專利名稱：細(xì)胞色素p450單加氧酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通常使用重組DNA技術(shù)的植物中的遺傳工程，并且涉及參與含氰苷的生物合成的酶，特別是編碼這些酶的基因。根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)和基因能用來改善植物的營養(yǎng)價(jià)值或?qū)οx的抵抗力。
在超過2000種的植物中，含氰苷構(gòu)成了次級植物代謝物。在一些實(shí)例中它們是HCN的來源，如果作為食物被攝取則其會賦予植物毒性。例如，生氰作物木薯(Manihot esculenta)的塊莖構(gòu)成了熱帶地區(qū)的一種重要的食物。這些塊莖中存在的含氰苷可導(dǎo)致人的氰化物中毒，這是由于未充分處理的木薯產(chǎn)物引起的。其它植物種包括白三葉草(Trifoliumrepens)、高粱(雙色高粱(Sorghum bicolor))、亞麻(Linumusitatissimum)、海韭菜苷(Triglochin maritima)、利馬豆(棉豆(Phaseoluslunatus))、扁桃(扁桃屬(Amygdalus))以及杏(李屬(Prunns))、櫻桃和蘋果(Malus)的種子，其HCN的酶源產(chǎn)生說明了當(dāng)作為食物被過量攝取或用作動物飼料時其潛在的毒性。在這些植物中毒性特性能通過阻斷含氰苷的生物合成而降低。
天然發(fā)生的含氰苷的初級前體限于五種疏水性蛋白質(zhì)氨基酸纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸，以及一種單獨(dú)的非蛋白質(zhì)氨基酸，環(huán)戊烯甘氨酸。這些氨基酸在一系列反應(yīng)中轉(zhuǎn)化為氰醇，氰醇最終與糖殘基連接。例如，苦杏仁苷構(gòu)成O-β-龍膽二糖苷，野黑櫻苷構(gòu)成(R)-杏仁腈的O-β-葡糖苷。含有芳香族糖苷配基的含氰苷的另一個實(shí)例是含氰苷蜀黍苷和taxiphyllin的差向異構(gòu)體對，其分別見于高粱屬和紫杉屬中。例如對羥基杏仁腈被UDPG-糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化為蜀黍苷(β-D-吡喃葡糖基氧-(S)-對羥基杏仁腈)。相似的糖基轉(zhuǎn)移酶據(jù)認(rèn)為存在于大多數(shù)植物中。巢菜苷和路枯馬木苷是類似于苦杏仁苷的二糖衍生物的另外的例子。黑接骨木苷包含(S)-杏仁腈作為其糖苷配基，因此它是野黑櫻苷的差向異構(gòu)體。
含有脂族糖苷配基的含氰苷的實(shí)例是在三葉草、亞麻、木薯和豆類中發(fā)現(xiàn)的亞麻苦苷和百脈根苷。關(guān)于含氰苷及其生物合成的詳細(xì)評述見Conn，Naturwissenschaften 6628-34，1979，在此引入作為參考。
已廣泛研究了來源于酪氨酸的含氰苷蜀黍苷的生物合成途徑(Halkier等人，“含氰苷生物合成途徑與有關(guān)的酶系統(tǒng)”，在《生物學(xué)中的氰化物》(Cyanide compounds in biology)，Wiley Chichester(Ciba基金會140)，49-66頁，1988；Halkier和Moller，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)901552-1559，1989；Halkier等人，生物化學(xué)雜志(The J.of Biol.Chem.)26419487-19494，1989；Halkier和Moller，植物生理學(xué)9610-17，1990；Halkier和Moller，生物化學(xué)雜志26521114-21121，1990；Halkier等人，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88487-491，1991；Sibbesen等人，在《細(xì)胞色素P450的生物化學(xué)和生物物理學(xué)。結(jié)構(gòu)和功能、生物工程學(xué)和生態(tài)學(xué)方面》，Archakov，A.I.(編)，1991；Koch等人，第8屆國際細(xì)胞色素P450會議，摘要PII.053；以及Sibbesen等人，第8屆國際細(xì)胞色素P450會議，摘要PII.016)。L-酪氨酸被轉(zhuǎn)化為對羥基杏仁腈(蜀黍苷的前體)，N-羥基酪氨酸、N，N-二羥基酪氨酸、(E)-和(Z)-對羥苯基乙醛肟和對羥苯基乙腈是中間物。細(xì)胞色素P450型的兩種單加氧酶參與了該途徑。在木薯中，包括依賴細(xì)胞色素P450的單加氧酶的相似途徑用于分別從纈氨酸和異亮氨酸合成亞麻苦苷和百脈根苷(Koch等人，生物化學(xué)與生物物理學(xué)檔案(Archives of Biochemistry andBiophysics)，292141-150，1992)。業(yè)已證明，在雙色高粱中從L-酪氨酸到對羥基杏仁腈的復(fù)雜途徑僅需要兩種依賴細(xì)胞色素P450的多功能單加氧酶。第一種酶稱為P450TYR，將酪氨酸轉(zhuǎn)化為對羥基苯乙醛肟。第二種酶稱為P450OX，將醛肟轉(zhuǎn)化為對羥基杏仁腈。鑒于不同植物之間含氰苷生物合成途徑的相似性，通常假定該途徑包括兩種依賴P450的多功能單加氧酶，P450I和P450II，它們分別將前體氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醛肟，將醛肟轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的氰醇。P450I是一種特異酶，它決定底物特異性并因此決定產(chǎn)生的葡糖苷的類型，而預(yù)計(jì)P450II在將一系列結(jié)構(gòu)不同的醛肟轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的氰醇方面特異性較低。
芥子油苷是親水的、非揮發(fā)性的巰基糖苷，發(fā)現(xiàn)于雙子葉被子植物的幾個目中(Cronquist，《有花植物的進(jìn)化和分類》(The Evolution andClassification of Flowering Plants)，New York Botanical Garden，Bronx，1988)。含氰芥子油苷和葡糖苷的存在是互相排斥的。芥子油苷的最大經(jīng)濟(jì)意義是其存在于十字花科(Capparales的目)的所有成員中，該科的許多品種幾個世紀(jì)來為人類提供了佐料、調(diào)味品、色拉作物和蔬菜以及飼料作物的來源。最近，蕓苔(特別是Brassica napus和油菜(Brassicacampestris))已作為主要的商業(yè)油料籽出現(xiàn)。已知大約100種不同的芥子油苷具有相同的通式結(jié)構(gòu)，但其側(cè)鏈的性質(zhì)不同。芥子油苷是直接由蛋白質(zhì)氨基酸形成的，或是在單個或多個鏈延伸后形成的(Underhill等人，生物化學(xué)學(xué)會評論集(Biochem.Soc.Symp.)38303-326，1973)。已鑒定為含氰苷生物合成的中間物的N-羥基氨基酸和醛肟，也用作芥子油苷生物合成的有效前體(Kindl等人，植物化學(xué)(Phytochemistry)7745-756，1968；Matsuo等人，植物化學(xué)11697-701，1972；Underhill，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)261-63，1967)。參與含氰苷合成的細(xì)胞色素P450I因此在功能上非常類似于芥子油苷合成中相應(yīng)的生物合成酶，由此預(yù)計(jì)它是P450酶相同家族的一個成員。我們從白芥子(Sinapisalba)中分離了編碼P450酶(SEQ ID NO17)的cDNA克隆，該酶與P450TYR(CYP79)有54％的同一性，催化芥子油苷生物合成的第一步，即由親代氨基酸形成醛肟。該cDNA克隆顯示與芥(Aribidopsis)EST序列(T42902)有大約90％的同一性，這有力地表明該細(xì)胞色素P450酶在含芥子油苷的物種中高度保守。
上述氰醇的復(fù)雜生物合成途徑對僅僅兩種酶細(xì)胞色素P450I和P450II的催化活性的降低，可用于對植物中含氰苷生物合成途徑的操作。通過編碼一種或兩種單加氧酶的基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染，能修改、重建或新建含氰苷的生物合成途徑。
通過本領(lǐng)域已知的方法對植物中含氰苷生物合成途徑的修改或引入該途徑是非常有意義的，因?yàn)楹柢諏ハx、蜱螨和線蟲有毒。因此，植物中或某些植物組織中含氰苷生物合成途徑的修改、引入或重建將使植物對于昆蟲、蜱螨和線蟲來說不好吃，于是有助于減少害蟲對作物的損害。與其它殺蟲劑成分如蘇云金芽孢桿菌內(nèi)毒素結(jié)合，甚至可進(jìn)一步減少害蟲對作物的損害。
另外，能使用編碼根據(jù)本發(fā)明的單加氧酶的基因序列設(shè)計(jì)DNA質(zhì)粒，該質(zhì)粒一旦轉(zhuǎn)染至含有含氰苷的植物如木薯、高粱或大麥中，即可消除在野生型植物中正常產(chǎn)生的含氰苷。這可通過反義或有義RNA或核酶的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)，如EP-458367-A1、EP-240208-A2、US-5,231,020、WO 89/05852和WO 90/11682中所述，這抑制根據(jù)本發(fā)明的單加氧酶的表達(dá)。這是非常有意義的，因?yàn)楸M管進(jìn)行了許多努力，但仍不可能通過傳統(tǒng)的植物培育從例如木薯或高粱中完全去除含氰苷。另一方面，已顯示大麥品種的表皮細(xì)胞中含氰苷量的升高賦予對霉菌禾白粉菌(Erysiphegraminis)攻擊的敏感性增強(qiáng)(Pourmohensi，博士論文，Gottingen，1989；Ibenthal等人，應(yīng)用植物學(xué)(Angew.Bot.)6797-106，1993)。在被真菌Microcyclus ulei攻擊后的生氰橡膠樹Hevea brasiliensis中(Lieberei等人，植物生理學(xué)903-36，1989)和被亞麻刺盤孢(Colletotrichum lini)攻擊的亞麻中(Ludtke等人，Biochem.Z.324433-442，1953)觀察到相似的作用。在這些例子中，上述植物和其它植物的定量抗性能通過阻止含氰苷在這些植物中的產(chǎn)生而提高，其中含氰苷增強(qiáng)對微生物攻擊的敏感性。在大麥中，含氰苷位于表皮細(xì)胞中。因此反義、有義或核酶構(gòu)建體的表達(dá)優(yōu)選地(但不是必須)由表皮特異的啟動子所控制。
植物中甚至較少量含氰苷的存在也可引起營養(yǎng)問題，這是由于不希望的致癌物的產(chǎn)生引起的，如在大麥中所示。例如大麥麥芽包含少量的含氰苷epiheterodendrin，其在產(chǎn)生基于谷物的酒精過程中可轉(zhuǎn)化為據(jù)認(rèn)為是致癌物的氨基甲酸乙酯。正在進(jìn)行嘗試以提出氨基甲酸乙酯在發(fā)酵的食品、飲料和酒精中的強(qiáng)制最大允許濃度(食品化學(xué)新聞(Food ChemicalNews) 2933.35，1988)。
WO 95/16041描述了一種編碼細(xì)胞色素P450I單加氧酶的DNA分子，該酶催化氨基酸向相應(yīng)的N-羥基氨基酸、N，N-二羥基氨基酸的轉(zhuǎn)化，以及N，N-二羥基氨基酸向相應(yīng)的醛肟的轉(zhuǎn)化。親代氨基酸選自酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和環(huán)戊烯甘氨酸。該DNA分子對應(yīng)于天然發(fā)生的基因或其功能同源物，它們是突變、缺失、截短等的結(jié)果，但仍然編碼一種細(xì)胞色素P450I單加氧酶，該酶能催化含氰苷生物合成途徑中一種以上的反應(yīng)。單加氧酶優(yōu)選地包含單一的催化中心。
另外，WO 95/16041描述了編碼細(xì)胞色素P450II單加氧酶如雙色高粱的P450OX的DNA分子。它們催化醛肟向腈的轉(zhuǎn)化以及腈向相應(yīng)的氰醇的轉(zhuǎn)化。兩種多功能P450酶對酪氨酸轉(zhuǎn)化為對羥基苯乙腈的催化解釋了為什么此轉(zhuǎn)化中除(Z)-對羥基苯乙醛肟之外的所有中間物都是有溝的(channell)。
為了P450OX的分離而提出的策略基于用于從高粱中分離P450TYR(CYP79，Sibbesen等人，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)919740-9744，1994)的策略。在此方法中，DEAE Sepharose離子交換柱用來結(jié)合P450酶，而樣品中的黃色素不結(jié)合。色素的去除具有雙重目的。這是P450酶與隨后的柱結(jié)合的前提，并且使P450的含量能夠通過光譜測定(一氧化碳和底物結(jié)合)估計(jì)。本發(fā)明證明P450OX與P450TYR相反，顯示對DEAE柱的低結(jié)合親和力，基本上回收于流過和洗滌級分中。為了從黃色素中分離P450OX活性，應(yīng)用基于Triton X-114的相分配法。擇優(yōu)使用0.6-1％的Triton X-114，發(fā)現(xiàn)P450OX分配至全部兩相中，這與P450TYR相反，P450TYR被回收于富含去污劑的上相中。通過將Triton X-114的濃度提高至6％，P450OX的大多數(shù)從缺乏去污劑的下相中回收，而黃色素存在于上相中。使用6％Triton X-114的一個缺點(diǎn)是增強(qiáng)了P450OX向其變性形式P420的轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明中使用此知識第一次純化了P450II單加氧酶如P450OX，克隆編碼該單加氧酶的基因，并用編碼單加氧酶的基因穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化植物。P450OX的分離和部分氨基酸序列的測定可用于設(shè)計(jì)寡核苷酸探針和編碼P450OX的cDNA的分離。然而，在本案中，克隆是通過獨(dú)立的方法完成。
本發(fā)明主要涉及編碼細(xì)胞色素P450II單加氧酶的DNA分子，該酶催化醛肟向腈的轉(zhuǎn)化以及該腈向相應(yīng)的氰醇的轉(zhuǎn)化。優(yōu)選地醛肟是一種氨基酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，所述氨基酸選自酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和環(huán)戊烯甘氨酸，或者選自L-酪氨酸、L-纈氨酸和L-異亮氨酸，這種轉(zhuǎn)化如WO 95/16041所述由P450I單加氧酶催化。根據(jù)本發(fā)明的DNA分子對應(yīng)于天然發(fā)生的基因或其同源物，它們是突變、缺失、截短等的結(jié)果，但仍編碼一種細(xì)胞色素P450II單加氧酶，該酶催化醛肟向腈的轉(zhuǎn)化以及隨后該腈向相應(yīng)的氰醇的轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明的單加氧酶催化含氰苷生物合成途徑中一種以上的反應(yīng)，優(yōu)選地其包含單一的催化中心。
細(xì)胞色素P450II酶可存在于大多數(shù)活生物體中。根據(jù)本發(fā)明的編碼P450II單加氧酶的DNA分子在結(jié)構(gòu)上和功能上類似于可從產(chǎn)生含氰苷的多種植物中獲得的DNA分子。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA分子可與具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的DNA分子片段雜交。該片段超過10個核苷酸長，優(yōu)選地超過15、20、25、30或50個核苷酸。影響雜交種穩(wěn)定性的因素決定雜交條件的嚴(yán)格性，并能根據(jù)形成的雜交種的解鏈溫度Tm來測定。在幾種教科書中描述了Tm的計(jì)算。例如Keller等人在《DNA探針背景、應(yīng)用、方法》，Macmillan出版有限公司，1993，第8-10頁中描述了對于在雜交反應(yīng)Tm值計(jì)算中應(yīng)考慮的因素。根據(jù)本發(fā)明的DNA分子與SEQ ID NO1的片段在低于形成雜交種的計(jì)算值Tm30℃的溫度下雜交。優(yōu)選地它們在低于計(jì)算值Tm25、20、15、10或5℃的溫度下雜交。
