專利名稱：纖維素酶變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過取代、插入和/或缺失的方法得自一種母體纖維素酶(也就是內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶)的纖維素酶變體，也就是內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶變體，該變體具有一個(gè)催化性核心結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域內(nèi)，所述變體在5位具有丙氨酸殘基(A)、絲氨酸殘基(S)或蘇氨酸殘基(T)；在8位具有苯丙氨酸殘基(F)或酪氨酸殘基(Y)；在9位具有苯丙氨酸殘基(F)、色氨酸殘基(W)或酪氨酸殘基(Y)；在10位具有天冬氨酸殘基(D)；在121位具有天冬氨酸殘基(D)。
背景技術(shù)：
纖維素酶或纖維素分解酶是涉及纖維素水解的酶。在天然纖維素的水解中，已知涉及三種主要類型的纖維素酶，即纖維素生物水解酶(1,4-β-D-葡聚糖纖維素生物水解酶，EC3.2.1.91)、內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶(內(nèi)切1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.4)和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。
尤其是內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶(EC No.3.2.1.4)構(gòu)成了令人關(guān)注的一組用于所述工業(yè)用途的水解酶。內(nèi)切葡聚糖酶催化下列內(nèi)切水解反應(yīng)纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)和地衣淀粉中的1,4-β-D-糖苷鍵，混合的β-1,3葡聚糖(例如谷類β-D-葡聚糖或木葡聚糖)和其他含有纖維素部分的植物材料中的β-1,4鍵。法定名稱為內(nèi)切1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，不過本說明書中使用縮略語內(nèi)切葡聚糖酶?？梢詤⒖糡.-M.Enveri，“微生物纖維素酶”，W.M.Fogarty,《微生物酶與生物技術(shù)》，應(yīng)用科學(xué)出版社，p.183-224(1983)；《酶學(xué)方法》(1988)160卷，p.200-391(Wood,W.A.和Kellogg,S.T.編)；Beguin,P.，“纖維素降解的分子生物學(xué)”，《微生物學(xué)年評》(1990)44卷，pp.219-248；Beguin,P.和Aubert,J-P.，“纖維素的生物學(xué)降解”，《歐洲微生物學(xué)聯(lián)合會微生物學(xué)評論》13(1994)p.25-58；Henrissat,B.，“纖維素酶及其與纖維素的相互作用”，《纖維素》(1994)1卷，pp.169-196。
纖維素酶可由大量微生物和植物合成，這些微生物包括真菌、放線菌、粘液菌和真細(xì)菌。尤其已經(jīng)鑒定了具有各種專一性的內(nèi)切葡聚糖酶。
纖維素分解酶的一個(gè)非常重要的工業(yè)用途是用于纖維素紡織品或織物的處理，例如作為洗滌劑組合物或織物軟化劑組合物的成分；用于新織物的生物拋光(服裝涂飾)；用于獲得含纖維素織物、尤其是斜紋粗棉布的“石洗”樣外觀，并且已經(jīng)提出了若干用于這些處理的方法，例如GB-A-1 368599、EP-A-0307564和EP-A-0435876、WO91/17243、WO 91/10732、WO 91/17244、PCT/DK95/000108和PCT/DK95/00132。纖維素分解酶的另一種重要的工業(yè)用途是用于紙漿的處理，例如用于改進(jìn)排水或回收紙的脫墨。
還已知纖維素酶可以具有或可以不具有一個(gè)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)。CBD能加強(qiáng)酶對含纖維素纖維的結(jié)合，增加酶催化活性部分的功效。
真菌和細(xì)菌產(chǎn)生一系列纖維素分解酶(纖維素酶)，根據(jù)序列的相似性(疏水性聚類分析)，可以分為不同族的糖基水解酶(Henrissat B& Bairoch A；《生物化學(xué)雜志》1993,293:781-788)。目前已知的纖維素酶屬于第5、6、7、8、9、10、12、26、44、45、48、60和61族糖基水解酶。
WO 91/17243、WO 91/17244和WO 91/10732等描述了工業(yè)上有良好表現(xiàn)的內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶，WO 94/07998描述了特異的纖維素酶變體。
