？蓮囊呀?jīng)被工程化以產(chǎn)生嵌合免疫球蛋白分子的本發(fā)明的動物中分離此類免疫 球蛋白。
[0041] 所謂"人工Fc-區(qū)"是指由人工恒定區(qū)基因編碼的Fc-區(qū)。
[0042] 如本文使用的，術(shù)語"Ig基因區(qū)段"是指編碼Ig分子的各個部分的DNA的區(qū)，其 存在于非人動物和人的種系中，并且使其在B細胞中結(jié)合在一起以形成重排的Ig基因。因 此，如本文使用的Ig基因區(qū)段包括V基因區(qū)段、D基因區(qū)段、J基因區(qū)段和C基因區(qū)段。
[0043] 如本文使用的，術(shù)語"人Ig基因區(qū)段"包括：人Ig基因區(qū)段的天然存在的序列、人 Ig基因區(qū)段的天然存在的序列的簡并形式，以及合成序列，該合成序列編碼與由人Ig基因 區(qū)段的天然存在的序列編碼的多肽基本相同的多肽序列。所謂"基本"是指氨基酸序列同 一性的程度是至少約85 %-95 %。優(yōu)選地，氨基酸序列同一性的程度大于90 %，更優(yōu)選大于 95%〇
[0044] 本發(fā)明涉及的多核苷酸可以包括DNA或RNA，并且可以是完全或部分地合成的。除 非上下文另外要求，提及如本文所述的核苷酸序列涵蓋具有指定序列的DNA分子，并且涵 蓋具有其中U取代T的指定序列的RNA分子。
[0045] 對兩個序列之間的"同源性"或"序列同一性"（術(shù)語在此可互換地使用）的計算按 如下進行。為了最佳的比較目的，將序列比對（例如，為了最佳的比對，可以將空位引入第 一和第二氨基酸或核酸序列之一或二者中，并且為了比較目的可以不考慮非同源性序列）。 在一個優(yōu)選的實施方案中，為比較目的而比對的參考序列的長度是該參考序列長度的至少 30 %，優(yōu)選至少40 %，更優(yōu)選至少50 %，甚至更優(yōu)選至少60 %，并且甚至更優(yōu)選至少70 %、 80 %、90 %、100 %。然后比較在相應的氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。 當?shù)谝恍蛄兄械奈恢帽慌c第二序列中相應位置處相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，則在 該位置處分子是相同的（如在此使用的，氨基酸或核酸"同一性"相當于氨基酸或核酸"同 源性"）。兩個序列之間的同一性百分比是由所述序列共享的相同位置的數(shù)量的函數(shù)，考慮 為了兩個序列的最佳比對需要引入的空位的數(shù)量以及每個空位的長度。
[0046] 兩個序列之間的序列比較以及序列同一性百分比的確定可以利用數(shù)學算法完 成。在一個優(yōu)選的實施方案中，兩個氨基酸序列之間的同一"性百分比是利用Needleman和 Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-53)算法進行確定的，所述算法已經(jīng)被并入GCG軟件包 中的GAP程序中（在gcg. com可在線獲得），該程序使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣， 以及16、14、12、10、8、6或4的空位權(quán)重以及1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重。在另一個優(yōu)選的 實施方案中，兩個核苷酸序列之間的同一性百分比是利用GCG軟件包中的GAP程序進行確 定（可在WWW. gcg. com獲得）的，該程序使用NWSgapdna. CMP矩陣以及40、50、60、70或80 的空位權(quán)重以及1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重。特別優(yōu)選的參數(shù)組（并且若操作者不確定應 該應用什么參數(shù)來確定分子是否在本發(fā)明的序列同一性或同源性限制內(nèi)，則應采用該參數(shù) 組）是具有空位罰分12、空位延伸罰分4以及移碼空位罰分5的Blossum 62記分矩陣。兩 個氨基酸或核苷酸序列之間的同一性百分比還可以利用Meyers和Miller的算法（（1989) CABIOS 4:11-17)進行確定，所述算法其已經(jīng)被并入ALIGN程序（2.0版）中，該程序利用 PAM120權(quán)重殘基表、空位長度罰分12和空位罰分4。
[0047] 人工Ig基因座
[0048] 本發(fā)明還涉及人工Ig基因座以及它們在制備能夠產(chǎn)生具有人獨特型的免疫球蛋 白的轉(zhuǎn)基因動物中的用途。每個人工Ig基因座包含多個免疫球蛋白基因區(qū)段，其包括至少 一個V區(qū)基因區(qū)段、一個或多個J基因區(qū)段、在重鏈基因座的情況中一個或多個D基因區(qū) 段，以及一個或多個恒定區(qū)基因。在本發(fā)明中，V基因區(qū)段中的至少一個編碼種系或超突變 的人V-區(qū)氨基酸序列。因此，此類轉(zhuǎn)基因動物具有產(chǎn)生包括具有人獨特型的抗體的免疫球 蛋白分子的多樣化庫的能力。在重鏈基因座中，可以將人或非人源的D-基因區(qū)段包括在人 工Ig基因座中。此類基因座中的基因區(qū)段在未重排的構(gòu)型（或者"種系構(gòu)型"）中或者在 部分或完全重排的構(gòu)型中相對于彼此并置。人工Ig基因座具有在受試動物中進行基因重 排（若該基因區(qū)段沒有完全重排）的能力，由此產(chǎn)生具有人獨特型的免疫球蛋白的多樣化 庫。