為了使用重組DNA技術(shù)進(jìn)行基因操作，根據(jù)本發(fā)明的DNA分子除編碼單加氧酶的基因外，可包含允許本發(fā)明的DNA在微生物例如大腸桿菌、芽胞桿菌(Bacillus)、農(nóng)桿菌(Agrobacterium)、鏈霉菌(Streptomyces)或酵母中復(fù)制和選擇的DNA。它也可包含允許單加氧酶基因在同種或異種植物中表達(dá)和選擇的DNA。這樣的序列包含但不限于如WO93/07278所述其密碼子的使用適合于異種植物的密碼子使用的基因；賦予對新霉素、卡那霉素、氨甲喋呤、潮霉素、博來霉素、鏈霉素或慶大霉素、氨乙基半胱氨酸、glyophosphate、磺酰脲或膦絲菌素的抗性的基因；可評價(jià)的標(biāo)記基因如半乳糖苷酶；其天然啟動子和轉(zhuǎn)錄終止信號；啟動子元件如35S和19S CaMV啟動子，或組織特異的植物啟動子，如對根(如EP-452269-A2、WO91/13992、US-5,023,179所述)、對綠葉如玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)、對髓或花粉(如WO93/07278所述)特異的啟動子，或者誘導(dǎo)型植物啟動子(EP-332104)；以及異源轉(zhuǎn)錄終止信號。
本發(fā)明也涉及P450II單加氧酶，它催化醛肟向腈的轉(zhuǎn)化以及該腈向相應(yīng)的氰醇的轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，純化單加氧酶，并能用其建立與該單加氧酶特異結(jié)合的單克隆或多克隆抗體。尤其是從雙色高粱中分離經(jīng)SDS-PAGE測定分子量為55kD的細(xì)胞色素P450OX。其氨基酸序列在SEQ ID NO2中給出。
P450OX的催化特性類似于報(bào)道的大鼠肝微粒體中細(xì)胞色素P450活性(DeMaster等人，有機(jī)化學(xué)雜志(J.Org.Chem.)5074-5075，1992)。細(xì)胞色素P450OX和屬于細(xì)胞色素P450OX家族的其它成員的一個特征是，醛肟脫水為相應(yīng)的腈依賴于NADPH的存在，但是在某些情況下這種依賴性可通過連二亞硫酸鈉或其它還原劑的加入而克服。
在細(xì)胞色素P450酶的所有已知序列中，細(xì)胞色素P450OX顯示與鱷梨酶CYP71A1有最高的氨基酸序列同一性(44％)，與CYP71家族的所有其它成員有低于40％的同一性。鱷梨不產(chǎn)生含氰苷，CYP71A1不催化醛肟向腈的轉(zhuǎn)化以及該腈向相應(yīng)的氰醇的轉(zhuǎn)化。因此，根據(jù)本發(fā)明能定義細(xì)胞色素P450II單加氧酶的家族，其成員催化醛肟向相應(yīng)的氰醇的轉(zhuǎn)化，并且與細(xì)胞色素P450OX有40％或更高的氨基酸序列同一性。優(yōu)選地與細(xì)胞色素P450OX的氨基酸序列同一性高于50％或高于55％。
有人建議將P450OX指派為新CYP71亞家族(CYP71E1)的第一種成員，因?yàn)樗谙到y(tǒng)樹中與其它CYP71序列聚簇，系統(tǒng)樹是多序列對比的圖形輸出結(jié)果。通常，根據(jù)命名委員會，對于將細(xì)胞色素P450分配于新的CYP家族需要在氨基酸水平上低于40％的序列同一性，且超過55％相同的序列則分配于相同的亞家族。當(dāng)進(jìn)行多序列比較時，不僅要考慮序列同一性，而且要考慮序列相似性，如單個氨基酸的相同凈電荷或相似的疏水性/親水性。在這種比較中，P450OX與其它CYP71序列聚簇，因此應(yīng)當(dāng)屬于CYP71家族，盡管事實(shí)表明除來源于鱷梨的CYP71A1外，它與CYP71家族的所有其它成員顯示低于40％的同一性。由于它顯示與其它成員的低序列同一性，所以應(yīng)當(dāng)被分配于一個新的亞家族。其它的CYP71家族成員全部來源于非生氰種，其功能還不清楚。以前鑒定的屬于CYP71家族的P450的催化特性仍難以搞清。據(jù)認(rèn)為它們參與了萜羥化。它們中沒有一個被認(rèn)為利用肟作為底物，也不能多功能地將醛肟轉(zhuǎn)化為腈和氰醇。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方案見于編碼細(xì)胞色素P450II單加氧酶的cDNA的制備方法，該酶催化醛肟向腈的轉(zhuǎn)化以及該腈向相應(yīng)的氰醇的轉(zhuǎn)化。它包括(a)從產(chǎn)生含氰苷的植物組織中分離和溶解微粒體，(b)純化細(xì)胞色素P450單加氧酶，(c)產(chǎn)生抗純化的單加氧酶的抗體，(d)用該抗體探查產(chǎn)生含氰苷的植物組織的cDNA表達(dá)文庫，(e)分離表達(dá)該單加氧酶的克隆。
微粒體能從植物組織中分離，這些植物組織顯示擔(dān)負(fù)含氰苷生物合成的酶系統(tǒng)的高活性。這些組織可隨植物種而不同。微粒體的一種優(yōu)選的來源是新分離的苗，這些苗在萌發(fā)后1-20天、優(yōu)選地2-10天、最優(yōu)選地2-4天收獲。產(chǎn)生含氰苷的植物的黃化幼苗是優(yōu)選的，但也可使用光生長的幼苗。分離后，將微粒體溶解于含一種或多種去污劑的緩沖液中。優(yōu)選的去污劑是RENEX 690(J.Lorentzen A/S，Kvistgard，丹麥)、還原的Triton X-100(RTX-100)、Triton X-114和CHAPS。
可使用蛋白質(zhì)純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化細(xì)胞色素P450單加氧酶，如超速離心、分級沉淀、透析、SDS-PAGE和柱層析?？赡艿闹ǖ幌抻陔x子交換柱如DEAE Sepharose、活性染料柱如Cibacron yellow 3瓊脂糖、Cibacron blue瓊脂糖和活性紅120瓊脂糖，以及凝膠過濾柱如Sephacryl S-1000。單個級分的細(xì)胞色素P450含量能從一氧化碳差示光譜中測定。P450OX分離過程中一個特別的困難是，在最初的純化步驟中它不是與離子交換柱相結(jié)合而是與黃色素共遷移，這也使P450OX的定量變得困難，而離子交換柱通常用于P450酶如P450TYR的純化。黃色素的存在阻止P450OX與許多不同柱材料的結(jié)合，于是構(gòu)成了進(jìn)一步純化的主要障礙。然而，能通過溫度誘導(dǎo)的Triton X-114相分配實(shí)現(xiàn)P450OX從黃色素中的分離。就P450OX的回收和色素的去除而言可通過提高Triton X-114的量優(yōu)化該方法。在Triton X-114達(dá)6％時，大約80％的P450OX活性分配至澄清的下相中，6％是用于其它P450的水平的六到十倍。在此純化步驟中除了黃色素的去除還實(shí)現(xiàn)了小量純化。然而，將含P450OX的下相加于Cibacron blue染料柱時，鹽梯度洗脫產(chǎn)生幾乎均一的P450OX，正如由主要考馬斯染色帶的存在所判斷的，在通過重建顯示P450OX活性的級分中它具有55kDa的表觀分子量。
分離的P450OX產(chǎn)生一種一氧化碳光譜，在450nm處有一個吸收峰，但相對較大部分的分離酶以變性的P420形式存在。P450OX向變性P420形式的連續(xù)轉(zhuǎn)化妨礙了在分離方法的不同步驟中對P450OX的總含量和比活性的定量測定。另外，P450OX的比活性取決于所用的不同去污劑發(fā)揮的抑制作用。于是認(rèn)為級分的總P450含量是半定量的。
能用純化的蛋白質(zhì)在例如小鼠、山羊、綿羊、兔或雞中經(jīng)注射后產(chǎn)生抗體。將5-50μg蛋白質(zhì)以約14天的間隔注射數(shù)次。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，12-20μg蛋白質(zhì)以14天的間隔注射2-6次?？稍谟谢驘o佐劑的情況下進(jìn)行注射。免疫球蛋白從抗血清中純化，脾能用于雜交瘤融合，如Harlow和Lane，《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊》，Cold Spring HarborLaboratory Cold Spring Harbor，紐約，1988中所述，在此引入作為參考。與細(xì)胞，色素P450II單加氧酶特異結(jié)合的抗體也能用于植物培育，以檢測產(chǎn)生改變量的細(xì)胞色素P450單加氧酶從而得到產(chǎn)生改變量的含氰苷的植物。
植物組織cDNA文庫的制備方法在Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，紐約，1988中有廣泛描述，其中關(guān)于cDNA文庫制備的重要部分在此引入作為參考。從顯示擔(dān)負(fù)含氰苷生物合成的酶系統(tǒng)的高活性植物組織中分離polyA+RNA。這些組織可隨植物種而不同。用于polyA+RNA分離的一種優(yōu)選的組織是新分離的苗組織，這些苗在萌發(fā)后1-20天、優(yōu)選地2-10天、最優(yōu)選地2-4天收獲。能用特異結(jié)合細(xì)胞色素P450II單加氧酶的抗體探查獲得的cDNA文庫，并能分離表達(dá)該單加氧酶的克隆。
制備編碼細(xì)胞色素P450II單加氧酶的cDNA的一種備擇方法包括(a)從產(chǎn)生含氰苷的植物組織中分離和溶解微粒體，(b)純化細(xì)胞色素P450II單加氧酶，(c)獲得該單加氧酶的完全或部分蛋白質(zhì)序列，(d)設(shè)計(jì)指定DNA的寡核苷酸，其中DNA編碼所述單加氧酶蛋白質(zhì)序列的4-15個氨基酸，(e)用該寡核苷酸、或者用該寡核苷酸由cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增所獲得的DNA分子探查產(chǎn)生含氰苷的植物組織的cDNA文庫，以及(f)分離編碼細(xì)胞色素P450II單加氧酶的克隆。
內(nèi)肽是蛋白酶消化的結(jié)果，其氨基酸序列能通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如Edman降解法獲得。根據(jù)遺傳密碼通過蛋白質(zhì)序列部分的反向翻譯可獲得指定DNA的寡核苷酸，其中DNA編碼本發(fā)明的單加氧酶的部分蛋白質(zhì)序列。對于反向翻譯，低簡并性的DNA序列所編碼的蛋白質(zhì)序列是優(yōu)選的。其長度為4-15個、優(yōu)選地5-10個氨基酸。如必要時，寡核苷酸中使用的密碼子能適合植物來源的密碼子習(xí)慣(Murray等人，核酸研究(Nucleic AcidsResearch)17477-498，1989)。如Sambrook等人(《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)所述，能用獲得的寡核苷酸探查cDNA文庫，以得到能與該寡核苷酸堿基配對的克隆。另外，寡核苷酸能用于聚合酶鏈反應(yīng)，其方法學(xué)在本領(lǐng)域中已知，以植物cDNA作為擴(kuò)增的模板。在本案中，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物被用來探查cDNA文庫。分離編碼細(xì)胞色素P450II單加氧酶的克隆。
克隆基因的一種備擇方法基于由表達(dá)載體構(gòu)成的基因文庫的構(gòu)建。類似于以上已描述的方法，在此方法中，首先從能表達(dá)P450II單加氧酶的細(xì)胞或組織中分離基因組DNA、但優(yōu)選地是cDNA，然后剪接至合適的表達(dá)載體。然后使用適當(dāng)?shù)姆椒?、?yōu)選地用抗體篩查如此產(chǎn)生的基因文庫。篩選出含有所希望的基因或者至少此基因的一部分作為插入片段的克隆。
另外，能獲得編碼細(xì)胞色素P450單加氧酶的cDNA分子，該酶催化醛肟向腈的轉(zhuǎn)化以及該腈向相應(yīng)的氰醇的轉(zhuǎn)化，此方法包括(a)設(shè)計(jì)覆蓋A型細(xì)胞色素保守區(qū)3-10個氨基酸的簡并寡核苷酸，(b)使用簡并寡核苷酸通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增一種或多種細(xì)胞色素特異的DNA片段，(c)用細(xì)胞色素特異的片段篩查cDNA文庫，獲得全長的cDNA，(d)在微生物宿主中表達(dá)全長的cDNA，(e)鑒定表達(dá)細(xì)胞色素P450單加氧酶的宿主，該酶催化醛肟向腈的轉(zhuǎn)化及該腈向相應(yīng)的氰醇的轉(zhuǎn)化，以及(f)從該宿主中純化克隆的DNA。
從DNA文庫、優(yōu)選地從cDNA文庫中獲得的總DNA可在PCR反應(yīng)中用作模板，采用一種或多種代表A型細(xì)胞色素保守區(qū)的引物(Durst等人，藥物代謝與藥物相互作用(Drug Metabolism and Drug Interactions)12189-206，1995)，A型細(xì)胞色素?fù)?jù)信來源于共同的植物細(xì)胞色素P450祖先。根據(jù)A型細(xì)胞色素P450的多序列對比，能定義氨基酸水平上的三個高度保守區(qū)1區(qū)(V/I)KEX(L/F)R，2區(qū)FXPERF和3區(qū)PFGXGRRXCXG。能設(shè)計(jì)含有簡并肌苷(I)的引物，每條引物分別覆蓋兩個區(qū)的3-10個、優(yōu)選地約5或6個氨基酸。PCR進(jìn)行例如連續(xù)三輪。第1輪使用覆蓋共有區(qū)FXPERF的引物和覆蓋文庫載體中T7啟動子的標(biāo)準(zhǔn)T7引物，擴(kuò)增來源于編碼A型細(xì)胞色素P450的mRNA的cDNA。PCR的第2輪使用覆蓋兩個共有區(qū)的引物，以第1輪擴(kuò)增的DNA作為模板，優(yōu)先擴(kuò)增一個100bp的片段，然后將其連接至pBluescript并測序。根據(jù)獲得的DNA序列設(shè)計(jì)基因特異的引物。將其同與polyA尾互補(bǔ)的引物(引物dT+V)結(jié)合用于第3輪中，以PCR第1輪的DNA作為模板，擴(kuò)增一個大約500bp的DNA片段，該片段能用作基因特異的探針分離全長的cDNA。該P(yáng)CR方法不只用于P450OX的分離，對于A型細(xì)胞色素P450的分離是通用的。所獲得的A型細(xì)胞色素P450需要被異源表達(dá)以確定其功能。
如上所述制備的cDNA克隆或PCR產(chǎn)物或其片段可作為雜交探針，用于從同種或異種來源的生物如真菌或異種植物中進(jìn)一步鑒定DNA序列的方法中，該DNA序列編碼顯示P450II單加氧酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。一種合適的來源是含有含氰苷的植物的組織。
所述克隆或PCR產(chǎn)物也可作為RFLP標(biāo)記，用來確定如細(xì)胞色素P450單加氧酶基因的位置或植物基因組中緊密相關(guān)的性狀或用于標(biāo)記輔助的培育(EP-A306139；WO 89/07647)。
使用上述方法，能分離編碼P450II單加氧酶的多種基因。所述基因能在產(chǎn)生純化的重組細(xì)胞色素P450II單加氧酶的方法中使用，該酶催化醛肟向腈的轉(zhuǎn)化以及該腈向相應(yīng)的氰醇的轉(zhuǎn)化；該方法包括(a)人工改造編碼該單加氧酶的基因，使其可在宿主生物如細(xì)菌、酵母或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，(b)用經(jīng)改造的基因轉(zhuǎn)化該宿主生物，以及(c)從宿主生物或培養(yǎng)上清液中分離蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，用該方法獲得純化的重組細(xì)胞色素P450OX，或獲得通過基因工程的已知技術(shù)修飾的細(xì)胞色素P450OX。優(yōu)選地，這種修飾導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)或?qū)е碌孜锾禺愋愿淖儭?br> 能使用本發(fā)明的DNA分子獲得抵抗昆蟲或蜱螨的轉(zhuǎn)基因植物。具體實(shí)施方案列于但不限于WO 95/16041的表B(45頁)中，以及以下所述對于線蟲的實(shí)施方案。只是為了方便，本說明書中不再重復(fù)該表，但有意在此引入以參考WO 95/16041的公開內(nèi)容。優(yōu)選地轉(zhuǎn)基因植物可抵抗鞘翅目(Coleoptera)和鱗翅目(Lepidoptera)，如西方玉米根蟲(Diabroticavirgifera virgifera)、北方玉米根蟲(Diabrotica longicornis barberi)、南方玉米根蟲(Diabrotica undecimpunctata howardi)、棉花棉鈴蟲、歐洲玉米鉆蛀蟲、玉米根網(wǎng)蟲(webworm)、棉紅鈴蟲和煙草蚜蟲。
線蟲是植物的主要動物寄生蟲，它每年導(dǎo)致全球農(nóng)業(yè)估計(jì)大于十億美元的損失。某些線蟲誘導(dǎo)參與飼養(yǎng)部位的植物細(xì)胞修飾，并在一個部位飼養(yǎng)幾個小時或更多。它們包括根結(jié)線蟲(Meloidogyne)、球胞囊線蟲(Globodera)、異皮線蟲(Heterodera)、腎形線蟲(Rotylenchulus)、麥線蟲(Tylenchulus)、珍珠線蟲(Nacobbus)、劍線蟲屬(Xiphinema)、長針線蟲(Longidorus)、異長針線蟲(Paralongidorus)、隱皮線蟲(Cryphodera)、營養(yǎng)麥線蟲(Trophotylenchulus)、鞘線蟲(Hemicycliophora)、小環(huán)線蟲(Criconemella)、標(biāo)矛線蟲(Verutus)和Heliocotylenchus等屬的種。被認(rèn)為在一個部位飼養(yǎng)更有限時間的屬包括短體線蟲(Pratylenchus)、穿孔線蟲(Radopholus)、潛根線蟲(Hirschmanniella)、毛刺線蟲(Trichodorus)、類毛刺線蟲(Paratrichodorus)、莖線蟲(Ditylenchus)、滑刀線蟲(Aphelenchoides)、Scutellonema和刺線蟲(Belonolaimus)等屬。