本發(fā)明的目的是提供新穎的纖維素分解酶變體，該變體與母體酶比較，表現(xiàn)出改進(jìn)的性能。
發(fā)明概述在可用于工業(yè)生產(chǎn)方法的纖維素分解酶、也就是內(nèi)切1,4-葡聚糖酶中，已經(jīng)鑒定了大量氨基酸殘基的位置，這些位置對酶的性質(zhì)、繼而對其在這些生產(chǎn)方法中的性能都是重要的。
因此，本發(fā)明第一方面提供了通過氨基酸的取代、缺失或插入來改進(jìn)纖維素分解酶性質(zhì)的方法，該方法包括下列步驟a·構(gòu)建至少兩個(gè)氨基酸序列的多重對比，該氨基酸序列已知具有類似于來自Humicola insolens的內(nèi)切葡聚糖酶V(EGV)的三維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫4ENG項(xiàng)可知；b·以EGV結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，構(gòu)建纖維素分解酶的基于同源性的三維結(jié)構(gòu)；c·識別距離底物結(jié)合裂隙不超過5的氨基酸殘基位置；d·識別酶的暴露于表面的氨基酸殘基；e·識別酶的所有帶電或可能帶電的氨基酸殘基位置；f·選擇一個(gè)或幾個(gè)位置，其中的氨基酸殘基將被取代、缺失或?qū)⒉迦氚被釟埢?；g·用常規(guī)的蛋白質(zhì)工程技術(shù)進(jìn)行取代、缺失或插入。
利用本發(fā)明方法，通過本身為已知的蛋白質(zhì)工程方法，將所需性質(zhì)從一種纖維素酶轉(zhuǎn)移到另一種纖維素酶上實(shí)際上現(xiàn)已成為可能。
更具體來說，本發(fā)明提供了纖維素酶變體，該變體關(guān)于下列性質(zhì)得到了改進(jìn)改變(增加或減少)了的催化活性；和/或改變了的對陰離子表面活性劑的敏感性；和/或改變了的pH最優(yōu)值和pH活性曲線以及穩(wěn)定性曲線。
因此在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了一種通過取代、插入和/或缺失的方法而得自母體纖維素酶的纖維素酶變體，該變體具有一個(gè)催化性核心結(jié)構(gòu)域，其中該變體在5位具有丙氨酸殘基(A)、絲氨酸殘基(S)或蘇氨酸殘基(T)；在8位具有苯丙氨酸殘基(F)或酪氨酸殘基(Y)；在9位具有苯丙氨酸殘基(F)、色氨酸殘基(W)或酪氨酸殘基(Y)；在10位具有天冬氨酸殘基(D)；以及在121位具有天冬氨酸殘基(D)(纖維素酶編號方式)。
發(fā)明的詳細(xì)公開纖維素酶變體本發(fā)明提供了通過取代、插入和/或缺失而得自母體纖維素酶的新纖維素酶變體。本發(fā)明的纖維素酶變體是一種纖維素酶變體或變異的纖維素酶，它具有自然界中沒有發(fā)現(xiàn)過的氨基酸序列。本發(fā)明的纖維素酶變體表現(xiàn)出改進(jìn)的性能，特別是增加了催化活性；和/或改變了對陰離子表面活性劑的敏感性；和/或改變了pH最優(yōu)值；和/或改變了耐熱性。
本發(fā)明的纖維素酶變體或變異的纖維素酶可以被正式地看作是母體纖維素酶(也就是天然或野生型酶)的功能衍生物，并且可以通過改變母體基因或其衍生物(能編碼母體酶)的DNA核苷酸序列而獲得。若將編碼纖維素酶變體的DNA核苷酸序列插入適當(dāng)?shù)乃拗魃矬w的適當(dāng)載體，則可以表達(dá)和產(chǎn)生纖維素酶變體或變異的纖維素酶。宿主生物體不必與母體基因來源的生物體相同。
在文獻(xiàn)中，已經(jīng)把酶變體稱為突變體或突變蛋白。
氨基酸本發(fā)明的上下文中，使用下列氨基酸和氨基酸殘基的符號和縮寫A= Ala = 丙氨酸C= Cys = 半胱氨酸D= Asp = 天冬氨酸E= Glu = 谷氨酸F= Phe = 苯丙氨酸G= Gly = 甘氨酸H= His = 組氨酸I= Ile = 異亮氨酸K= Lys = 賴氨酸L= Leu = 亮氨酸
M= Met = 甲硫氨酸N= Asn = 天冬酰胺P= Pro = 脯氨酸Q= Gln = 谷氨酰胺R= Arg = 精氨酸S= Ser = 絲氨酸T= Thr = 蘇氨酸V= Val = 纈氨酸W= Trp = 色氨酸Y= Tyr = 酪氨酸B= Asx = Asp或AsnZ= Glx = Glu或GlnX= Xaa = 任意氨基酸*= 缺失或缺無的氨基酸纖維素酶編號方式在本發(fā)明的上下文中，對纖維素分解酶中氨基酸殘基位置使用特殊的編號方式。如下表1所示，通過對比已知纖維素酶的氨基酸序列，是有可能將一個(gè)氨基酸位置號明確分配給任何纖維素分解酶中的任意氨基酸殘基的，只要它的氨基酸序列是已知的。