[0049] 調(diào)節(jié)元件如啟動子、增強子、轉(zhuǎn)換區(qū)、重組信號等可以為人或非人起源。為了賦予 人工基因座功能性，需要的是該元件在相關(guān)的動物物種中可操作。本文更詳細地描述優(yōu)選 的調(diào)節(jié)元件。
[0050] 在一個方面，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，其含有能夠在宿主動物中進行基因重排 的人工重鏈基因座，由此產(chǎn)生具有人獨特型的重鏈的多樣化庫。該轉(zhuǎn)基因的人工重鏈基因 座含有具有至少一個人V基因區(qū)段的V-區(qū)。優(yōu)選地，該V-區(qū)包括至少約5-100個人重鏈 V(或者"VH"）基因區(qū)段。如上所述，人VH區(qū)段涵蓋：人VH基因區(qū)段的天然存在的序列、人 VH基因區(qū)段的天然存在的序列的簡并形式，以及編碼與人重鏈V結(jié)構(gòu)域域多肽基本（即，至 少約85% -95% )相同的多肽序列的合成序列。
[0051] 在一個優(yōu)選的實施方案中，人工重鏈基因座含有至少一個或幾個大鼠恒定區(qū)基 因，例如，CS、Cy和Cy (包括Cy子類中的任一個）。
[0052] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，人工重鏈基因座含有人工恒定區(qū)基因。在一個優(yōu)選 的實施方案中，此類人工恒定區(qū)基因編碼人CHl結(jié)構(gòu)域和大鼠 CH2CH3結(jié)構(gòu)域，或者人CHl 和大鼠 CH2、CH3和CH4結(jié)構(gòu)域。具有人CHl結(jié)構(gòu)域的雜交重鏈與完全人輕鏈有效地配對。
[0053] 在一個優(yōu)選的實施方案中，人工Ig基因座包含3'增強子序列，包括hsl，2、hs3a、 hs3b以及介于大鼠 Calpha和3' hs3b之間的序列。
[0054] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，人工重鏈基因座含有缺乏CHl結(jié)構(gòu)域的人工恒定區(qū) 基因。在一個優(yōu)選的實施方案中，此類人工恒定區(qū)基因編碼缺乏CHl結(jié)構(gòu)域但是包含CH2 和CH3或者CH1、CH2、CH3和CH4結(jié)構(gòu)域的截短的IgM和/或IgG。缺乏CHl結(jié)構(gòu)域的重鏈 不能與Ig輕鏈有效地配對并形成僅重鏈抗體。
[0055] 在另一方面，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，其含有能夠在宿主動物中進行基因重排 的人工輕鏈基因座，由此產(chǎn)生具有人獨特型的輕鏈的多樣化庫。轉(zhuǎn)基因的人工輕鏈基因座 含有具有至少一個人V基因區(qū)段的V-區(qū)，例如，具有至少一個人VL基因和/或至少一個重 排的人VJ區(qū)段的V-區(qū)。優(yōu)選地，該V-區(qū)包括至少約5-100個人輕鏈V (或"VL"）基因區(qū) 段。一致地，人VL區(qū)段涵蓋：人VL基因區(qū)段的天然存在的序列、人VL基因區(qū)段的天然存在 的序列的簡并形式以及編碼與人輕鏈V結(jié)構(gòu)域多肽基本（即，至少約85% -95% )相同的 多肽序列的合成序列。在一個實施方案中，人工輕鏈Ig基因座具有C-區(qū)，其具有至少一個 大鼠 C基因（例如，大鼠 CA或Ck)。
[0056] 本發(fā)明的另一方面涉及制備含有人工Ig基因座的轉(zhuǎn)基因載體的方法。此類方法 包括：分離Ig基因座或其片段，并將所述基因座或其片段與包含編碼人V區(qū)元件的序列的 一個或幾個DNA片段組合。按照保留該基因座在受試動物中進行有效的基因重排的能力這 樣的方式，通過連接或同源性重組而將Ig基因區(qū)段插入人工Ig基因座或其部分中。
[0057] 優(yōu)選地，通過篩選從質(zhì)粒、粘粒、YAC或BAC等的基因組DNA制備的質(zhì)粒、粘粒、YAC 或BAC等的文庫來分離非人Ig基因座。YAC克隆可以攜帶多達2兆堿基的DNA片段，因此 整個動物重鏈基因座或其大部分可以在一個YAC克隆中進行分離，或者進行重建以被包含 在一個YAC克隆中。BAC克隆能夠攜帶較小尺寸（約50-500kb)的DNA片段。然而，可以將 含有Ig基因座的重疊片段的多個BAC克隆單獨改變，并隨后一起注入動物受體細胞中，其 中重疊片段在受體動物細胞中重組以產(chǎn)生連續(xù)的Ig基因座。