轉(zhuǎn)基因植物包含編碼新單加氧酶的DNA，該酶催化醛肟向腈的轉(zhuǎn)化以及腈向相應(yīng)的氰醇的轉(zhuǎn)化。另外轉(zhuǎn)基因植物可包含與除草劑抗性基因遺傳連鎖的單加氧酶基因。轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選地是單子葉或雙子葉植物。WO 95/16041的表A(33-44頁)中列出了具體實(shí)施方案。只是為了方便，本說明書中不再重復(fù)該表，但有意在此引入以參考WO 95/16041的公開內(nèi)容。它們優(yōu)選地選自玉米、稻、小麥、大麥、高粱、棉花、大豆、向日葵、草、油料籽油菜、甜菜、嫩莖花椰菜、花椰菜、卷心菜、黃瓜、甜玉米、日本蘿卜、畢那棉(benas)、萵苣、甜瓜、胡椒、南瓜、番茄和西瓜。獲得這些植物的方法包括(a)將DNA引入能再生為完整植物的植物細(xì)胞或植物組織中，該DNA包含可在此植物中表達(dá)的、編碼本發(fā)明的單加氧酶的基因，以及(b)篩選轉(zhuǎn)基因植物。
同樣，能使用本發(fā)明的DNA分子獲得轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)針對內(nèi)源P450II單加氧酶基因的反義或有義RNA或核酶。轉(zhuǎn)基因植物中這些分子的表達(dá)降低了細(xì)胞色素P450II單加氧酶的表達(dá)。由于含氰苷表達(dá)的降低，這些植物顯示改善的疾病抵抗力或營養(yǎng)價(jià)值。獲得這些植物的方法包括(a)將編碼有義RNA、反義RNA或核酶的DNA引入能再生為完整植物的植物細(xì)胞或組織中，該DNA的表達(dá)降低了細(xì)胞色素P450II單加氧酶的表達(dá)，以及(b)篩選轉(zhuǎn)基因植物。
許多非常有效的方法可用于將DNA引入植物細(xì)胞中，這些方法基于基因轉(zhuǎn)移載體的應(yīng)用或基于直接基因轉(zhuǎn)移方法。
將基因構(gòu)建體插入細(xì)胞的一種可能的方法是利用以該基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)和/或毛根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物細(xì)胞。然后在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，以使其形成苗和根，最終形成整個植物。
使用農(nóng)桿菌的所謂葉盤(leaf disk)轉(zhuǎn)化屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)(Horsch等人，科學(xué)(Science)2271229-1231，1985)。將合適的靶植物的無菌葉盤與包含一種根據(jù)本發(fā)明的嵌合基因構(gòu)建體的農(nóng)桿菌細(xì)胞一起溫育，然后轉(zhuǎn)移至合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基之中或之上。在本發(fā)明的范圍之內(nèi)特別合適的、因而優(yōu)選的是LS培養(yǎng)基，它通過瓊脂的加入而固化，并且富含一種或多種通常使用的植物生長調(diào)節(jié)劑，尤其是選自包括α-萘乙酸、落葉素、2，4，5-三氯苯氧乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-琥珀酸、吲哚-3-乙酸和對氯苯氧乙酸的生長素，以及選自包括細(xì)胞分裂素、6-芐基腺嘌呤、2-異戊烯基腺嘌呤和玉米素的細(xì)胞分裂素。生長素和細(xì)胞分裂素的優(yōu)選濃度范圍是0.1mg/l-10mg/l。
于20℃-40℃、優(yōu)選地23℃-35℃、最優(yōu)選地于25℃的溫度下在漫射光中溫育數(shù)天后，優(yōu)選地溫育2-3天后，將葉盤轉(zhuǎn)移至合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行苗誘導(dǎo)。對于轉(zhuǎn)化體的篩選LS培養(yǎng)基是特別優(yōu)選的，它不含生長素但含有細(xì)胞分裂素，并且其中加入了選擇性底物。將培養(yǎng)物置于光下，以適當(dāng)?shù)拈g隔、優(yōu)選地以一周的間隔轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中。切下發(fā)育的綠苗，在誘導(dǎo)幼苗形成根的培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)LS培養(yǎng)基是特別優(yōu)選的，它不含生長素或細(xì)胞分裂素，但其中加入了選擇性底物用于轉(zhuǎn)化體的選擇。
除農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化外，在本發(fā)明的范圍內(nèi)能使用直接轉(zhuǎn)化法用于將根據(jù)本發(fā)明的基因構(gòu)建體插入植物材料中。
例如，能將載體中含有的遺傳物質(zhì)直接插入植物細(xì)胞中，例如使用純粹的物理方法，如應(yīng)用精細(xì)拉制成的微量加液器的顯微注射(Neuhaus等人，理論與應(yīng)用遺傳學(xué)(Theoretical and Applied Genetics)74363-373，1987)、電穿孔(D’Halluin等人，植物細(xì)胞(The Plant Cell)41495-1505，1992；WO92/09696)，或者優(yōu)選地用轉(zhuǎn)化DNA包被的微粒轟擊細(xì)胞(“微粒轟擊”；Wang等人，植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)11433-439，1988；Gordon-Kamm等人，植物細(xì)胞2603-618，1990；McCabe等人，生物工程學(xué)(Bio/Technology)11596-598，1993；Christou等人，植物生理學(xué)(Plant Physiol)87671-674，1988；Koziel等人，生物工程學(xué)11194-200，1993)。此外，待轉(zhuǎn)化的植物材料可任選地用滲透活性底物如蔗糖、山梨糖醇、聚乙二醇、葡萄糖或甘露醇預(yù)處理。
用于遺傳物質(zhì)向植物細(xì)胞中直接轉(zhuǎn)移的其它可能的方法包括用修飾質(zhì)膜的方法處理原生質(zhì)體，例如聚乙二醇處理、熱休克處理或電穿孔，或這些方法的結(jié)合(Shillito等人，生物工程學(xué)31099-1103，1985)。
Negrutiu等人，植物分子生物學(xué)8363-373，1987中描述了將遺傳物質(zhì)直接引入植物細(xì)胞的另一種方法，這種方法基于純粹的化學(xué)方法，它使轉(zhuǎn)化能非常有效和快速地進(jìn)行。
應(yīng)用共轉(zhuǎn)化的直接基因轉(zhuǎn)移(Schocher等人，生物工程學(xué)41093-1096，1986)也適用于植物材料的轉(zhuǎn)化。
上述以舉例方式給出的可能的轉(zhuǎn)化方法的列表，不是要求專利保護(hù)的全部，也不是為了以任何方式限制本發(fā)明的主題。
人工改造進(jìn)上述轉(zhuǎn)基因種子和植物中的遺傳特性通過有性繁殖或營養(yǎng)生長傳遞，因而能在子代植物中保持和繁殖。通常，這種保持和繁殖利用了為適應(yīng)特定目的而開發(fā)的已知農(nóng)業(yè)方法，如土壤耕作、播種或收獲。也能使用特殊的方法如水培或溫室技術(shù)。由于生長的作物對于昆蟲或感染引起的攻擊和損害以及對于雜草植物的競爭脆弱，所以采取措施控制雜草、植物疾病、昆蟲、線蟲或其它對提高產(chǎn)量不利的條件。這些措施包括機(jī)械措施，如土壤的耕作或雜草和染病植物的去除，以及農(nóng)用化學(xué)品如除草劑、殺真菌劑、殺配子劑、殺線蟲劑、生長調(diào)節(jié)劑、催熟劑和殺蟲劑的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物和種子的有利遺傳特性能進(jìn)一步在植物培育中使用，其目的是發(fā)展具有改善的特性的植物，這些特性如對害蟲、除草劑或逆境的抵抗力，改良的營養(yǎng)價(jià)值，提高的產(chǎn)量，或使倒伏和散落損失較小的改進(jìn)的結(jié)構(gòu)。多種培育步驟均以明確的人為干預(yù)為特征，如選擇要雜交的品系、引導(dǎo)親代系的授粉或篩選合適的子代植物。根據(jù)希望的特性采取不同的培育方法。相關(guān)技術(shù)在本領(lǐng)域中眾所周知，包括但不限于雜交、近交、回交、多系培育、品種融合、種間雜交、非整倍體技術(shù)等等。雜交技術(shù)也包括植物的不育化，以通過機(jī)械、化學(xué)或生物化學(xué)方法產(chǎn)生雄性或雌性不育植物。用不同系的花粉對雄性不育植物的異花授粉可確保雄性不育植物和雌性可育植物的基因組將一致獲得兩種親代系的特性。因此，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子和植物能用于改良的植物系的培育，例如它提高了常規(guī)方法如除草劑或殺蟲劑處理的有效性，或者由于其改進(jìn)的遺傳特性省卻了這些方法。另外，能獲得具有改進(jìn)的逆境抵抗力的新作物，由于其優(yōu)化的遺傳“裝備”，能產(chǎn)生高品質(zhì)的收獲產(chǎn)物，其品質(zhì)優(yōu)于不能抵抗類似的不利發(fā)育條件的產(chǎn)物。
在種子生產(chǎn)中，種子的萌發(fā)質(zhì)量和均勻性是重要的產(chǎn)品特征，而農(nóng)民收獲和出售的種子的萌發(fā)質(zhì)量和均勻性是不重要的。由于難以使作物不含其它作物和雜草種子，為了控制種子攜帶的疾病及產(chǎn)生良好萌發(fā)的種子，種子生產(chǎn)者已發(fā)展了十分廣泛和明確的種子生產(chǎn)方法，他們在純種的生長、調(diào)節(jié)和營銷領(lǐng)域中富有經(jīng)驗(yàn)。因此，購買滿足特定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的合格種子而不是使用從自己的作物中收獲的種子對于農(nóng)民來說是普通的習(xí)慣。用作種子的繁殖材料通常用保護(hù)劑涂層處理，保護(hù)劑涂層包括除草劑、殺蟲劑、殺真菌劑、殺細(xì)菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑或其混合物。通常使用的保護(hù)劑涂層包含如環(huán)己烯亞胺、萎銹靈、二硫四甲秋蘭姆(TMTD)、methalaxyl(Apron)和pirimiphosmethyl(Actellic)的化合物。如果希望，將這些化合物與另外通常應(yīng)用于制劑領(lǐng)域的載體、表面活性劑或應(yīng)用增強(qiáng)佐劑配制在一起，以提供對細(xì)菌、真菌或動物害蟲引起的損傷的保護(hù)?？赏ㄟ^用液體制劑浸滲繁殖材料或通過用組合的濕或干制劑包被來應(yīng)用保護(hù)劑涂層。其它應(yīng)用方法如在芽或果實(shí)上進(jìn)行處理也是可能的。
本發(fā)明的另一方面提供了新的農(nóng)業(yè)方法，如以上舉例說明的方法，其特征在于利用根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物材料或轉(zhuǎn)基因種子。
下列實(shí)施例進(jìn)一步描述了用于實(shí)施本發(fā)明的材料與方法，以及隨后的結(jié)果。它們以舉例方式給出，其敘述不應(yīng)被認(rèn)為是對要求保護(hù)的本發(fā)明的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1微粒體的制備除非另外說明，涉及微粒體制備的所有步驟都在4℃下進(jìn)行。所有緩沖液都通過在真空中攪拌除氣，并用氬沖洗。
使雙色高粱(雜交種SS1000，來源于AgriPro，Texas，美國)的種子在用紗布覆蓋的金屬篩上于28℃暗處萌發(fā)40小時。從大約3cm的黃化幼苗中制備微粒體。收獲幼苗，使用研缽和研杵將其在2倍體積(v/w)的250mM蔗糖、100mM N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸(pH7.9)、2mM EDTA和2mM DTT中勻漿化。在勻漿化前加入聚乙烯聚吡咯烷酮(0.1g/g鮮重)。勻漿通過22μM尼龍布過濾，以16500×g離心10分鐘。上清液以165000×g離心1小時。重懸浮微粒體沉淀，用裝備有聚四氟乙烯研杵的Potter-Elvehjem勻漿器在分離緩沖液中勻漿化。再次離心并再次勻漿化后，在液氮中冷凍勻漿，貯存于-80℃直到使用。實(shí)施例2酶測定總細(xì)胞色素P450的測定總細(xì)胞色素P450的定量測定通過差光譜法進(jìn)行，測定中對于還原的細(xì)胞色素P450與一氧化碳(A450-490)間的加合物使用91mM-1cm-1的消光系數(shù)(Omura等人，生物化學(xué)雜志2392370-2378，1964)。實(shí)施例3細(xì)胞色素P450OX的純化除非另外說明，涉及酶純化的所有步驟都在4℃下進(jìn)行。
緩沖液A緩沖液C8.9％甘油8.9％甘油10mM KH2PO4/K2HPO4(pH7.9) 40mM KH2PO4/K2HPO4(pH7.9)0.2mM EDTA 5.0mM EDTA2.0mM DTT2.0mM DTT1.0％(v/v)Renex 690 1.0％(w/v)CHAPS0.05％RTX-100在加入去污劑和DTT之前，通過在真空中攪拌將緩沖液除氣三次。每次除氣之間用氬沖洗緩沖液。在整個純化過程中監(jiān)測不同柱級分代謝放射性標(biāo)記的對羥基苯乙醛肟的能力，以鑒定級分中P450OX的存在。
用由8.9％甘油、10mM KH2PO4/K2HPO4(pH7.9)、0.2mM EDTA、2mM DTT組成的緩沖液將微粒體(20ml中400mg蛋白質(zhì))稀釋至100ml，隨后以恒定攪拌緩慢加入100ml的10mMKH2PO4/K2HPO4(pH7.9)、8.9％甘油、0.2mM EDTA、2mM DTT、0.1％RTX-100(v/v)、2％Renex。另外攪拌30分鐘，隨后以150000×g超速離心35分鐘后，以100ml/小時的流速將大約190ml上清液加于用緩沖液A平衡的5×5cm DEAE Sepharose FF/S-100 Sepharose(20/80濕體積，Pharmacia)柱中。用S-100 Sepharose凝膠過濾材料以1∶4的比例稀釋DEAE Sepharose離子交換樹脂，以避免結(jié)合后太高的細(xì)胞色素P450酶濃度，這可導(dǎo)致不可逆的聚合。然后用150ml緩沖液A洗柱。P450OX較弱地結(jié)合于柱上，基本上回收于含黃色素的流過和洗滌級分中。根據(jù)其在420nm的吸光度、CO結(jié)合光譜和在重建實(shí)驗(yàn)中(見實(shí)施例4)代謝肟的能力鑒定含P450OX的級分，并合并(約200ml)。它們可用于進(jìn)一步純化或?qū)⑵鋬龃妗?br> 在恒定攪拌中通過逐滴加入適量的甘油和Triton X-114的混合物，將合并的P450OX級分調(diào)節(jié)至含30％(v/v)甘油和6％Triton X-114。繼續(xù)攪拌20分鐘，隨后于25℃以24500×g離心25分鐘，不開剎車(溫度誘導(dǎo)的Triton X-114相分配)。形成兩個相，黃色的上相和澄清的下相。合并含有細(xì)胞色素P450OX活性主要部分的下相，用緩沖液C稀釋2.5倍至約350ml，以70ml/小時的流速加于用緩沖液C平衡的1.9×5cm Cibacronblue 3GA-瓊脂糖柱中。用50ml緩沖液C洗柱，用緩沖液C中的約60ml0-1.5M KCl線性梯度洗脫保留的細(xì)胞色素P450OX。合并經(jīng)SDS-PAGE顯示在50-60kDa區(qū)存在單一的多肽帶的級分，在氮下對1升8.9％甘油、10mM KH2PO4/K2HPO4(pH7.9)、5mM EDTA、2mM DTT(透析緩沖液)透析24小時，以降低鹽和去污劑的含量。酶制劑在液氮中冷凍，貯存于-80℃。實(shí)施例4從高粱微粒體中分離獲得的細(xì)胞色素P450OX的表征4.1.分子量和氨基酸序列資料經(jīng)SDS-PAGE測定P450OX的分子量為55kD。從8-25％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上切下對應(yīng)于從Cibacron blue 3GA-瓊脂糖柱分離的P450OX的蛋白帶，電洗脫。根據(jù)生產(chǎn)廠商(Boehringer Mannheim)指示以約1∶100的蛋白酶與蛋白質(zhì)的重量比用內(nèi)切蛋白酶Glu-C(蛋白酶V8測序級，18小時，23℃)消化電洗脫的蛋白質(zhì)。電洗脫的蛋白質(zhì)和消化的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白質(zhì)和片段轉(zhuǎn)移至ProBlott膜(AppliedBiosystems)上。切下膜的考馬斯染色區(qū)，在裝備有聯(lián)機(jī)120A型乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸分析儀的Applied Biosystems 470A型序列分析儀上進(jìn)行N端氨基酸序列測定。