下表1中，對比了11種所選擇的不同微生物來源的纖維素酶的氨基酸序列。它們是(a)Humicola insolens；(b)枝頂孢；(c)Volutellacollectotrichoides；(d)糞生糞殼；(e)Thielavia terrestris；(f)尖鐮孢；(g)嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)；(h)Crinipellis scabella；(i)菜豆殼球孢(Macrophomina phaseolina)；(j)熒光假單胞菌；(K)玉蜀黍黑粉菌。WO 96/29397描述了纖維素酶(a-i)，基因庫中入藏號G45498描述了(j)，基因庫中入藏號S81598和《生物化學(xué)》Hoppe-Seyler,1995,376(10):617-625描述了(k)。
使用發(fā)源于得自WO 91/17243等公開的Humicola insolens菌株的、序列列在表1第一列中的纖維素酶(內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶)氨基酸序列的編號系統(tǒng)，和許多其他纖維素酶的氨基酸序列一起對比，就有可能明確指出纖維素分解酶中氨基酸殘基的位置。
在描述按照本發(fā)明產(chǎn)生或預(yù)期產(chǎn)生的不同纖維素酶變體時(shí)，為便于參考，使用下列命名法[原始氨基酸；位置；取代的氨基酸]因此，在119位用組氨酸取代谷氨酰胺記為Q119H。
代表與來自Humicola insolens的纖維素酶氨基酸序列有關(guān)的插入的氨基酸殘基的編號方法是，按字母順序向前一個(gè)纖維素酶編號加入字母，例如，*21aV位代表“插入”的纈氨酸(Ⅴ)，該位點(diǎn)在來自Humicolainsolens纖維素酶的氨基酸序列的21位賴氨酸和22位丙氨酸之間沒有氨基酸存在，參見表1。
來自Humicola insolens的纖維素酶氨基酸序列中49位脯氨酸(P)的缺失記為P49*。
多個(gè)突變由斜線號(“/”)分開，例如Q119H/Q146R，代表119位和146位的突變，其中分別用組氨酸(H)取代谷氨酰胺(Q)和用精氨酸(R)取代谷氨酰胺(Q)。
如果取代是由得自Humicola insolens等菌株的纖維素酶內(nèi)的突變產(chǎn)生的，則將產(chǎn)物記為“Humicola insolens/*49P”。
本申請中由纖維素酶編號方式指代的所有位置均指上述纖維素酶編號，并且相對于得自Humicola insolens的纖維素酶的氨基酸序列而定，參見表1(a)。
表1氨基酸序列對比所選擇的不同微生物來源的纖維素酶的編號方式(a)Humicola insolens；(b)枝頂孢；(c)Volutella collectotrichoides；(d)糞生糞殼；(e)Thielavia terrestris；(f)尖鐮孢；(g)嗜熱毀絲霉；(h)Crinipellis scabella；(i)菜豆殼球孢；(j)熒光假單胞菌；(K)玉蜀黍黑粉菌。
a b c d e f g h i j k1 A G G G G G G T T C *2 D S T S S S I A S N *3 G G G G G G G G G G G4 R H R K Q H Q V V Y M5 S T T S S S T T T A A6 T T T T T T T T T T T7 R R R R R R R R R R R8 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y9 W W W W W W W W W W W10D D D D D D D D D D D11C C C C C C C C C C C12C C C C C C C C C C C13K K K K K K K K K K L14P P P P P P P P P P A15S S S S S S S S S H S16C C C C C C C C C C A17G A G A A S A G A G S18W W W W W W W W W W W19A D D S P S P S T S E20K E E G G G G G G A G21K K K K K K K K K N K21a * * * * * * * * * V *22A A A A A A G A A P A23P A S S A A P S S S P24V V V V V V * V V L V25N S S N S N S S S V Y26Q R Q R Q A S A K S A27P P P P P P P P P P P28V V V V V A V V V L V29F T K L Y L Q R G Q D30S T T A A T A T T S A31C C C C C C C C C C C32N D D D D D D D D S K33A R R A A K K R I A A34N N N N N N N N N N D35F N N N F D D G D N G36Q S N N Q N N N N T V37R P P P R P P T A R T38I L L L L I F L Q L L39T S A N S S N G T S I40D P S D D N D P P D