[0058] 通過多種方法，包括DNA片段的連接或者通過同源性重組的DNA片段的插入，可以 將人Ig基因區(qū)段整合到載體（例如，BAC克隆）上的Ig基因座中。以這樣一種方式進行 人Ig基因區(qū)段的整合，即將該人Ig基因區(qū)段可操作地連接到轉(zhuǎn)基因中的宿主動物序列，以 產(chǎn)生功能性人源化Ig基因座，即，能夠進行導致產(chǎn)生具有人獨特型的抗體的多樣化庫的基 因重排的Ig基因座。同源性重組可以在細菌、酵母以及其他具有高頻率同源性重組事件的 細胞中進行?？梢匀菀椎貜募毎蟹蛛x工程化的YAC和BAC，并將其用于制備轉(zhuǎn)基因動物
[0059] 包含人工Ig基因座并能夠產(chǎn)生具有人獨特型的抗體的嚙齒動物卵母細胞和轉(zhuǎn)基 因動物
[0060] 在一個方面，本發(fā)明提供能夠產(chǎn)生具有人獨特型的免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物，以 及制備所述轉(zhuǎn)基因動物的方法。
[0061] 所用的轉(zhuǎn)基因動物選自嚙齒動物（例如，大鼠、倉鼠、小鼠和豚鼠）。
[0062] 在本發(fā)明中用于人源化抗體產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物在內(nèi)源性Ig基因座中攜帶種系突 變。在一個優(yōu)選的實施方案中，對于突變的內(nèi)源性Ig重鏈和/或內(nèi)源性Ig輕鏈基因，轉(zhuǎn)基 因動物是純合的。此外，這些動物攜帶至少一個人工Ig基因座，所述人工Ig基因座是功能 性的并且能夠在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生免疫球蛋白分子的庫。在本發(fā)明中所用的人工Ig基因 座包括至少一個人V基因區(qū)段。
[0063] 在一個優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物攜帶至少一個人工Ig重鏈基因座和至少 一個人工Ig輕鏈基因座，其每個都是功能性的并且能夠在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生免疫球蛋白 分子的庫，該免疫球蛋白分子的庫包括具有人獨特型的抗體。在一個實施方案中，使用包括 至少一個非人C基因的人工基因座，并且提供能夠產(chǎn)生具有人獨特型和非人恒定區(qū)的嵌合 抗體的動物。在一個實施方案中，使用包括至少一個人C基因的人工基因座，并且提供能夠 產(chǎn)生具有人獨特型和人恒定區(qū)的抗體的動物。
[0064] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物攜帶至少一個人工Ig重鏈基因座，并且 缺乏功能性Ig輕鏈基因座。此類動物可用于產(chǎn)生僅重鏈抗體。
[0065] 此類轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)生包括將一個或多個人工重鏈Ig基因座和一個或多個人工 輕鏈Ig基因座整合到具有至少一個內(nèi)源性Ig基因座的轉(zhuǎn)基因動物的基因組中，通過一個 或多個大范圍核酸酶的作用，已經(jīng)或?qū)顾鰞?nèi)源性Ig基因座失活。優(yōu)選地，對于內(nèi)源 性Ig重鏈和/或內(nèi)源性Ig輕鏈，轉(zhuǎn)基因動物是無合子的（nullizygous)，因此不能產(chǎn)生內(nèi) 源性免疫球蛋白。無論染色體位置如何，本發(fā)明的人工Ig基因座具有進行基因重排并由此 產(chǎn)生免疫球蛋白分子的多樣化庫的能力。具有進行基因重排的能力的Ig基因座在本文也 被稱為"功能性" Ig基因座，并且具有由功能性Ig基因座產(chǎn)生的多樣性的抗體在本文也被 稱為"功能性"抗體或者抗體的"功能性"庫。
[0066] 用來產(chǎn)生此類轉(zhuǎn)基因動物的人工基因座各包括多個免疫球蛋白基因區(qū)段，其包括 至少一個V區(qū)基因區(qū)段、一個或多個J基因區(qū)段、在重鏈基因座的情況中一個或多個D基因 區(qū)段，以及一個或多個恒定區(qū)基因。在本發(fā)明中，V基因區(qū)段中的至少一個編碼種系或超突 變的人V-區(qū)氨基酸序列。因此，此類轉(zhuǎn)基因動物具有產(chǎn)生免疫球蛋白分子的多樣化庫的能 力，所述免疫球蛋白分子包括具有人獨特型的抗體。
[0067] 在一個實施方案中，所用的人工基因座包含至少一個非人C區(qū)基因區(qū)段。因此，此 類轉(zhuǎn)基因動物具有產(chǎn)生免疫球蛋白分子的多樣化庫的能力，所述免疫球蛋白分子包括具有 人獨特型的嵌合抗體。
[0068] 在一個實施方案中，所用的人工基因座包含至少一個人C區(qū)基因區(qū)段。因此，此類 轉(zhuǎn)基因動物具有產(chǎn)生免疫球蛋白分子的多樣化庫的能力，所述免疫球蛋白分子包括具有人 獨特型