N端氨基酸序列測定產(chǎn)生兩個序列，由于相對豐度的不同它們可被獨(dú)立讀出。數(shù)據(jù)庫搜索(BLAST)顯示，序列-GLVKEGVDMEEGTL與大麥(Hordeum vulgare)液泡ATP酶B亞基的N端序列MGLVKEGADMEEGTL(保藏號L11862)僅單一位點(diǎn)不同。大麥B亞基具有54kDa(20)的預(yù)測分子量。Western印跡法進(jìn)一步證實(shí)了液泡ATP酶B亞基作為污染物在P450OX制劑中的存在，當(dāng)使用Heven Sze博士提供的燕麥根中產(chǎn)生的針對液泡ATP酶B亞基的單克隆抗體時，在55kDa處顯示單一條帶。通過在抗體包被的微量滴定孔中固定，能從P450OX制劑中去除B亞基。該方法允許P450OXN端氨基酸序列的明確測定，該序列為-ATTATPQLLGGSVPEQ，另外提供了一種內(nèi)部P450OX肽片段的序列，MDRLVADLDRAAA。去除殘余量的液泡ATP酶B亞基的嘗試導(dǎo)致一氧化碳差光譜的形成，其中代表P450OX的無活性變性P420形式的420nm成分大大增多，并且失去或顯著降低了在獲得的級分中重建P450OX活性的能力。這反映了P450OX內(nèi)在的不穩(wěn)定性。預(yù)期液泡ATP酶B亞基不具有與P450OX相關(guān)的任何催化特性。因此，B亞基作為污染物的存在在以下報(bào)告的P450OX代謝研究中可以接受。
N端序列--ATTATPQLLGGSVPEQ--(SEQ ID NO3)內(nèi)部序列--MDRLVADLDRAAA--(SEQ ID NO4)4.2.NADPH-P450氧化還原酶的分離NADPH-P450氧化還原酶與DEAE-Sepharose FF/S-100-Sepharose柱結(jié)合，用含0.5M KCl的增大緩沖液A洗脫。隨后如以前所述(Halkier和Moller，植物生理學(xué)9610-17，1990)在2’，5’-ADP-Sepharose 4B(Pharmacia)柱上將還原酶純化為同質(zhì)，并濃縮為約15單位/ml。4.3.可溶性UDPG葡糖基轉(zhuǎn)移酶的制備通過對微粒體制備中獲得的離心上清液的硫酸銨分部分離，部分純化葡糖基轉(zhuǎn)移酶。葡糖基轉(zhuǎn)移酶級分在40％-60％(NH4)2SO4間沉淀，將其溶解于5ml 50mM N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸(pH7.9)、2mM DTT中，并對2升相同緩沖液透析過夜。4.4.細(xì)胞色素P450OX活性的重建微粒體細(xì)胞色素P450酶活性重建的實(shí)現(xiàn)方法是，將細(xì)胞色素P450酶和相應(yīng)的NADPH細(xì)胞色素P450氧化還原酶插入脂微膠粒中。能使用脂的混合物，但對于細(xì)胞色素P450OX，雙月桂基磷脂酰膽堿(DLPC)提供最佳酶活性。正確形成的細(xì)胞色素P450OX與NADPH細(xì)胞色素P450氧化還原酶的復(fù)合體的數(shù)量是限速因素。使用過量的氧化還原酶和濃縮的酶溶液以確保足夠量的活性復(fù)合體。
使用下列組分獲得功能上重建的酶
在eppendorf管中將5μl脂懸液與5μl NADPH細(xì)胞色素P450氧化還原酶(0.075單位)、10μl細(xì)胞色素P450OX(約0.4pmol)溶液和0.5μl14C-肟(0.014μCi/μl，394mCi/mmol)混合。用50mM N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸(pH7.9)將終體積調(diào)節(jié)為30μl，通過加入1μl NADPH溶液起始酶反應(yīng)。反應(yīng)混合物中不加入NADPH細(xì)胞色素P450氧化還原酶或NADPH制備對照樣品。將管在恒定和輕微振蕩下于30℃溫育1小時。溫育后將反應(yīng)混合物加至二氧化硅包被的TLC片(硅膠60F254，Merck)上，用乙酸乙酯/甲苯(1∶5v/v)混合物作為流動相展開。將該片置于貯存磷篩上過夜，用Molecular Dynamics的STORM840磷成像儀使終產(chǎn)物對羥基苯乙腈和對羥基苯甲醛顯色。
當(dāng)重建入脂微膠粒中時，細(xì)胞色素P450OX催化對羥基苯乙醛肟向?qū)αu基杏仁腈的轉(zhuǎn)化，后者分解為對羥基苯甲醛和HCN。這證明細(xì)胞色素P450OX是一種多功能的蛋白質(zhì)，它催化對羥基苯乙醛肟向?qū)αu基苯乙腈的轉(zhuǎn)化，以及對羥基苯乙腈向?qū)αu基杏仁腈的轉(zhuǎn)化。P450OX的活性嚴(yán)格依賴于NADPH-P450氧化還原酶和NADPH的存在。連二亞硫酸鈉(10mM)不支持對羥基苯乙醛肟的代謝。重建之前省略酶的透析導(dǎo)致與對羥基苯甲醛相比對羥基苯乙腈積累的相對增加。4.5.蜀黍苷從其親代氨基酸酪氨酸合成的完整途徑的體外重建完全的反應(yīng)混合物包含3μl分離的重組P450TYR(6pmol，在大腸桿菌中異源表達(dá)并分離，如Halkier等人，生物化學(xué)與生物物理學(xué)檔案322369-377，1995)、10μl分離并透析的P450OX(約0.4pmol)、5μlNADPH-P450氧化還原酶(0.075U)、1μl部分純化的來源于高粱的UDPG葡糖基轉(zhuǎn)移酶、5μl DLPC(10mg/ml于50mM Kpi(pH7)中)、0.25μl[U-14C]-酪氨酸(0.05μCi/mmol，433mCi/mmol，Amersham)、3μl UDPG(33mg/ml于50mM Kpi(pH7)中)和3μl栗精素(castanospermin)(2mM于50mMKpi(pH7)中)。經(jīng)重復(fù)懸浮混合各組分，如果必要，用50mM Kpi(pH7)將終體積調(diào)節(jié)為30μl。以1μl NADPH(25mg/ml)起始酶反應(yīng)。
經(jīng)P450OX的重建用對羥基苯乙醛肟也合成蜀黍苷(反應(yīng)混合物中不含P450TYR和酪氨酸，其它任何組分不變)。這些試驗(yàn)包含0.5μl[U-14C]-對羥基苯乙醛肟(0.014μCi/μl，394mCi/mmol)或3μl未標(biāo)記的對羥基苯乙醛肟(20mM)作為P450OX的底物。在后一種情況中，放射性標(biāo)記是1μl[U-14C]-UDPG(0.025μCi/μl，287mCi/mmol，Amersham)。所有反應(yīng)混合物都制備雙份。于30℃溫育1小時后，將每組反應(yīng)混合物加于TLC片上。如實(shí)施例4.5使用乙酸乙酯/甲苯溶劑分析第一組反應(yīng)混合物。第二組反應(yīng)混合物用由乙酸乙酯/丙酮/二氯甲烷/甲醇/水(20/15/6/5/4，v/v/v/v/v)組成的溶劑系統(tǒng)分析，以實(shí)現(xiàn)親水產(chǎn)物蜀黍苷從酪氨酸和疏水中間物中的分離。放射性標(biāo)記的底物和產(chǎn)物用STORM 840-磷成像儀顯色。
在重建實(shí)驗(yàn)中，以放射性標(biāo)記的酪氨酸為底物，分離的P450TYR與P450OX的結(jié)合使用導(dǎo)致對羥基苯乙腈和對羥基苯甲醛的產(chǎn)生。這證明P450TYR和P450OX能在體外共同作用。P450TYR產(chǎn)生的對羥苯基乙醛肟于是被P450OX有效地用作底物。在NADPH-P450氧化還原酶缺乏或NADPH缺乏下，觀察不到活性。
使用對羥基苯乙醛肟作為底物，蜀黍苷體外產(chǎn)生的實(shí)現(xiàn)方法是，在NADPH和UDPG的存在下，將P450OX與部分純化的可溶性UDPG葡糖基轉(zhuǎn)移酶一起重建。無法獲得編碼UDPG葡糖基轉(zhuǎn)移酶的來源于高粱的cDNA克隆，該酶特異性利用對羥基杏仁腈作為底物。因此，在本研究中，用來自高粱的可溶性UDPG葡糖基轉(zhuǎn)移酶粗提取物使對羥基杏仁腈葡糖基化，并證明完整蜀黍苷生物合成途徑的體外重建。加入的放射性標(biāo)記的對羥基苯乙醛肟被完全代謝。加入栗精素抑制UDPG葡糖基轉(zhuǎn)移酶制劑中存在的葡糖苷酶活性。除了以上用于疏水化合物分離的TLC系統(tǒng)外，引入了另外一種TLC系統(tǒng)用于親水化合物如蜀黍苷的分離。與真正的蜀黍苷共遷移的放射性標(biāo)記化合物的形成證明，該重建試驗(yàn)中形成的對羥基杏仁腈部分轉(zhuǎn)化為蜀黍苷。當(dāng)用放射性標(biāo)記的UDPG代替放射性標(biāo)記的對羥基苯乙醛肟重復(fù)實(shí)驗(yàn)時，在不含栗精素時放射性標(biāo)記化合物的分解以及共遷移的放射性標(biāo)記產(chǎn)物的形成，進(jìn)一步證實(shí)了該放射性標(biāo)記化合物為蜀黍苷。放射性標(biāo)記的UDPG非特異地標(biāo)記一系列相對親水的化合物。由于對羥基杏仁腈的不穩(wěn)定性，它向蜀黍苷的轉(zhuǎn)化在實(shí)驗(yàn)上以對羥基苯甲醛的消失來檢測。當(dāng)用放射性標(biāo)記的對羥苯基乙醛肟作為底物時，除蜀黍苷之外產(chǎn)生許多未鑒定的、疏水的、放射性標(biāo)記的化合物。這些化合物的形成在缺乏UDPG時發(fā)生，但需要可溶性提取物的存在，這表明UDPG葡糖基轉(zhuǎn)移酶提取物包含其它的酶活性。對羥基杏仁腈酚基的葡糖基化導(dǎo)致吡喃葡糖基氧杏仁腈的形成。未觀察到與對吡喃葡糖基氧杏仁腈的可靠標(biāo)準(zhǔn)共遷移的放射性標(biāo)記產(chǎn)物。栗精素有效地抑制UDPG葡糖基轉(zhuǎn)移酶提取物中存在的葡糖苷酶活性。
體外重建后，P450TYR(CYP79)的轉(zhuǎn)換數(shù)為230分鐘-1(Sibbesen等人，生物化學(xué)雜志2703506-3511，1995)。P450OX向其變性P420形式的部分轉(zhuǎn)化妨礙了其轉(zhuǎn)換數(shù)的測定。使用微粒體系統(tǒng)，從酪氨酸、對羥基苯乙醛肟和對羥基苯乙腈產(chǎn)生對羥基杏仁腈的Km和Vmax值分別為0.03、0.05和0.10mM，以及145、400和50nmole/mg蛋白質(zhì)/小時(Moller等人，生物化學(xué)雜志2548575-8583，1979)。
在體外重建了起始于親代氨基酸酪氨酸的完整蜀黍苷生物合成途徑，方法是在DLPC微膠粒中將P450TYR、P450OX、NADPH-P450氧化還原酶與UDPG葡糖基轉(zhuǎn)移酶、酪氨酸、NADPH、UDPG和栗精素組合。P450TYR使酪氨酸轉(zhuǎn)化為對羥基苯乙醛肟，其被P450OX進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為對羥基苯乙腈和對羥基苯甲醛。一些對羥基苯乙腈積累，而形成的所有對羥基杏仁腈都轉(zhuǎn)化為蜀黍苷和一些未鑒定的化合物。在這組實(shí)驗(yàn)中，P450TYR和P450OX的化學(xué)計(jì)量比約為15。因此在該重建試驗(yàn)中檢測到對羥基苯乙醛肟的積累并不意外。觀察到的對羥基苯乙腈的積累是不希望的，因?yàn)橐郧坝酶吡晃⒘ｓw的實(shí)驗(yàn)顯示，對羥基苯乙腈難以積累和捕獲。分離的P450OX的部分變性或失活可以解釋在用分離的P450OX進(jìn)行的重建實(shí)驗(yàn)中為什么對羥基苯乙腈積累。4.6.底物結(jié)合P450OX是一種多功能的酶，可將對羥基苯乙醛肟轉(zhuǎn)化為對羥基杏仁腈，對羥基苯乙腈是其中一種中間物，P450OX的鑒定促使我們研究P450OX的底物結(jié)合能力。用對羥基苯乙醛肟獲得一種反向I型光譜，其吸光度最小值在381nm，吸光度最大值在418nm，這提示底物加入后從高自旋態(tài)到低自旋態(tài)的轉(zhuǎn)變。溫育后振幅在大小上增加，約45分鐘后達(dá)到穩(wěn)定的最大值。對羥基苯乙腈加入后未獲得底物結(jié)合光譜。
發(fā)現(xiàn)與自高粱分離的其它P450酶相比P450OX更不穩(wěn)定。分離的P450OX一經(jīng)與對羥基苯乙醛肟溫育后產(chǎn)生反向I型底物結(jié)合光譜。對應(yīng)于從一個自旋態(tài)向另一個自旋態(tài)完全躍遷的消光系數(shù)E420-390為130mM- 1cm-1。在獲得的底物結(jié)合光譜中，最大振幅約兩倍于理論計(jì)算值，甚至是假定從一個高自旋態(tài)到一個低自旋態(tài)完全躍遷時的計(jì)算值。這種差異表明，在一氧化碳結(jié)合光譜中從450nm峰定量時，低估了P450OX的濃度。或者，P450OX的P420形式能結(jié)合肟，因而對形成的底物結(jié)合光譜的大小有影響。后一種可能性可解釋為什么只在延長的溫育后獲得最大振幅。
以前已報(bào)道了使用肝微粒體從醛肟向腈的P450介導(dǎo)的脫水化(DeMaster等人，有機(jī)化學(xué)雜志5074-5075，1992)。肝微粒體系統(tǒng)與P450OX的主要不同在于，前者需要嚴(yán)格的厭氧條件，而后者需氧進(jìn)行，催化隨后的C-羥化反應(yīng)，并代謝(E)-及(Z)-異構(gòu)體。在厭氧條件下，用肝微粒體獲得弱I型光譜。NADPH或連二亞硫酸鹽加入后，在442-444nm處形成明顯的Soret峰。推斷其代表Fe(II)態(tài)的P450的主要活性種。厭氧條件下P450OX的光譜研究未揭示442nm吸收復(fù)合體的形成，但催化活性需要NADPH的存在，這表明P450OX也需要為Fe(II)態(tài)，以介導(dǎo)脫水反應(yīng)。實(shí)施例5A型細(xì)胞色素P450探針的產(chǎn)生使用高度簡并的含肌苷(I)的引物對從單向質(zhì)粒cDNA文庫(Invitrogen)分離的質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR，該文庫從1-2cm高的雙色高粱黃化幼苗中制備，其引物優(yōu)先選擇A型細(xì)胞色素P450(Nelson和Durst，藥物代謝與藥物相互作用12189-206(1995))。引物1(有義鏈)具有序列5’-GCGGAATTCTTYIIICCNGARMGNTT-3’(SEQ ID NO5)，覆蓋共有氨基酸序列FXPERF(SEQ ID NO6)，其中X是任意氨基酸。引物2(反義鏈)具有序列5’-GCGGATCCIIIRCAIIINCKNCKNCC-3’(SEQ ID NO7)，覆蓋共有氨基酸序列GRRXCXG(SEQ ID NO8)。引物1和引物2尾部分別加上EcoRI和BamHI位點(diǎn)，以確保只有由這兩條引物產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物才被克隆至EcoRI/BamHI消化的pBluescriptII SK(Stratagene)中。PCR進(jìn)行連續(xù)兩輪。第1輪使用引物1和標(biāo)準(zhǔn)T7引物5’-AATACGACTCACTATAG-3’(SEQ ID NO9)，富集編碼A型細(xì)胞色素P450的cDNA庫。第2輪包括引物1和引物2，主要產(chǎn)生對A型細(xì)胞色素P450特異的一條約100bp的帶。第1輪的PCR反應(yīng)在100μl的總體積中進(jìn)行，包含5％DMSO、200μM dNTPs、200pmol引物1、100pmol標(biāo)準(zhǔn)T7引物、2.5單位PCR緩沖液中的Taq DNA聚合酶和1μl100倍稀釋的自cDNA文庫獲得的質(zhì)粒DNA。第2輪的PCR反應(yīng)在100μl的總體積中進(jìn)行，包括5％DMSO、200μM dNTPs、200pmol引物1和引物2、2.5單位于PCR緩沖液中的Taq DNA聚合酶和1μl從PCR第1輪獲得的產(chǎn)物。對于兩輪PCR，95℃5分鐘的一個循環(huán)后是95℃30秒、50℃1分鐘和72℃ 30秒的35個循環(huán)。從2％瓊脂糖凝膠中切下PCR第2輪的約100bp的產(chǎn)物，在克隆至pBluescript之前再擴(kuò)增。在19個測序的克隆中，有10個在氨基酸水平上與桂皮酸羥化酶(CYP74)具有很高的序列同一性，因此未進(jìn)一步研究。剩余9個序列的序列比較將它們劃分為8個和1個序列的兩組，分別被表示為“12”和“7”。序列“12”基因特異引物位于引物1和引物2之間5’-GCGGATCCGACTACTACGGCTCGC-3’(SEQ ID NO10)和引物5’-GCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3’(SEQ ID NO11)，兩條引物尾部都含BamHI，用于從PCR第1輪中擴(kuò)增約500bp的“12”基因特異片段，并克隆至pBluescript中。