D41F * * A F T G * S V S42D G T N N N G * D S K42a * * * * * * S D L * K43A A A V V A T V L V D44K V R K Q V R K K G P45S S S S S N S S S S S46G G G G G G G G S S G47C C C C C C C C C C Q48E D D D N E D D D D S49P P S * * G A S * * G49a * * * * * * * * * * C49b * * * * * * * * * * N50G N N G G G G G G G G51G G G G G G G G G G G52V V V S S S S T S G N53A A A A A A A S A G K54Y F Y Y Y Y Y F Y Y F55S T T T S A M T Y M M56C C C C C C C C C C C57A N N A A T S A S W S58D D D N D N S N N D C59Q N N N Q Y Q N Q K M60T Q Q S T S S G G I Q61P P P P P P P P P P P62W W W W W W W F W F F63A A A A A A A A A A D64V V V V V V V I V V D65N N N N N N S D N S E66D N D D D D D N D P T67D N N N N E E N S T D68F V L L L L L T L L P69A A A A A A S A S A T70L Y Y Y Y Y Y Y Y Y L71G G G G G G G G G G A72F F F F F F W F F Y F73A A A A A A A A A A G74A A A A A A A A A A F75T T T T T T V A A T G76S A A K S K K H K S A77I F F L I I L L L S F78A P S S A S A A S G T79G G G G G G G G G D T80S G G G G G S S K V G81N N S T S S S S Q * Q82E E E E E E E E E * E83A A A S S A S A T * S84G S S S S S Q A D * D85W W W W W W W W W * T86C C C C C C C C C C D87C C C C C C C C C G C88A A A A A A A Q G R A89C C C C C C C C C C C90Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y F91E A A A A A E E K Q Y92L L L L L L L L L L A93T Q Q T T T T T T Q E94F F F F F F F F F F F95T T T T T T T T T T E95a * * * * * * * * * G *95b * * * * * * * * * S *95c * * * * * * * * * S *95d * * * * * * * * * Y *95e * * * * * * * * * N *95f * * * * * * * * * A *95g * * * * * * * * * P *95h * * * * * * * * * G H95i * * * * * * * * * D D95j * * * * * * * * * P A95k * * * * * * * * * G Q96S S S S S T S S S S G97G G G G G G G G T A K98P P P P P P P P A A A99V V V V V V V V V L M100 A A A S A K A V S A K101 G G G G G G G G G G R102 K K K K K K K K K K N103 K T T T T K K K Q T K104 M M M L M M M L M M L105 V V V V V I I T I I I106 V V V V V V V V V V F107 Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q108 S S S S S S A V I A V109 T T T T T T T T T T T110 S N N S S N N N N N N111 T T T T T T T T T I V112 G G G G G G G G G G G113 G G G G G G G G G Y G114 D D D D D D D D D D D115 L L L L L L L L L V V116 G S S G G G G G G S Q117 