一種暗紫貝母組織培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種暗紫貝母組織培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]暗紫貝母是我國(guó)特有的名貴中藥材，為百合科貝母屬草本植物，以地下鱗莖入藥。有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳功效，用于治療感冒咳嗽、肺熱燥咳、干咳少痰等癥狀。暗紫貝母主要生長(zhǎng)在海拔2800?4500米的高山高原草地上，生長(zhǎng)周期緩慢，對(duì)環(huán)境條件要求十分苛刻，其價(jià)格昂貴，其野生資源已瀕臨枯竭。因此，暗紫貝母長(zhǎng)期存在供不應(yīng)求的問題。
[0003]目前，暗紫貝母主要采用鱗莖和種子繁殖，鱗莖繁殖法用種量大且繁殖系數(shù)低，一般I個(gè)鱗莖只能收1.5?1.6個(gè)鱗莖。種子繁殖成苗率低，速度慢，需要5?6年才能發(fā)育成商品鱗莖的大小。而通過組織培養(yǎng)技術(shù)可提高暗紫貝母的繁殖速度，擴(kuò)大繁殖系數(shù)，大大縮短了鱗莖的形成年限，只要6個(gè)月左右的時(shí)間就可以得到供做藥用的鱗莖。因此，本發(fā)明以暗紫貝母鱗片為外植體，通過外植體消毒、不定芽誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等過程獲得了暗紫貝母離體再植株，建立了有效的暗紫貝母組培快繁殖技術(shù)體系，短時(shí)期內(nèi)即可生產(chǎn)大量種苗，提高繁殖效率，降低生產(chǎn)成本，有利加快其繁育及推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供出一種暗紫貝母組織培養(yǎng)方法，本發(fā)明以暗紫貝母鱗片為外植體，通過外植體消毒、不定芽誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等過程獲得了暗紫貝母離體再植株，建立了有效的暗紫貝母組培快繁殖技術(shù)體系，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明的一種暗紫貝母組織培養(yǎng)方法，包括以下的步驟:
(I)外植體消毒:以暗紫貝母鱗莖為外植體，先75%乙醇浸泡15?30s，
無菌水沖洗3?5次，再用10%?20%次氯酸鈉溶液浸泡20?30min，無菌水沖洗3?5次后備用。
[0006](2)誘導(dǎo)培養(yǎng):將步驟(I)處理好的暗紫貝母鱗莖切成0.5cm左右的切塊并接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為1000?20001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。
[0007](3)增殖培養(yǎng):以步驟(2)誘導(dǎo)得到不定芽作為材料，將老化的和生長(zhǎng)不良的不定芽去掉，并將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的不定芽切成單芽并轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁。接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)增殖情況。
[0008](4)生根培養(yǎng):將經(jīng)步驟(3)后得到的生長(zhǎng)較一致且健壯的未生根的無菌苗單株切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)。接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)生根情況。
[0009](5)煉苗移栽:將生根的無菌苗從培養(yǎng)室中取出放在室外煉苗30天后，再將生根苗從瓶中取出洗去基部的培養(yǎng)基，然后移栽到經(jīng)過高溫滅菌的基質(zhì)(泥炭土:珍珠巖:蛭石=3:1:1)中，定期澆澆1/2MS大量元素營(yíng)養(yǎng)液，覆蓋薄膜，10天后揭膜，揭膜后20天統(tǒng)計(jì)成活率。
[0010]上述步驟(2)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+1.0?5.0mg/L ΝΑΑ+0.1?1.0mg/L6-BA+0.5 ?lmg/L AC+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0011]上述步驟(3)所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+0.1?1.0mg/L 6 一 ΒΑ+0.1?1.0mg/LNAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0012]上述步驟(4)所述的生根培養(yǎng)基為:l/2MS+0.1?0.5mg/LNAA+15?30g/L蔗糖+3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是以暗紫貝母鱗片為外植體，通過外植體消毒、不定芽誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等過程獲得了暗紫貝母離體再植株，建立了有效的暗紫貝母組培快繁殖技術(shù)體系。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0015]實(shí)施例1
(I)外植體消毒:以暗紫貝母鱗莖為外植體，先75%乙醇浸泡15s，
無菌水沖洗3次，再用10%次氯酸鈉溶液浸泡20min，無菌水沖洗3次后備用。
[0016](2)誘導(dǎo)培養(yǎng):將步驟(I)處理好的暗紫貝母鱗莖切成0.5cm左右的切塊并接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。接種后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為ΙΟΟΟΙχ，置于培養(yǎng)溫度為25°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后誘導(dǎo)率達(dá)到85.7%。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+1.0mg/L NAA+0.lmg/L 6-BA+0.5mg/L AC+15g/L 蔗糖 +3.5g/L 瓊脂，pH 為
5.4。
[0017](3)增殖培養(yǎng):以步驟(2)誘導(dǎo)得到不定芽作為材料，將老化的和生長(zhǎng)不良的不定芽去掉，并將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的不定芽切成單芽并轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁。接種后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為20001x，置于培養(yǎng)溫度為25°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后增殖系數(shù)達(dá)到5.86。所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+0.lmg/L 6 一 BA+0.1mg/LNAA+15g/L 蔗糖 +3.5g/L 瓊脂，pH 為 5.4。
[0018](4)生根培養(yǎng):將經(jīng)步驟(3)后得到的生長(zhǎng)較一致且健壯的未生根的無菌苗單株切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)。接種后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為20001χ，置于培養(yǎng)溫度為25°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后生根率達(dá)到91.8%。所述的生根培養(yǎng)基為:l/2MS+0.lmg/LNAA+15g/L 蔗糖 +3.5g/L 瓊脂，pH 為 5.4。
[0019](5)煉苗移栽:將生根的無菌苗從培養(yǎng)室中取出放在室外煉苗30天后，再將生根苗從瓶中取出洗去基部的培養(yǎng)基，然后移栽到經(jīng)過高溫滅菌的基質(zhì)(泥炭土:珍珠巖:蛭石=3:1:1)中，定期澆澆1/2MS大量元素營(yíng)養(yǎng)液，覆蓋薄膜，10天后揭膜，揭膜后20天成活率達(dá)到93.4%。