同樣“7”基因特異片段的獲得是使用“7”基因特異引物5’-GCGGATCCGACATCAAGGGCAGCG-3’(SEQ ID NO12)和引物5’-GCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3’(SEQ ID NO11)。根據(jù)廠商說明書用標(biāo)準(zhǔn)T7和T3引物通過PCR擴(kuò)增，用洋地黃毒苷-11-dUTP(Boehringer Mannheim)標(biāo)記插入片段，并用它來篩查cDNA文庫。實(shí)施例6文庫篩查和DNA序列測定過濾后使用DIG系統(tǒng)(Boehringer Mannheim)進(jìn)行雜交。用尼龍膜(Boehringer Mannheim)制備集落重復(fù)樣章，在5×SSC、0.1％N-月桂基肌氨酸、0.02％SDS、1％封閉劑(Boehringer Mannheim)中68℃雜交過夜。檢測前將濾膜于65℃在0.1×SSC、0.1％SDS中洗兩次各15分鐘。序列分析證明，對于“12”和“7”兩者都獲得全長的克隆。使用熱測序酶熒光標(biāo)記的引物循環(huán)測序試劑盒(7-deaza dGTP)(Amersham)進(jìn)行序列測定，并在ALF-Express(Pharmacia)上分析。使用GCG Wisconsin序列分析程序包中的程序進(jìn)行序列計(jì)算機(jī)分析。從“12”的核苷酸序列測定中獲得的P450OX的全長cDNA序列和編碼區(qū)的衍生氨基酸序列分別在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中列出。實(shí)施例7在大腸桿菌中的表達(dá)表達(dá)載體pSP19g10L(Barnes，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)2723-14，1996)從Henry Barnes博士處(合成遺傳學(xué)/免疫復(fù)合物公司，San Diego，CA)獲得。該質(zhì)粒包含lacZ啟動子，lacZ啟動子與來源于T7噬菌體g10L的基因10的短前導(dǎo)序列相融合，已證明它對于多種異源蛋白質(zhì)的表達(dá)是一種很好的前導(dǎo)序列(Olin等人，1988)。通過使用Pwo-聚合酶(Boehringer Mannheim)經(jīng)PCR修飾“7”和“12”，以在起始密碼子處引入一個NdeI位點(diǎn)，將終止密碼子改變?yōu)轸魇K止密碼子，其后緊接著一個HindIII位點(diǎn)。為了制備“7”的表達(dá)克隆，使用引物3(有義鏈)5’-CGCGGATCCATATGGACGCATCATTACTCCTCTCCGTCGCGCTC-3’(SEQ ID NO13)和引物4(反義鏈)5’-CGCAAGCTTATTACATCTCAACGGGGACCCT-3’(SEQ ID NO14)。引物3在密碼子3、4和5中引入沉默突變，以降低翻譯起始位點(diǎn)和NdeI位點(diǎn)上游緊接的BamHI位點(diǎn)周圍的G/C含量。用BamHI和HindIII消化所得的PCR片段，連接至用BamHI和HindIII消化的pBluescript中，通過序列測定排除PCR錯誤。同樣將“12”引入pBluescript中，使用引物5(有義鏈)5’-CGCGGATCCATATGGCAACAACAGCAACCCCGCAGCTCCTC-3’(SEQ ID NO15)和引物6(反義鏈)5’-CGCAAGCTTATTATGCTGCGCGGCGGTTCTTGTATTTGG-3’(SEQ ID NO16)。引物5在密碼子2、3、4和5中引入沉默突變，引物6在最后2個密碼子中引入沉默突變，以降低G/C含量。使用NdeI和HindIII切下插入片段，連接至用NdeI和HindIII消化的pSP19g10L中。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109細(xì)胞中。單菌落于37℃在含100mg氨芐青霉素/ml的LB培養(yǎng)基中生長過夜，用5ml過夜培養(yǎng)物接種500ml含50mg/ml氨芐青霉素、1mM硫胺素、1mM異丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷和1mMδ-氨基乙酰丙酸的TB培養(yǎng)基。細(xì)胞于28℃、125轉(zhuǎn)/分生長48小時。用“7”、“12”的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化1ml大腸桿菌，經(jīng)離心(2000g，10分鐘)沉淀pSP19g10L，在50mM N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸pH7.9中洗滌并濃縮10倍，與14nCi具有394mCi/mmol比活性的[U-14C]對羥基苯乙醛肟在30℃溫育30分鐘。用乙酸乙酯提取溫育混合物，加于TLC板(硅膠60F254，Merck)中，用乙酸乙酯/甲苯(1∶5v/v)混合物作為流動相展開，用Molecular Dynamics的STORM840顯色。以表達(dá)“12”的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌能將對羥基苯乙醛肟轉(zhuǎn)化為對羥基苯乙腈。
表達(dá)P450OX的大腸桿菌，其溶解的球芽(spheroblast)的CO差光譜包括一個417nm處的主要峰和一個457nm處的次要峰。通常，具有一個在420nm周圍的吸光度峰的CO光譜表示一種非功能性構(gòu)象的細(xì)胞色素P450(Imai等人，歐洲生物化學(xué)雜志1419-426，1964)。417nm處主要峰的存在提示，表達(dá)的細(xì)胞色素P450大多數(shù)以非功能性構(gòu)象存在。吸光度峰從450nm向457nm的明顯轉(zhuǎn)移可能是因?yàn)榇罅糠菢?gòu)象態(tài)的細(xì)胞色素P450的存在。根據(jù)457nm處的峰，估計(jì)產(chǎn)量為每65小時每升大腸桿菌培養(yǎng)物50nmol P450OX。
如Halkier等人，生物化學(xué)與生物物理學(xué)檔案322369-377，1995所述，從表達(dá)“12”的大腸桿菌中分離5μl膜，用100μl總體積的30mM N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸(pH7.9)中的0.225單位NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶、50μg NADPH、42nCi對羥基苯乙醛肟和100μg雙月桂基磷脂酰膽堿將其重建。在30℃溫育30分鐘后，將反應(yīng)混合物加于TLC板中，并如上所述分析。來源于表達(dá)“12”的大腸桿菌的膜的重建導(dǎo)致對羥基苯甲醛的積累，對羥基苯甲醛是對羥基杏仁腈的穩(wěn)定的分解產(chǎn)物，對羥基杏仁腈是含氰苷蜀黍苷生物合成中最后的中間物。這顯示“12”是催化對羥基苯乙醛肟向?qū)αu基杏仁腈轉(zhuǎn)化的細(xì)胞色素P450。其cDNA被稱為P450OX。包含所述P450OXcDNA的一株克隆已于1997年1月10日保藏于德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，保藏號為DSM11367。
當(dāng)對P450OX轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞施用放射性標(biāo)記的對羥基苯乙醛肟時，對羥基苯乙腈在表達(dá)P450OX的大腸桿菌細(xì)胞中積累。不包含內(nèi)源細(xì)胞色素P450或NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶的大腸桿菌顯示支持異源表達(dá)的細(xì)胞色素P450的催化活性。兩種可溶性大腸桿菌黃素蛋白，黃素氧還蛋白和NADPH-黃素氧還蛋白還原酶，作為重組細(xì)胞色素P450的還原等效物。用高粱NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶對分離的大腸桿菌膜或純化的重組酶的重建導(dǎo)致對羥基苯乙醛肟向?qū)αu基杏仁腈的轉(zhuǎn)化，而表達(dá)P450OX的大腸桿菌細(xì)胞將對羥基苯乙醛肟僅代謝為對羥基苯乙腈。大腸桿菌不能支持對羥基苯乙腈向?qū)αu基杏仁腈的轉(zhuǎn)化，是大腸桿菌黃素氧還蛋白/NADPH-黃素氧還蛋白還原酶系統(tǒng)不能支持微粒體細(xì)胞色素P450反應(yīng)催化活性的第一個例子。用表達(dá)P450OX的大腸桿菌細(xì)胞的膜和可溶性級分的初步重建實(shí)驗(yàn)顯示，可溶性黃素氧還蛋白/NADPH-黃素氧還蛋白還原酶系統(tǒng)僅在對羥基苯乙醛肟向?qū)αu基苯乙腈的轉(zhuǎn)化中支持P450OX，可溶性級分中不存在妨礙隨后的羥化反應(yīng)的抑制因素。大腸桿菌不能支持全部的P450OX活性可能反映出P450OX的非典型的催化反應(yīng)性。在用P450OX或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞中，積累一種遷移率略低于對羥基苯乙醛肟的化合物。這顯示大腸桿菌能不依賴于P450OX的存在而代謝對羥基苯乙醛肟。實(shí)施例8重組P450OX(CYP71E1)的純化如以前所述(Halkier等人，生物化學(xué)與生物物理學(xué)檔案322369-377，1995)對表達(dá)P450OX的2l大腸桿菌的球芽進(jìn)行采用1％ Tritoh X-114的溫度誘導(dǎo)的相分配。將含有P450OX的上相用100mM KPi pH7.0、0.05％還原的Triton X-100、1mM DTT、0.5mM PMSF稀釋100倍，用乙酸調(diào)節(jié)pH至7.0，加于用緩沖液D(10mM KPi pH7.0、0.2％ TritonX-114、0.05％還原的Triton X-100、10％甘油、1mM DTT、0.5％PMSF)平衡過的快流動CM-Sepharose柱(Pharmacia)上。以緩沖液D洗柱，用緩沖液D中的0-1M KCl線性梯度(350ml)洗脫P(yáng)450OX。合并含有P450OX的級分(43ml)用于重建實(shí)驗(yàn)，電洗脫的重組P450OX用于在雞中產(chǎn)生抗體。
如實(shí)施例4 4.2節(jié)中對于植物酶的純化所述，在DLPC中用NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶重建的純化重組P450OX，在NADPH存在下催化對羥基苯乙醛肟向?qū)αu基杏仁腈的轉(zhuǎn)化。實(shí)施例9蜀黍苷在轉(zhuǎn)基因芥(Arabidopsis)和煙草中的表達(dá)9.1載體質(zhì)粒的構(gòu)建產(chǎn)生三種用于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的雙元載體，即pPZP111.79、pPZP221.71E1和pPZP111.79.71E1。
對于pPZP111.79的構(gòu)建，首先用EcoRI切下P450TYR的cDNA克隆(WO 95/16041；Koch等人，生物化學(xué)與生物物理學(xué)檔案323177-186，1995)，將其引入pRT101的EcoRI位點(diǎn)(Kopfer等人，核酸研究155890，1987)，以將該cDNA有功能地與35S啟動子和CaMV聚腺苷酸化信號連接在一起，產(chǎn)生質(zhì)粒pRT101.79。在P450TYRcDNA引入之前去除一部分pRT101多接頭，方法是用SacI和XbaI消化，隨后再連接由Klenow處理獲得的平末端，于是僅留下EcoRI和XhoI位點(diǎn)是可用的。用SphI從pRT101.79上切下包括35S啟動子和CaMV聚腺苷酸化信號的P450TYR。為產(chǎn)生質(zhì)粒pPZP111.79，用Klenow聚合酶將末端處理成平端，將獲得的片段連接至EcoRI酶切的質(zhì)粒pPZP111上(Hajdukiewicz等人，植物分子生物學(xué)25989-994，1994)，pPZP111的末端也用Klenow聚合酶處理成平端，并去磷酸化。
對于pPZP221.71E1的構(gòu)建，首先用KpnI和XbaI切下P450OX的cDNA克隆，將其連接至pRT101的KpnI和XbaI位點(diǎn)，產(chǎn)生pRT101.71E1。隨后用HindIII從pRT101.71E1上切下包括35S啟動子和CaMV聚腺苷酸化信號的P450OX，將其連接至pPZP221(Hajdukiewicz等人，植物分子生物學(xué)25989-994，1994)的HindIII位點(diǎn)，從而產(chǎn)生pPZP221.71E1。
對于pPZP111.79.71E1的構(gòu)建，用HindIII從pPZP221.71E1上切下包括35S啟動子和CaMV聚腺苷酸化信號的P450OX的cDNA克隆，用Klenow聚合酶處理成平端，連接至pPZP111.79的SmaI位點(diǎn)。9.2擬南芥(Arabidopsis thaliana)的轉(zhuǎn)化如Wenjun和Forde，核酸研究178385，1989所述，通過電穿孔將雙元載體pPZP111、pPZP221、pPZP111.79、pPZP221.71E1和pPZP111.79.71E1引入根癌農(nóng)桿菌C58C1/pGV3850株?；救鏐echtold等人，分子生物學(xué)和遺傳學(xué)3161194-1199，1993的方法所述，經(jīng)真空滲透轉(zhuǎn)化擬南芥哥倫比亞(Colombia)生態(tài)型。在MS平板上篩選轉(zhuǎn)化體，對于pPZP111載體系列平板含有50μg/ml卡那霉素，對于pPZP221載體系列含200μg/ml硫酸慶大霉素。萌發(fā)4-6周后將卡那霉素或慶大霉素抗性的植物轉(zhuǎn)移至土壤中。9.3煙草(Nicotiana tabacum cv Xhanti)的轉(zhuǎn)化Nicotiana tabacum cv Xhanti的轉(zhuǎn)化基本根據(jù)Svab等人(《植物分子生物學(xué)方法》，Cold Spring Harbor，55-60頁，1995)的葉盤法，使用以pPZP111.79、pPZP221.71E1或pPZP111.79.71E1轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌C58C1/pGV3850。用100μg/ml卡那霉素篩選pPZP111.79載體的轉(zhuǎn)化體，用100μg/ml硫酸慶大霉素篩選pPZP221.71E1載體的轉(zhuǎn)化體，用50μg/mlG418篩選pPZP111.79.71E1載體的轉(zhuǎn)化體。生根后將煙草植物轉(zhuǎn)移至土壤中并在溫室中生長。9.4蜀黍苷的測定除了在加入0.1mgII型β-d-葡糖苷酶(Sigma)前將5-10mg葉組織凍融三次外，使用以前Halkier等人(植物生理學(xué)901552-1559，1989)描述的分光光度氰化物測定法定量蜀黍苷含量。9.5轉(zhuǎn)基因擬南芥的分析對離脫的擬南芥的葉飼喂2μl(U-14C)-酪氨酸(0.05μCi/μl，443mCi/mmol，Amersham)，置于封閉的eppendorf管內(nèi)在100μl H2O中過夜。用沸騰的90％甲醇提取代謝物5分鐘，濃縮提取物，加于TLC片(硅膠60F254)上。根據(jù)其疏水性/親水性在三種不同的溶劑系統(tǒng)中分離代謝物。溶劑系統(tǒng)乙酸乙酯/丙酮/二氯甲烷/甲醇/水(20/15/6/5/4，v/v/v/v/v)優(yōu)先分離不同的含氰苷。溶劑系統(tǒng)異丙醇/乙酸乙酯/水(7/1/2)分離不同的芥子油苷。溶劑系統(tǒng)甲苯/乙酸乙酯(5/1)分離疏水性中間物。放射性標(biāo)記的底物和產(chǎn)物用STORM 840磷成像儀(MolecularDynamics，美國)顯色。
使用根癌農(nóng)桿菌C58C1/pGV3850/pPZP111.79.71E1以P450TYR和P450OX轉(zhuǎn)化擬南芥，對其葉的甲醇提取物經(jīng)TLC分析，顯示與含氰苷蜀黍苷共遷移的新化合物的存在。對離脫的葉飼喂放射性標(biāo)記的酪氨酸顯示放射性標(biāo)記物存在于與蜀黍苷共遷移的帶中。通過比色氰化物測定法(Lambert等人，1975，分析化學(xué)(Analytic Chemistry)47，917-919)對轉(zhuǎn)化植物的完整葉組織的分析顯示，T1轉(zhuǎn)化體包含1-6nmol氰化物/mg(鮮重)。與此相比，使用根癌農(nóng)桿菌C58C1/pGV3850/pPZP111僅以nptII轉(zhuǎn)化的對照植物顯示1.2±0.35nmol氰化物/mg(鮮重)的氰化物含量。未見報(bào)道擬南芥的野生型植物含有含氰苷，對照植物中檢測到的氰化物的表觀水平最可能反映硫氰酸的存在。硫氰酸是芥子油苷的分解產(chǎn)物，已知其在比色氰化物測定中引起假反應(yīng)(Epstein，1974，分析化學(xué)19272-274)。