S G G S S D D N N G S118 N T N N N N N N N G Q119 H H H H Q H H H H Q N120 F F F F F F F F F F F121 D D D D D D D D D D D122 L I I L I L L L I I F123 N Q L N A M A M A L Q124 I M M M M M I I M V I125 P P P P P P P P P P P126 G G G G G G G G G G G127 G G G G G G G G G G G128 G G G G G G G G G G G129 V L L V V V V V V V L130 G G G G G G G G G G G131 I I I L I I I L I A A132 F F F F F F F F F F F132a * * * * * * * T * * P133 D D D D N D N Q N N K134 G G G G G G A G G A G135 C C C C C C C C C C C136 T T T K S T T P S S P137 P P P R S S D A K A A138 Q Q Q E Q E Q Q Q Q Q139 F F W F F F Y F W W W140 G G G G G G G G N G G140a * F V * * K A S G V V141 G T S G G A P W I S E142 L F F L L L P N * N A143 P P P P P G N G * A S143a * * * * * * G * N E L143b * * * * * * W * L L W144 G G G G G G G G G G G145 Q N N A A A D A N A D146 R R R Q Q Q R Q Q Q Q147 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y148 G G G G G G G G G G G149 G G G G G G G G G G G150 I T T I I I I V F F V150a * * * * * * * * * L *150b * * * * * * * * * A *150c * * * * * * * * * A *150d * * * * * * * * * C *150e * * * * * * * * * K *150f * * * * * * * * * Q *150g * * * * * * * * * Q *150h * * * * * * * * * L *150i * * * * * * * * * G *150j * * * * * * * * * Y *150k * * * * * * * * * N *151 S T T S S S H S T A K152 S S S S S S S S D S S153 R R R R R R K R R L A154 N S S S D S E D S S T155 E Q Q E Q E E Q Q Q E156 C C C C C C C C C Y C157 D A S D D D E S A K S158 R E Q S S S S Q T S K159 F L I F F Y F L L C L160 P P P P P P P P P V P160a * * * * * * * * * L *160b * * * * * * * * * N *160c * * * * * * * * * R *160d * * * * * * * * * C *160e * * * * * * * * * D *160f * * * * * * * * * S *160g * * * * * * * * * V *160h * * * * * * * * * F *160i * * * * * * * * * G *160j * * * * * * * * * S *160k * * * * * * * * * R *160l * * * * * * * * * G *160m * * * * * * * * * L *161 D S S A A E E A S T K162 A V A A P L A A K Q P163 L L L L L L L V W L L164 K R Q K K K K Q Q Q Q165 P D P P P D P A A Q E166 G G G G G G G G S G G167 C C C C C C C C C C C168 Y H N Q Q H N Q N T K169 W W W W W W W F W W W170 R R R R R R R R R F R171 F Y Y F F F F F F A F172 D D D D D D D D D E S173 W W W W W W W W W W E174 F F F F F F F M F