[0020]實(shí)施例2
(I)外植體消毒:以暗紫貝母鱗莖為外植體，先75%乙醇浸泡25s， 無菌水沖洗5次，再用15%次氯酸鈉溶液浸泡25min，無菌水沖洗4次后備用。
[0021](2)誘導(dǎo)培養(yǎng):將步驟(I)處理好的暗紫貝母鱗莖切成0.5cm左右的切塊并接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。接種后置于每天光照13小時(shí)，光照強(qiáng)度為20001χ，置于培養(yǎng)溫度為27°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后誘導(dǎo)率達(dá)到93.7%。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+3.0mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L AC+25g/L 蔗糖 +3.5g/L 瓊脂，pH 為
5.4。
[0022](3)增殖培養(yǎng):以步驟(2)誘導(dǎo)得到不定芽作為材料，將老化的和生長(zhǎng)不良的不定芽去掉，并將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的不定芽切成單芽并轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁。接種后置于每天光照14小時(shí)，光照強(qiáng)度為30001χ，置于培養(yǎng)溫度為27°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后增殖系數(shù)達(dá)到6.92。所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+0.5mg/L 6 一 BA+0.2mg/LNAA+15g/L 蔗糖 +4.5g/L 瓊脂，pH 為 5.4。
[0023](4)生根培養(yǎng):將經(jīng)步驟(3)后得到的生長(zhǎng)較一致且健壯的未生根的無菌苗單株切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)。接種后置于每天光照13小時(shí)，光照強(qiáng)度為20001χ，置于培養(yǎng)溫度為25°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后生根率達(dá)到94.1%。所述的生根培養(yǎng)基為:l/2MS+0.3mg/LNAA+18g/L 蔗糖 +4.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4。
[0024](5)煉苗移栽:將生根的無菌苗從培養(yǎng)室中取出放在室外煉苗30天后，再將生根苗從瓶中取出洗去基部的培養(yǎng)基，然后移栽到經(jīng)過高溫滅菌的基質(zhì)(泥炭土:珍珠巖:蛭石=3:1:1)中，定期澆澆1/2MS大量元素營(yíng)養(yǎng)液，覆蓋薄膜，10天后揭膜，揭膜后20天成活率達(dá)到91.8%ο
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種暗紫貝母組織培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟: (1)外植體消毒:以暗紫貝母鱗莖為外植體，先75%乙醇浸泡15?30s， 無菌水沖洗3?5次，再用10%?20%次氯酸鈉溶液浸泡20?30min，無菌水沖洗3?.5次后備用； (2)誘導(dǎo)培養(yǎng):將步驟(I)處理好的暗紫貝母鱗莖切成0.5cm左右的切塊并接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為1000?20001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率； (3)增殖培養(yǎng):以步驟(2)誘導(dǎo)得到不定芽作為材料，將老化的和生長(zhǎng)不良的不定芽去掉，并將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的不定芽切成單芽并轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁，接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)增殖情況； (4)生根培養(yǎng):將經(jīng)步驟(3)后得到的生長(zhǎng)較一致且健壯的未生根的無菌苗單株切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)，接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001χ，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)生根情況； (5)煉苗移栽:將生根的無菌苗從培養(yǎng)室中取出放在室外煉苗30天后，再將生根苗從瓶中取出洗去基部的培養(yǎng)基，然后移栽到經(jīng)過高溫滅菌的基質(zhì)(泥炭土:珍珠巖:蛭石=.3:1:1)中，定期澆澆1/2MS大量元素營(yíng)養(yǎng)液，覆蓋薄膜，10天后揭膜，揭膜后20天統(tǒng)計(jì)成活率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種暗紫貝母組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(2)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+1.0 ?5.0mg/L ΝΑΑ+0.1 ?1.0mg/L 6-BA+0.5 ?lmg/L AC+15 ?30g/L 鹿糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種暗紫貝母組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(3)所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+0.1 ?1.0mg/L 6 — ΒΑ+0.1 ?1.0mg/LNAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L瓊脂，pH為5.4?5.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種暗紫貝母組織培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(4)所述的生根培養(yǎng)基為:l/2MS+0.1 ?0.5mg/LNAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?.5.8
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種暗紫貝母組織培養(yǎng)方法，暗紫貝母（Fritillaria unibracteata Hsiao）為百合科貝母屬藥用植物，以地下鱗莖入藥，具有清熱散結(jié)，化痰止咳等功效。因野生的暗紫貝母多生長(zhǎng)于海拔較高的地區(qū)，生長(zhǎng)期長(zhǎng)，資源缺乏。因而藥用暗紫貝母長(zhǎng)期存在著供不應(yīng)求的問題。本發(fā)明以暗紫貝母鱗片為外植體，通過外植體消毒、不定芽誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等過程獲得了暗紫貝母離體再植株，建立了有效的暗紫貝母組培快繁殖技術(shù)體系，短時(shí)期內(nèi)即可生產(chǎn)大量種苗，提高繁殖效率，降低生產(chǎn)成本，有利加快其繁育及推廣。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號(hào)】CN104782488
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510216173
【發(fā)明人】馮文杰
【申請(qǐng)人】馮文杰
【公開日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年5月2日