以擬南芥為例，作為P450TYR和P450OX兩者引入的結(jié)果，觀察到大量含氰苷蜀黍苷的產(chǎn)生，這證明存在適宜的UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，該酶使形成的對羥基杏仁腈在正確位置葡糖基化。由于糖基轉(zhuǎn)移酶的立體特異性還不清楚，所以存在這種可能性，即產(chǎn)生的含氰苷實(shí)際上是蜀黍苷的差向異構(gòu)體(鏡象異構(gòu)體)taxiphyllin。
當(dāng)通過根癌農(nóng)桿菌C58C1/pGV3850/pPZP111.79將P450TYR引入擬南芥時，一種化合物大量積累，該化合物與酪氨酸衍生的芥子油苷對羥基苯芥子油苷共遷移。這證明P450TYR的引入導(dǎo)致由酪氨酸產(chǎn)生對羥基苯乙醛肟。然后芥子油苷途徑中的酶將酪氨酸衍生的肟進(jìn)一步代謝為對羥基苯芥子油苷。這有力地表明，芥子油苷途徑中肟下游的酶對于側(cè)鏈結(jié)構(gòu)具有低底物特異性，芥子油苷曲線通常由該途徑中第一種細(xì)胞色素P450的底物特異性所確定。
P450OX的底物特異性不象P450TYR那樣窄。P450OX能代謝其它氨基酸衍生的肟，一個例子是苯丙氨酸衍生的肟苯乙醛肟，而P450TYR僅能代謝酪氨酸。將P450OX引入產(chǎn)芥子油苷的植物，能因而預(yù)計(jì)，當(dāng)在芥子油苷生物合成途徑中由氨基酸衍生的肟產(chǎn)生時，含氰苷積累。
因?yàn)镻450TYR和P450OX與芥子油苷生物合成途徑中的酶和前體相互作用，所以預(yù)期芥子油苷分布圖也被改變。9.6轉(zhuǎn)基因Nicotiana tabacum cv Xhanti的分析從用pPZP111.79轉(zhuǎn)化、功能性表達(dá)CYP79的煙草植物中分離的微粒體催化酪氨酸形成對羥基苯乙醛肟。當(dāng)使用溶劑系統(tǒng)異丙醇/乙酸乙酯/水(7/1/2)經(jīng)TLC分析時，與野生型煙草植物相比，表達(dá)CYP79并用放射性標(biāo)記的酪氨酸飼養(yǎng)的煙草離脫葉，其甲醇提取物包含三條另外的標(biāo)記帶。這三條另外的帶在TLC上與在用放射性標(biāo)記的對羥基苯乙醛肟飼養(yǎng)的野生型煙草植物中檢測到的標(biāo)記帶共遷移。在溶劑系統(tǒng)甲苯/乙酸乙酯(5/1)中分析時，證實(shí)其中一條帶為對羥基苯乙醛肟，其證據(jù)是與非標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)共遷移。另外兩條帶的同一性還不清楚，但從其在兩種溶劑系統(tǒng)中的遷移率判斷，其疏水性比對羥基基乙醛肟更低，它們最可能是對羥基苯乙醛肟的糖基化衍生物。CYP79植物的分析證實(shí)，CYP79能在煙草中功能性表達(dá)，并且產(chǎn)生一些游離的對羥基苯乙醛肟，但是產(chǎn)生的大多數(shù)對羥基苯乙醛肟被植物進(jìn)一步代謝。
表達(dá)P450TYR和P450OX兩者的植物能通過將表達(dá)P450TYR的植物與表達(dá)P450OX的植物雜交而獲得。另外，表達(dá)P450TYR或P450OX的植物能用根癌農(nóng)桿菌C58C1/pGV3850/pPZP221.71E1或根癌農(nóng)桿菌C58C1/pGV3850/pPZP111.79再轉(zhuǎn)化，這利用這樣一個事實(shí)，即兩種細(xì)胞色素P450構(gòu)建體連接于兩種不同的非排斥的抗性標(biāo)記，nptII和aacCI。實(shí)施例10蜀黍苷在轉(zhuǎn)基因玉米中的表達(dá)10.1載體質(zhì)粒的構(gòu)建產(chǎn)生下列兩種載體pCIB9842和pCIB9833，用于以P450TYR和P450OX對玉米的biolistic轉(zhuǎn)化。
pCIB9842如WO 95/16041所述，將編碼P450TYR的cDNA克隆克隆至pBluescript II SK的EcoRI位點(diǎn)，用其通過PCR在起始ATG密碼子處產(chǎn)生一個BamHI位點(diǎn)，在終止密碼子處產(chǎn)生一個BglII位點(diǎn)。將含有P450TYR基因的BamHI-BglII片段克隆至BamHI和BglII酶切的pCIB9805中，pCIB9805是基于pUC19的植物表達(dá)載體，在HindIII位點(diǎn)上游的256堿基對和BglII位點(diǎn)下游的778bp構(gòu)建有AflII/NotI/AscI位點(diǎn)，并包含EP-A-452269中公開的金屬硫素樣啟動子和35S終止子。
pCIB9833克隆至pcDNAII(Invitrogen)NotI-BstXI位點(diǎn)的實(shí)施例的P450OXcDNA克隆，被用來在起始ATG密碼子處產(chǎn)生一個BamHI位點(diǎn)，在終止密碼子處產(chǎn)生一個BglII位點(diǎn)。將含有P450OX基因的BamHI-BglII片段克隆至也用BamHI和BglII酶切的pCIB9805。10.2玉米的轉(zhuǎn)化方法從1.5-2.5mm長的未成熟胚芽開始Lancaster型近交的I型生胚愈傷組織培養(yǎng)(Green等人，1983；Wan等人，1994)。授粉約14天后，從表面無菌的、溫室生長的穗上無菌切下胚芽，置于含2％蔗糖和5mg/lchloramben的Duncan愈傷組織起始培養(yǎng)基中，在暗處培養(yǎng)。約14天后從外植體中去除胚發(fā)生反應(yīng)，置于含2％蔗糖和0.5mg/l 2，4-d的Duncan維持培養(yǎng)基中。每周傳代培養(yǎng)至新鮮的維持培養(yǎng)基中，4-8周后建立優(yōu)質(zhì)、致密的胚發(fā)生培養(yǎng)物。選擇活躍生長的胚發(fā)生愈傷組織片作為基因送遞的靶組織?；蛩瓦f前約4小時將愈傷組織片置于靶平板上，該平板含有含12％蔗糖的維持培養(yǎng)基。將愈傷組織片距靶平板中心8和10mm環(huán)形排列。如DuPont Biolistics手冊中所述將質(zhì)粒DNA沉淀于金微載體上。在每個6脈沖(shot)微載體制備中使用2-3μg每種質(zhì)粒。用PDS-1000HeBiolistics裝置將基因送遞至靶組織細(xì)胞。Biolistics裝置上的設(shè)置如下破裂片與巨載體之間8mm，巨載體與終止篩之間10mm，終止篩與靶之間7cm。每個靶平板用650psi的破裂片射擊兩次。一個200×200的不銹鋼網(wǎng)(McMaster-Carr，New Brunswick，NJ)置于終止篩與靶組織之間?；蛩瓦f7天后，將靶組織片從高滲培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至含100-120mg/l草銨膦(Basta)的選擇培養(yǎng)基中。從選擇培養(yǎng)基中去除所有氨基酸。在高水平選擇培養(yǎng)基上5-8周后，將任何生長的集落傳代培養(yǎng)至含20mg/l Basta的培養(yǎng)基中。每2周傳代培養(yǎng)生胚的愈傷組織，共4-8周，然后轉(zhuǎn)移至改良的MS培養(yǎng)基中置于光下，該培養(yǎng)基含有3％蔗糖、0.25mg/l嘧啶醇、0.5mg/l細(xì)胞分裂素，并且不含選擇劑。2周后去除嘧啶醇和細(xì)胞分裂素。將有根或無根的再生苗轉(zhuǎn)移至Magenta盒中，該盒中含有含3％蔗糖的MS培養(yǎng)基，最后回收有根的小植物，并轉(zhuǎn)移至溫室的土壤中。實(shí)施例11用PCR對含芥子油苷種中P450TYR同源物的鑒定根據(jù)芥(Arabidopsis)P450TYR同源物EST(保藏號T42902)與芥子(Sinapis)P450TYR同源物的計(jì)算機(jī)序列對比，設(shè)計(jì)兩條簡并引物寡核苷酸，它們能從含芥子油苷物種的基因組DNA中擴(kuò)增P450TYR同源物的PCR片段。有義鏈引物(5’-GCGGAATTCAARCCIGARMGICAYYT-3’)覆蓋保守氨基酸序列KPERHL(SEQ ID NO18)，包含一個EcoRI克隆位點(diǎn)。反義鏈引物2(5’-GCGGATCCRCAICCICKYTTICCNGT-3’)覆蓋保守氨基酸序列TGKRGC(SEQ ID NO19)，包含一個BamHI克隆位點(diǎn)。對用Amersham的Nucleon Phytopure植物DNA提取試劑盒制備的基因組DNA進(jìn)行PCR。使用白芥子、擬南芥、Brassica napus、旱金蓮(Tropaeolum majus)或N.Tabacum cv Xhanti的1μg基因組DNA，在100μl的總體積中進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中含有5％DMSO、200μMdNTPs、200pmol每種引物、2.5單位于PCR緩沖液(50mM KCl、10mMTris-HCl(pH8.8)、1.5mM MgCl2和0.1％Triton X-100)中的Taq聚合酶。用下列四個連續(xù)階段進(jìn)行PCR階段195℃5分鐘1個循環(huán)；階段295℃30秒、55℃30秒、72℃30秒5個循環(huán)；階段395℃30秒、60℃30秒、72℃30秒30個循環(huán)；和階段472℃5分鐘1個循環(huán)。
為從旱金蓮中產(chǎn)生足量的約100bp的帶，可將階段2修改為95℃30秒、50℃30秒、71℃30秒5個循環(huán)。
使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化PCR產(chǎn)物，用EcoRI和BamHI限制性消化，在3％TAE瓊脂糖凝膠上分離。切下約100bp的主要帶，連接至EcoRI/amHI線性化的pBluescript II SK(Stratagene)中。使用熱序列熒光標(biāo)記引物循環(huán)測序試劑盒(7-deaza dGTP)(Amersham)對5個物種每種約10個克隆進(jìn)行測序，并在ALF-Express(Pharmacia)上分析。
從四個含芥子油苷的物種白芥子、擬南芥、B.napus和旱金蓮中，鑒定了編碼保守氨基酸序列KPERH(L/F)NECSEVTLTENDLRFISFSTGKRGC(分別為SEQ ID NO21和22)的PCR片段。此共有序列與以前鑒定的白芥子、擬南芥的P450TYR同源物序列相同，并且非常類似于高粱P450TYR氨基酸序列。從不含芥子油苷的植物N.tabacum cv Xhanti中，不能鑒定出編碼該共有序列的PCR片段。該P(yáng)450TYR同源物共有氨基酸序列在例舉的四種含芥子油苷植物種中的存在表明，P450TYR家族的氨基酸N-羥化酶細(xì)胞色素P450在芥子油苷種中將親代氨基酸或鏈延長的親代氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的肟。對P450TYR同源物特異的PCR片段的產(chǎn)生使同源cDNA或基因組克隆能被從相應(yīng)的文庫中分離。
盡管為了理解的清晰性已經(jīng)以舉例和實(shí)施例的方式相當(dāng)詳細(xì)地描述了前述的發(fā)明，但顯然可實(shí)施某些改變和修改而仍落在附加的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名CIBA-GEIGY AG(B)街道Klybeckster.141(C)城市Basel(E)國家瑞士(F)郵政編碼(ZIP)4002(G)電話41 61 69 11 11(H)傳真41 61 696 79 76(I)電傳962 991(A)姓名Royal Veterinary & Agricultural University(B)街道40，Thorvaldsensvej(C)城市Frederiksberg(D)州Copenhagen(E)國家丹麥(F)郵政編碼(ZIP)1871(ii)發(fā)明名稱細(xì)胞色素P450單加氧酶(iii)序列數(shù)目21(iv)計(jì)算機(jī)可讀信息(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征
(A)長度1929個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型cDNA(vii)直接來源(B)克隆P450ox(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置81..1673(xi)SEQ ID NO1的序列描述CAGAGCTAGA AGCAGCTCAC ACTCCACACT CGTCTCGCCC GGCCATCCC CAAGGCAAGC60AGGGGCACGG GCAATTAACA ATG GCC ACC ACC GCC ACC CCG CAG CTC CTC 110Met Ala Thr Thr Ala Thr Pro Gln Leu Leu15 10GGC GGC AGC GTG CCG CAG CAG TGG CAG ACG TGC CTC CTG GTG CTC CTC 158Gly Gly Ser Val Pro Gln Gln Trp Gln Thr Cys Leu Leu Val Leu Leu15 20 25CCT GTG CTG CTG GTG TCC TAC TAC CTC CTC ACC AGC AGG AGC AGG AAC 206Pro Val Leu Leu Val Ser Tyr Tyr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Arg Asn30 35 40AGG AGC AGG AGC GGC AAG CTG GGC GGG GCG CCG CGG CTG CCG CCG GGC 254Arg Ser Arg Ser Gly Lys Leu Gly Gly Ala Pro Arg Leu Pro Pro Gly45 50 55CCT GCG CAG CTG CCG ATC CTG GGC AAC CTG CAC CTG CTG GGC CCG CTG 302Pro Ala Gln Leu Pro Ile Leu Gly Asn Leu His Leu Leu Gly Pro Leu60 65 70CCG CAC AAG AAC CTC CGC GAG CTG GCG CGG CGG TAC GGC CCC GTG ATG 350Pro His Lys Asn Leu Arg Glu Leu Ala Arg Arg Tyr Gly Pro Val Met75 80 85 90CAG CTC CGT CTA GGC ACC GTG CCG ACG GTG GTG GTG TCC AGC GCG GAG 398Gln Leu Arg Leu Gly Thr Val Pro Thr Val Val Val Ser Ser Ala Glu95 100 105GCG GCG CGG GAG GTT CTC AAG GTG CAC GAC GTC GAC TGC TGC AGC CGG 446Ala Ala Arg Glu Val Leu Lys Val His Asp Val Asp Cys Cys Ser Arg110 115 120CCG GCG TCG CCC GGT CCC AAG CGC CTC TCC TAC GAC CTC AAG AAC GTC 494Pro Ala Ser Pro Gly Pro Lys Arg Leu Ser Tyr Asp Leu Lys Asn Val125 130 135GGC TTC GCG CCC TAC GGC GAG TAC TGG CGC GAG ATG CGC AAG CTC TTC 542Gly Phe Ala Pro Tyr Gly Glu Tyr Trp Arg Glu Met Arg Lys Leu Phe140 145 150GCG CTC GAG CTC CTC AGC ATG CGC CGC GTC AAG GCC GCC TGC TAC GCG 590Ala Leu Glu Leu Leu Ser Met Arg Arg Val Lys Ala Ala Cys Tyr Ala155 160 165 170CGC GAG CAG GAG ATG GAC AGG CTC GTC GCC GAC CTC GAC CGC GCC GCC 638Arg Glu Gln Glu Met Asp Arg Leu Val Ala Asp Leu Asp Arg Ala Ala175 180 185GCG TCC AAG GCC TCC ATC GTC CTC AAC GAC CAC GTC TTC GCC CTC ACC 686Ala Ser Lys Ala Ser Ile Val Leu Asn Asp His Val Phe Ala Leu Thr190 195 200GAC GGC ATC ATC GGC ACC GTC GCG TTC GGC AAC ATC TAC GCC TCC AAG 734Asp Gly Ile Ile Gly Thr Val Ala Phe Gly Asn Ile Tyr Ala Ser Lys205 210 215CAG TTC GCG CAC AAG GAG CGC TTC CAG CAC GTG CTG GAC GAC GCC ATG 782Gln Phe Ala His