F W175 K N N K Q E Q G E E G176 N D D N N N N G N A D177 A A A A A A A A A A N178 D D D D D D D D D D P179 N N N N N N N N N N V180 P P P P P P P P P P L181 S N D E T D S N T S K182 F V V F F F V V V L G183 S N S T T T T T D K S184 F W W F F F F F W Y P185 R R R K Q E Q R E K K186 Q R R Q Q Q E P P E R187 V V V V V V V V V V V188 Q R Q Q Q Q A T T P K189 C C C C C C C C C C C190 P P P P P P P P P P P191 A A A S A K S A Q A K192 E A A E E A E Q E E S193 L L L L I L L L L L L194 V T T T V L T T V T I195 A N D S A D S N A T D196 R R R R R I K I R R R197 T S T T S S S S T S S198 G G G G G G G G G G G199 C C C C C C C C C M C200 R V R K K K S V S N Q201 R R R R R R R R R R R*該位置中沒有氨基酸殘基本發(fā)明的酶(內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶)變體本發(fā)明涉及纖維素酶變體。更具體來說，本發(fā)明提供了通過取代、插入和/或缺失的方法而得自母體纖維素酶的纖維素酶變體，該變體具有一個(gè)催化性核心結(jié)構(gòu)域，在該結(jié)構(gòu)域內(nèi)，所述變體在5位具有丙氨酸殘基(A)、絲氨酸殘基(S)或蘇氨酸殘基(T)；在8位具有苯丙氨酸殘基(F)或酪氨酸殘基(Y)；在9位具有苯丙氨酸殘基(F)、色氨酸殘基(W)或酪氨酸殘基(Y)；在10位具有天冬氨酸殘基(D)；在121位具有天冬氨酸殘基(D)(纖維素酶編號方式)。
本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶可以含有一個(gè)作為酶整體部分而存在的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)，或者來自另一種來源的CBD可以被引入內(nèi)切葡聚糖酶，于是創(chuàng)造出一個(gè)酶雜合體。在本文中，對術(shù)語“纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域”的理解是如下列所定義的Peter Tomme等，“纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域分類與性質(zhì)”，出自《不溶性碳水化合物的酶降解》,John N.Saddler和Michael H.Penner(Eds.),ACS專題論文集系列第618號，1996。該定義將超過120種纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域分為10族(Ⅰ-Ⅹ)，并證明了在不同酶中都發(fā)現(xiàn)有CBD，這些酶例如有纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和殼多糖酶。在藻類中也已發(fā)現(xiàn)有CBD，例如紅藻Porphyra purpurea，這是一種非水解性的多糖結(jié)合蛋白，見Tomme等，出處同上。不過，大多數(shù)CBD來自纖維素酶和木聚糖酶，并發(fā)現(xiàn)CBD位于蛋白質(zhì)的N和C末端，或位于內(nèi)部。酶雜合體是本領(lǐng)域已知的，例如WO 90/00609和WO 95/16782，并且可以通過下述方法制備將含有與編碼內(nèi)切葡聚糖酶的DNA序列通過(或不通過)接頭而連接的編碼纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA至少一個(gè)片段的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，并培養(yǎng)宿主細(xì)胞以表達(dá)融合基因。
酶雜合體可以表述為下式CBD-MR-X或X-MR-CBD其中CBD為氨基酸序列的N末端或C末端區(qū)域，相當(dāng)于至少纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；MR為中間區(qū)域(接頭)，可以是一個(gè)鍵，或者是一個(gè)短的連接基團(tuán)，優(yōu)選為約2至約100個(gè)碳原子，更優(yōu)選為2至40個(gè)碳原子；或者優(yōu)選為約2至約100個(gè)氨基酸，更優(yōu)選為2至40個(gè)氨基酸；X為按照本發(fā)明的酶的N末端或C末端區(qū)域。
本發(fā)明的方法在另一方面，本發(fā)明涉及通過氨基酸取代、缺失或插入來改進(jìn)纖維素分解酶性質(zhì)的方法，該方法包括下列步驟a·構(gòu)建至少兩個(gè)氨基酸序列的多重對比，所述氨基酸序列已知具有類似于來自Humicola insolens的內(nèi)切葡聚糖酶V(EGV)的三維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫4ENG項(xiàng)可知；b·以EGV結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，構(gòu)建纖維素分解酶的基于同源性的三維結(jié)構(gòu)；c·識別距離底物結(jié)合裂隙不超過5的氨基酸殘基位置；d·識別酶的暴露于表面的氨基酸殘基；e·識別酶的所有帶電或可能帶電的氨基酸殘基位置；f·選擇一個(gè)或幾個(gè)位置，其中的氨基酸殘基將被取代、缺失或?qū)⒉迦氚被釟埢籫·用常規(guī)的蛋白質(zhì)工程技術(shù)進(jìn)行取代、缺失或插入。
該方法的步驟f優(yōu)選通過選擇位置進(jìn)行，根據(jù)步驟a的對比結(jié)果，這些位置在諸對比序列中多數(shù)攜帶相同的氨基酸殘基；更優(yōu)選為在至少63％的諸對比序列中攜有相同氨基酸；進(jìn)一步優(yōu)選為在諸對比序列中攜帶不同氨基酸殘基的那些位置，參閱下文。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，纖維素酶的比活性可以得到改進(jìn)，優(yōu)選是通過在一些氨基酸殘基位置進(jìn)行取代、缺失或插入的方法，所述氨基酸殘基距離底物結(jié)合裂隙不超過5，更優(yōu)選為不超過3，進(jìn)一步優(yōu)選為不超過2.5，據(jù)信距離不超過2.5的殘基是能夠與底物進(jìn)行直接接觸的。
在另一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，纖維素酶的pH活性曲線、pH活性最優(yōu)值、pH穩(wěn)定性曲線或pH穩(wěn)定性最優(yōu)值可以被改變，這優(yōu)選是通過在一些氨基酸殘基位置處進(jìn)行取代、缺失或插入而達(dá)到的，這些殘基距離底物結(jié)合裂隙不超過5，更優(yōu)選為不超過3，進(jìn)一步優(yōu)選為不超過2.5，或者是在酶的暴露于表面的氨基酸殘基位置進(jìn)行，從而從局部或整體上改變靜電環(huán)境。優(yōu)選進(jìn)行涉及帶電或可能帶電的殘基的取代，該殘基是原始的殘基或取代的殘基。在本文中，帶電或可能帶電的殘基包括Arg、Lys、His、Cys(如果不是二硫橋部分)、Tyr、Glu、Asp。
在另一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，纖維素酶在陰離子表面活性劑或陰離子洗滌劑成分存在下的穩(wěn)定性可以得到改變，這優(yōu)選是通過在酶的暴露于表面的氨基酸殘基位置進(jìn)行取代、缺失或插入從而從局部或整體上改變靜電環(huán)境而達(dá)到的。優(yōu)選進(jìn)行涉及帶電或可能帶電的殘基的取代，該殘基是原始的殘基或取代的殘基均可。在本文中，帶電或可能帶電的殘基包括Arg、Lys、His、Cys(如果不是二硫橋部分)、Tyr、Glu、Asp。朝向帶更多負(fù)電的氨基酸殘基的突變導(dǎo)致纖維素酶在存在陰離子表面活性劑時(shí)的穩(wěn)定性得到改進(jìn)，而朝向帶更多正電的氨基酸殘基的突變會降低纖維素酶對陰離子表面活性劑的穩(wěn)定性。
而且，含有本文公開的任意兩種或多種氨基酸取代、缺失或插入組合的纖維素酶變體也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)，參閱舉例說明的諸變體。
纖維素酶的多序列對比用堆積算法進(jìn)行多序列對比，該算法在威斯康星序列分析軟件包8.1版-UNIX(GCG，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)集團(tuán)公司)中執(zhí)行。所用方法類似于Higgens和Sharp所述的方法(《CARBIOS》1989 5 151-153)。間距產(chǎn)生罰分為3.0，間距延長罰分為0.1，同時(shí)使用如《核酸研究》1986 14(16):6745-6763的計(jì)分矩陣(Dayhoff表(Schwartz,R.M.和Dayhoff,M.O.；《蛋白質(zhì)序列與結(jié)構(gòu)圖譜》(Dayhoff,M.O.編)；國家生物醫(yī)學(xué)研究基金，華盛頓特區(qū)1979 353-358)，并進(jìn)行如下重新調(diào)整，即將每個(gè)值除以其行與列的和，并使其達(dá)到平均值為0、標(biāo)準(zhǔn)離差為1.0的規(guī)格。FY(Phe-Tyr)值=RW=1.425。精確匹配設(shè)為1.5，任何行上沒有匹配好于精確匹配)。