Lys Glu Arg Phe Gln His Val Leu Asp Asp Ala Met220 225 230GAC ATG ATG GCC AGC TTC TCC GCC GAG GAC TTC TTC CCC AAC GCC GCC 830Asp Met Met Ala Ser Phe Ser Ala Glu Asp Phe Phe Pro Asn Ala Ala235 240 245 250GGC CGC CTC GCC GAC CGC CTC TCG GGC TTC CTC GCC CGC CGC GAG CGC 878Gly Arg Leu Ala Asp Arg Leu Ser Gly Phe Leu Ala Arg Arg Glu Arg255 260 265ATC TTC AAC GAG CTC GAC GTC TTC TTC GAG AAG GTC ATC GAC CAG CAC 926Ile Phe Asn Glu Leu Asp Val Phe Phe Glu Lys Val Ile Asp Gln His270 275 280ATG GAC CCG GCG CGC CCC GTG CCG GAC AAC GGC GGC GAC CTC GTC GAC 974Met Asp Pro Ala Arg Pro Val Pro Asp Asn Gly Gly Asp Leu Val Asp285 290 295GTC CTC ATC AAC CTG TGC AAG GAG CAC GAC GGC ACG CTC CGC TTC ACC 1022Val Leu Ile Asn Leu Cys Lys Glu His Asp Gly Thr Leu Arg Phe Thr300 305 310AGG GAC CAC GTC AAG GCC ATC GTC CTC GAC ACC TTC ATC GGC GCC ATC 1070Arg Asp His Val Lys Ala Ile Val Leu Asp Thr Phe Ile Gly Ala Ile315 320 325 330GAC ACC AGC TCC GTC ACC ATC CTG TGG GCC ATG TCG GAG CTG ATG CGG 1118Asp Thr Ser Ser Val Thr Ile Leu Trp Ala Met Ser Glu Leu Met Arg335 340 345AAG CCG CAG GTG CTG AGG AAG GCG CAG GCC GAG GTG CGG GCC GCC GTG 1166Lys Pro Gln Val Leu Arg Lys Ala Gln Ala Glu Val Arg Ala Ala Val350 355 360GGC GAC GAC AAG CCG CGC GTC AAC TCG GAA GAC GCC GCC AAG ATC CCG 1214Gly Asp Asp Lys Pro Arg Val Asn Ser Glu Asp Ala Ala Lys Ile Pro365 370 375TAC CTG AAG ATG GTG GTC AAG GAG ACG CTG CGG CTG CAC CCG CCG GCG 1262Tyr Leu Lys Met Val Val Lys Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Pro Ala380 385 390ACG CTG CTG GTG CCC CGG GAG ACG ATG CGG GAC ACC ACC ATC TGC GGC 1310Thr Leu Leu Val Pro Arg Glu Thr Met Arg Asp Thr Thr Ile Cys Gly395 400 405 410TAC GAC GTG CCG GCC AAC ACG CGC GTC TTC GTC AAC GCC TGG GCC ATC 1358Tyr Asp Val Pro Ala Asn Thr Arg Val Phe Val Asn Ala Trp Ala Ile415 420 425GGC AGG GAC CCG GCG AGC TGG CCG GCG CCC GAC GAG TTC AAC CCG GAC 1406Gly Arg Asp Pro Ala Ser Trp Pro Ala Pro Asp Glu Phe Asn Pro Asp430 435 440CGC TTC GTG GGG AGC GAC GTC GAC TAC TAC GGC TCG CAC TTC GAG CTC 1454Arg Phe Val Gly Ser Asp Val Asp Tyr Tyr Gly Ser His Phe Glu Leu445 450 455ATA CCG TTC GGG GCC GGC CGC CGG ATC TGC CCG GGA CTC ACC ATG GGC 1502Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Pro Gly Leu Thr Met Gly460 465 470GAG ACC AAC GTC ACC TTC ACC CTC GCC AAC CTG CTC TAC TGC TAC GAC 1550Glu Thr Asn Val Thr Phe Thr Leu Ala Asn Leu Leu Tyr Cys Tyr Asp475 480 485 490TGG GCG CTG CCG GGG GCC ATG AAG CCG GAG GAC GTC AGC ATG GAG GAG 1598Trp Ala Leu Pro Gly Ala Met Lys Pro Glu Asp Val Ser Met Glu Glu495 500 505ACC GGA GCG CTC ACG TTC CAC CGG AAG ACG CCG CTT GTG GTG GTG CCC 1646Thr Gly Ala Leu Thr Phe His Arg Lys Thr Pro Leu Val Val Val Pro510 515 520ACC AAA TAC AAG AAC CGC CGC GCC GCC TAGTGAGCAG AGCCGAGCAG 1693Thr Lys Tyr Lys Asn Arg Arg Ala Ala525 530AGCAATGGTC GACGACGACG ACGACGACGA CTGAATAAGC GTGCCAAAGT TTAGTACTAC 1753GTACGTACGT ACCTACTGCT ACTACGTACA GCTAGCCAAC AGTCAGAGTT GGACACTGTT 1813GGAGCTATCA TCCGGTCCTC TTCTTTTTGT GATACGTATT TGTTATGIGT TTTAGTGCCG 1873CAAAGCACAA AAGAAATAAA GCCCATCACA GTCGCGAGTC AAAAAAAAAA AAAAAA 1929(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度531個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO2的序列描述Met Ala Thr Thr Ala Thr Pro Gln Leu Leu Gly Gly Ser Val Pro Gln1 5 10 15Gln Trp Gln Thr Cys Leu Leu Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Val Ser20 25 30Tyr Tyr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Arg Asn Arg Ser Arg Ser Gly Lys35 40 45Leu Gly Gly Ala Pro Arg Leu Pro Pro Gly Pro Ala Gln Leu Pro Ile50 55 60Leu Gly Asn Leu His Leu Leu Gly Pro Leu Pro His Lys Asn Leu Arg65 70 75 80Glu Leu Ala Arg Arg Tyr Gly Pro Val Met Gln Leu Arg Leu Gly Thr85 90 95Val Pro Thr Val Val Val Ser Ser Ala Glu Ala Ala Arg Glu Val Leu100 105 110Lys Val His Asp Val Asp Cys Cys Ser Arg Pro Ala Ser Pro Gly Pro115 120 125Lys Arg Leu Ser Tyr Asp Leu Lys Asn Val Gly Phe Ala Pro Tyr Gly130 135 140Glu Tyr Trp Arg Glu Met Arg Lys Leu Phe Ala Leu Glu Leu Leu Ser145 150 155 160Met Arg Arg Val Lys Ala Ala Cys Tyr Ala Arg Glu Gln Glu Met Asp165 170 175Arg Leu Val Ala Asp Leu Asp Arg Ala Ala Ala Ser Lys Ala Ser Ile180 185 190Val Leu Asn Asp His Val Phe Ala Leu Thr Asp Gly Ile Ile Gly Thr195 200 205Val Ala Phe Gly Asn Ile Tyr Ala Ser Lys Gln Phe Ala His Lys Glu210 215 220Arg Phe Gln His Val Leu Asp Asp Ala Met Asp Met Met Ala Ser Phe225 230 235 240Ser Ala Glu AsP Phe Phe Pro Asn Ala Ala Gly Arg Leu Ala Asp Arg245 250 255Leu Ser Gly Phe Leu Ala Arg Arg Glu Arg Ile Phe Asn Glu Leu Asp260 265 270Val Phe Phe Glu Lys Val Ile Asp Gln His Met Asp Pro Ala Arg Pro275 280 285Val Pro Asp Asn Gly Gly Asp Leu Val Asp Val Leu Leu Ile Asn Leu Cys290 295 300Lys Glu His Asp Gly Thr Leu Arg Phe Thr Arg Asp His Val Lys Ala305 310 315 320Ile Val Leu Asp Thr Phe Ile Gly Ala Ile Asp Thr Ser Ser Val Thr325 330 335Ile Leu Trp Ala Met Ser Glu Leu Met Arg Lys Pro Gln Val Leu Arg340 345 350Lys Ala Gln Ala Glu Val Arg Ala Ala Val Gly Asp Asp Lys Pro Arg355 360 365Val Asn Ser Glu Asp Ala Ala Lys Ile Pro Tyr Leu Lys Met Val Val370 375 380Lys Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Pro Ala Thr Leu Leu Val Pro Arg385 390 395 400Glu Thr Met Arg Asp Thr Thr Ile Cys Gly Tyr Asp Val Pro Ala Asn405 410 415Thr Arg Val Phe Val Asn Ala Trp Ala Ile Gly Arg Asp Pro Ala Ser420 425 430Trp Pro Ala Pro Asp Glu Phe Asn Pro Asp Arg Phe Val Gly Ser Asp435 440 445Val Asp Tyr Tyr Gly Ser His Phe Glu Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly450 455 460Arg Arg Ile Cys Pro Gly Leu Thr Met Gly Glu Thr Asn Val Thr Phe465 470 475 480Thr Leu Ala Asn Leu Leu Tyr Cys Tyr Asp Trp Ala Leu Pro Gly Ala485 490 495Met Lys Pro Glu Asp Val Ser Met Glu Glu Thr Gly Ala Leu Thr Phe500 505 510His Arg Lys Thr Pro Leu Val Val Val Pro Thr Lys Tyr Lys Asn Arg515 520 525Arg Ala Ala530(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(v)片段類型N-末端(vii)直接來源(B)克隆N-末端肽(xi)SEQ ID NO3的序列描述Ala Thr Thr Ala Thr Pro Gln Leu Leu Gly Gly Ser Val Pro Glu Gln1 5 10 15(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度13個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型未知(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(v)片段類型內(nèi)部(vii)直接來源(B)克隆內(nèi)部肽(xi)SEQ ID NO4的序列描述Met Asp Arg Leu Val Ala Asp Leu Asp Arg Ala Ala Ala15 10(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型DNA(基因組)(vii)直接來源(B)克隆引物1(xi)SEQ ID NO5的序列描述GCGGAATTCT TYIIICCNGA RMGNTT 26(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部(vii)直接來源(B)克隆由引物1編碼的氨基酸(xi)SEQ ID NO6的序列描述Phe Xaa Pro Glu Arg Phe1 5(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型DNA(基因組)(vii)直接來源(B)克隆引物2(xi)SEQ ID NO7的序列描述GCGGATCCII IRCAIIINCK NCKNCC 26(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部(vii)直接來源
(B)克隆由引物2編碼的氨基酸(xi)SEQ ID NO8的序列描述Gly Arg Arg Xaa Cys Xaa Gly1 5(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型DNA(基因組)(vii)直接來源(B)克隆T7引物(xi)SEQ ID NO9的序列描述AATACGACTC ACTATAG 17(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型DNA(基因組)(vii)直接來源(B)克隆“12”基因特異性引物(xi)SEQ ID NO10的序列描述GCGGATCCGA CTACTACGGC TCGC 24(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)SEQ ID NO11的序列描述GCGGATCCTT TTTTTTTTTT TTTTV 25(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型DNA(基因組)(vii)直接來源(B)克隆“7”基因特異性引物(xi)SEQ ID NO12的序列描述GCGGATCCGA CATCAAGGGC AGCG 24(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型DNA(基因組)(vii)直接來源(B)克隆引物3(xi)SEQ ID NO13的序列描述CGCGGATCCA TATGGACGCA TCATTACTCC GCTC44(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型DNA(基因組)(vii)直接來源(B)克隆引物4(xi)SEQ ID NO14的序列描述CGCAAGCTTA TTACATCTCA ACGGGGACCC T 31(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度41個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型DNA(基因組)(vii)直接來源(B)克隆引物5(xi)SEQ ID NO15的序列描述CGCGGATCCA TATGGCAACA ACAGCAACCC CGCAGCTCCT C 41(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型DNA(基因組)(vii)直接來源(B)克隆引物6(xi)SEQ ID NO16的序列描述CGCAAGCTTA TTATGCTGCG CGGCGGTTCT TGTATTTGG39(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度542個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)非(iii)反義非(v)片段類型內(nèi)部(vii)直接來源(B)克隆Sinapis alba(xi)SEQ ID NO17的序列描述Met Asn Thr Phe Thr Ser Asn Ser Ser Asp Leu Thr Ser Thr Thr Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Ser Phe Ser Asn Met Tyr Leu Leu Thr Thr Leu Gln Ala20 25 30Phe Val Ala Ile Thr Leu Val Met Leu Leu Lys Lys Val Leu Val Asn35 40 45Asp Thr Asn Lys Lys Lys Leu Ser Leu Pro Pro Gly Pro Thr Gly Trp50 55 60Pro Ile Ile Gly Met Val Pro Thr Met Leu Lys Ser Arg Pro Val Phe65 70 75 80Arg Trp Leu His Ser Ile Met Lys Gln Leu Asn Thr Glu Ile Ala Cys85 90 95Val Arg Leu Gly Ser Thr His Val Ile Thr Val Thr Cys Pro Lys Ile100 105 110Ala Arg Glu Val Leu Lys Gln Gln Asp Ala Leu Phe Ala Ser Arg Pro115 120 125Met Thr Tyr Ala Gln Asn Val Leu Ser Asn Gly Tyr Lys Thr Cys Val130 135 140Ile Thr Pro Phe Gly Glu Gln Phe Lys Lys Met Arg Lys Val Val Met145 150 155 160Thr Glu Leu Val Cys Pro Ala Arg His Arg Trp Leu His Gln Lys Arg165 170 175Ala Glu Glu Asn Asp His Leu Thr Ala Trp Val Tyr Asn Met Val Asn180 185 190Asn Ser Asp Ser Val Asp Phe Arg Phe Val Thr Arg His Tyr Cys Gly195 200 205Asn Ala Ile Lys Lys Leu Met Phe Gly Thr Arg Thr Phe Ser Gln Asn210 215 220Thr Ala Pro Asn Gly Gly Pro Thr Ala Glu Asp Ile Glu His Met Glu225 230 235 240Ala Met Phe Glu Ala Leu Gly Phe Thr Phe Ser Phe Cys Ile Ser Asp245 250 255Tyr Leu Pro Ile Leu Thr Gly Leu Asp Leu Asn Gly His Glu Lys Ile260 265 270Met Arg Asp Ser Ser Ala Ile Met Asp Lys Tyr His Asp Pro Ile Ile275 280 285Asp Ala Arg Ile Lys Met Trp Arg Glu Gly Lys Lys Thr Gln Ile Glu290 295 300Asp Phe Leu Asp Ile Phe Ile Ser Ile Lys Asp Glu Glu Gly Asn Pro305 310 315 320Leu Leu Thr Ala Asp Glu Ile Lys Pro Thr Ile Lys Glu Leu Val Met325 330 335Ala Ala Pro Asp Asn Pro Ser Asn Ala Val Glu Trp Ala Met Ala Glu340 345 350Met Val Asn Lys Pro Glu Ile Leu Arg Lys Ala Met Glu Glu Ile Asp355 360 365Arg Val Val Gly Lys Glu Arg Leu Val Gln Glu Ser Asp Ile Pro Lys370 375 380Leu Asn Tyr Val Lys Ala Ile Leu Arg Glu Ala Phe Arg Leu His Pro385 390 395 400Val Ala Ala Phe Asn Leu Pro His Val Ala Leu Ser Asp Ala Thr Val405 410 415Ala Gly Tyr His Ile Pro Lys Gly Ser Gln Val Leu Leu Ser Arg Tyr420 425 430Gly Leu Gly Arg Asn Pro Lys Val Trp Ala Asp Pro Leu Ser Phe Lys435 440 445Pro Glu Arg His Leu Asn Glu Cys Ser Glu Val Thr Leu Thr Glu Asn450 455 460Asp Leu Arg Phe Ile Ser Phe Ser Thr Gly Xaa Arg Gly Cys Ala Ala465 470 475 480Pro Ala Leu Gly Thr Ala Leu Thr Thr Met Leu Leu Ala Arg Leu Leu485 490 495Gln Gly Phe Thr Trp Lys Leu Pro Glu Asn Glu Tnr Arg Val Glu Leu500 505 510Met Glu Ser Ser His Asp Met Phe Leu Ala Lys Pro Leu Val Met Val515 520 525Gly Glu Leu Arg Leu Pro Glu His Leu Tyr Pro Thr Val Lys530 535 540(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)非(iii)反義非(v)片段類型內(nèi)部(xi)SEQ ID NO18的序列描述Lys Pro Glu Arg His Leu1 5(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)非(iii)反義非(v)片段類型內(nèi)部(xi)SEQ ID NO19的序列描述Thr Gly Lys Arg Gly Cys1 5(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度31個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)非(iii)反義非(v)片段類型內(nèi)部(xi)SEQ ID NO20的序列描述Lys Pro Glu Arg His Leu Asn Glu Cys Ser Glu Val Thr Leu Thr Glu1 5 10 15Asn Asp Leu Arg Phe Ile Ser Phe Ser Thr Gly Lys Arg Gly Cys20 25 30(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度31個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)非(iii)反義非(v)片段類型內(nèi)部(xi)SEQ ID NO21的序列描述Lys Pro Glu Arg His Phe Asn Glu Cys Ser Glu Val Thr Leu Thr Glu1 5 10 15Asn Asp Leu Arg Phe Ile Ser Phe Ser Thr Gly Lys Arg Gly Cys20 25 30
權(quán)利要求
1.一種編碼細(xì)胞色素P450單加氧酶的DNA分子，該酶催化醛肟向腈的轉(zhuǎn)化以及該腈向相應(yīng)的氰醇的轉(zhuǎn)化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA分子，其中單加氧酶可從產(chǎn)生含氰苷的植物中獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的DNA分子，其中單加氧酶可從選自高粱屬、三葉草屬、亞麻屬、紫杉屬、海韭菜屬、木薯屬、扁桃屬、李屬的植物和十字花科植物中獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA分子，其中醛肟是選自酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和環(huán)戊烯甘氨酸的氨基酸在單加氧酶存在下轉(zhuǎn)化的結(jié)果，該單加氧酶催化該氨基酸向相應(yīng)的N-羥基氨基酸的轉(zhuǎn)化以及該N-羥基氨基酸向醛肟的轉(zhuǎn)化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA分子，其中單加氧酶催化含氰苷生物合成途徑中一種以上的反應(yīng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA分子，它包含應(yīng)用重組DNA技術(shù)所必需的DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA分子，它編碼雙色高粱的一種單加氧酶。
8.一種細(xì)胞色素P450單加氧酶，它催化醛肟向腈的轉(zhuǎn)化以及該腈向相應(yīng)的氰醇的轉(zhuǎn)化。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的細(xì)胞色素P450單加氧酶，它將醛肟轉(zhuǎn)化為腈的能力依賴于NADPH的存在，這種依賴性可通過還原劑的加入被克服。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的細(xì)胞色素P450單加氧酶，如SDS-PAGE測定它具有55kD的分子量，并且具有如SEQ ID NO3所述的N端序列。
11.一種分離編碼細(xì)胞色素P450單加氧酶的cDNA分子的方法，所述單加氧酶催化醛肟向腈的轉(zhuǎn)化以及該腈向相應(yīng)的氰醇的轉(zhuǎn)化；該方法包括(a)從產(chǎn)生含氰苷的植物組織中分離和溶解微粒體，(b)純化細(xì)胞色素P450單加氧酶，(c)產(chǎn)生針對純化的單加氧酶的抗體，(d)用該抗體探查產(chǎn)生含氰苷的植物組織的cDNA表達(dá)文庫，(e)分離表達(dá)單加氧酶的克隆。
12.一種分離編碼細(xì)胞色素P450單加氧酶的cDNA分子的方法，所述單加氧酶催化醛肟向腈的轉(zhuǎn)化以及該腈向相應(yīng)的氰醇的轉(zhuǎn)化；該方法包括(a)從產(chǎn)生含氰苷的植物組織中分離和溶解微粒體，(b)純化細(xì)胞色素P450單加氧酶，(c)獲得該單加氧酶的完全或部分蛋白質(zhì)序列，(d)設(shè)計(jì)特定DNA的寡核苷酸，該DNA編碼所述單加氧酶蛋白質(zhì)序列的4-15個氨基酸，(e)用該寡核苷酸、或者用通過該寡核苷酸由cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增所獲得的DNA分子探查產(chǎn)生含氰苷的植物組織的cDNA文庫，以及(f)分離編碼細(xì)胞色素P450單加氧酶的克隆。
13.一種分離編碼細(xì)胞色素P450單加氧酶的cDNA分子的方法，所述單加氧酶催化醛肟向腈的轉(zhuǎn)化以及該腈向相應(yīng)的氰醇的轉(zhuǎn)化；該方法包括(a)設(shè)計(jì)覆蓋A型細(xì)胞色素P450保守區(qū)3-10個氨基酸的簡并寡核苷酸，(b)使用該簡并寡核苷酸通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增一種或多種細(xì)胞色素特異的DNA片段，(c)用細(xì)胞色素特異的片段篩查cDNA文庫，獲得全長的cDNA，(d)在微生物宿主中表達(dá)全長的cDNA，(e)鑒定表達(dá)細(xì)胞色素P450單加氧酶的宿主，該酶催化醛肟向腈的轉(zhuǎn)化及該腈向相應(yīng)的氰醇的轉(zhuǎn)化，以及(f)從該宿主中純化克隆的DNA。
14.一種產(chǎn)生純化的重組細(xì)胞色素P450單加氧酶的方法，所述酶催化醛肟向腈的轉(zhuǎn)化及該腈向相應(yīng)的氰醇的轉(zhuǎn)化；該方法包括(a)人工改造編碼該單加氧酶的基因，使其可在宿主生物中表達(dá)，(b)用人工改造的基因轉(zhuǎn)化該宿主生物，以及(c)從宿主生物或其培養(yǎng)上清液中分離蛋白質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中該宿主生物選自細(xì)菌、酵母和昆蟲細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中產(chǎn)生雙色高粱的細(xì)胞色素P450單加氧酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中細(xì)胞色素P450單加氧酶被修飾。
18.一種轉(zhuǎn)基因植物，它包含穩(wěn)定整合入其基因組DNA、編碼根據(jù)權(quán)利要求8的單加氧酶的DNA，或編碼有義RNA、反義RNA或核酶的根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，DNA的表達(dá)降低了細(xì)胞色素P450單加氧酶的表達(dá)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因植物，它選自包括谷類、蛋白質(zhì)作物、水果作物、蔬菜和塊莖、堅(jiān)果、油料作物、糖料作物、飼料和草皮草、飼料豆類、纖維植物和木本植物、藥用作物以及香料和調(diào)料的植物類型。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因玉米植物。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因大麥植物。
22.一種獲得根據(jù)權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括(a)將DNA引入能再生為完整植物的植物細(xì)胞或組織中，該DNA包含可在此植物中表達(dá)的編碼根據(jù)權(quán)利要求8的單加氧酶的基因，以及(b)篩選轉(zhuǎn)基因植物。
23.一種獲得根據(jù)權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括(a)將編碼有義RNA、反義RNA或核酶的DNA引入能再生為完整植物的植物細(xì)胞或組織中，該DNA的表達(dá)降低了根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞色素P450單加氧酶的表達(dá)，以及(b)篩選轉(zhuǎn)基因植物。
24.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA分子的用途，其用以獲得根據(jù)權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因植物。
25.一種方法，它使用根據(jù)權(quán)利要求1的DNA分子獲得抵抗昆蟲、蜱螨或線蟲的轉(zhuǎn)基因植物，包括(a)將DNA引入能再生為完整植物的植物細(xì)胞或組織中，該DNA包含可在此植物中表達(dá)的編碼根據(jù)權(quán)利要求8的單加氧酶的基因，(b)篩選轉(zhuǎn)基因植物，以及(c)鑒定可抵抗昆蟲、蜱螨或線蟲的植物。
26.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述植物是單子葉或雙子葉植物，選自包括谷類、蛋白質(zhì)作物、水果作物、蔬菜和塊莖、堅(jiān)果、油料作物、糖料作物、飼料和草皮草、飼料豆類、纖維植物和木本植物、藥用作物以及香料和調(diào)料的植物類型。
27.一種細(xì)胞色素P450酶，它催化芥子油苷生物合成的第一步。
28.權(quán)利要求27的酶，它具有SEQ ID NO17所示的氨基酸序列。
全文摘要
提供了依賴細(xì)胞色素P450
文檔編號A01H5/00GK1249779SQ98803153
公開日2000年4月5日 申請日期1998年3月5日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月7日
發(fā)明者B·A·霍凱爾, S·貝克, R·A·卡恩, B·L·莫勒 申請人:諾瓦提斯公司, 皇家獸醫(yī)和農(nóng)業(yè)大學(xué)