纖維素酶的成對序列對比用Needleman & Wunsch(《分子生物學(xué)雜志》，1970,48:443-453)所述的算法進(jìn)行成對序列對比，以GAP途徑在威斯康星序列分析軟件包(GCG)中執(zhí)行。用于GAP途徑的參數(shù)與上文堆積算法所述相同。
強(qiáng)制配對的纖維素酶的成對序列對比用Needleman & Wunsch(《分子生物學(xué)雜志》,1970,48:443-453)所述的算法進(jìn)行殘基強(qiáng)制配對的成對序列對比，以GAP途徑在威斯康星序列分析軟件包(GCG)中執(zhí)行。用于GAP途徑的參數(shù)與上文堆積算法所述相同，其中計(jì)分矩陣修改為加入一個(gè)名為X的殘基，該符號表示待配對的殘基。X與X配對的對角線值設(shè)為9.0，所有涉及X的對角線以外的值設(shè)為0。
Humicola insolens內(nèi)切葡聚糖酶與纖維七糖之間的復(fù)合體根據(jù)與纖維六糖復(fù)合的Humicola insolens EGV內(nèi)切葡聚糖酶無活性變體(D10N)的核心結(jié)構(gòu)域的X射線結(jié)構(gòu)(Davies等，《生物化學(xué)》，1995,34:16210-12220,PDB第4ENG項(xiàng))，用下列步驟建立與纖維七糖復(fù)合的天然Humicola insolens EGV內(nèi)切葡聚糖酶核心結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)模型1·使用Insight Ⅱ 95.0的生物聚合物模塊(Insight Ⅱ 95.0用戶指南，1995年10月，San Diego:Biosym/MSI,1995)，用天冬氨酸取代N10。
2·通過復(fù)制整個(gè)分子制作占據(jù)亞部位-3的糖單元拷貝，并刪除額外的原子。手工移動(dòng)新的糖單元使其最適合未占據(jù)的-1結(jié)合部位。制作鍵以將新的糖單元與兩個(gè)現(xiàn)有纖維三糖單元鍵合。
3·缺失掉重疊的晶體水分子。它們是用Subset Interface By Atom2.5命令識別的。
4·在pH8.0下應(yīng)用帶電的末端建立氫。
5·用Residue Replace＜D121 residue name＞ASP L命令使D121質(zhì)子化。
6·通過Potentials Fix命令應(yīng)用CVFF力場模板(forcefieldtemplate)。
7·固定除新的糖單元以外的所有原子。
8·利用分子力學(xué)程序Discover 95.0/3.0.1(Discover 95.0/3.0.0用戶指南，1995年10月，San Diego:Biosym/MSI,1995)，用300次簡單能量最小化循環(huán)，隨后用5000步1fs簡單分子動(dòng)力學(xué)，最后用300次簡單能量最小化循環(huán)，使新糖單元的原子位置弛豫。
纖維素酶的同源性建立根據(jù)Humicola insolens EGV纖維素酶的已知X射線結(jié)構(gòu)構(gòu)建具有已知氨基酸序列的纖維素酶的結(jié)構(gòu)模型，整個(gè)過程由下列步驟組成1·根據(jù)多種已知工業(yè)上有用的纖維素酶序列中的多序列對比，限定待做模型的結(jié)構(gòu)核心區(qū)域的近似范圍和半胱氨酸的排布。
2·對新序列與具有已知X射線結(jié)構(gòu)的序列進(jìn)行成對序列對比。
3·根據(jù)序列對比定義結(jié)構(gòu)保守的區(qū)域(SCR)。
4·在SCR內(nèi)為模型結(jié)構(gòu)指定坐標(biāo)。
5·通過檢索環(huán)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，在SCR之間找出環(huán)或可變區(qū)域(VR)的結(jié)構(gòu)。
6·由數(shù)據(jù)檢索結(jié)果，為模型結(jié)構(gòu)中的VR指定坐標(biāo)。
7·生成二硫鍵，設(shè)置質(zhì)子化狀態(tài)。
8·用分子力學(xué)改善所建立的結(jié)構(gòu)。
Humicola insolens EGV纖維素酶的已知X射線結(jié)構(gòu)將在下文中稱為參考結(jié)構(gòu)。待做模型的結(jié)構(gòu)將被稱為模型結(jié)構(gòu)。
Ad1酶核心部分的近似范圍是由包括多種已知纖維素酶序列的多序列對比確定的。由于參考結(jié)構(gòu)僅含有酶核心部分的原子坐標(biāo)，因此在模型的建立中只能包括待做模型的序列中與參考結(jié)構(gòu)核心部分排布在一起的殘基。這種排布也確定了半胱氨酸的排布。如上所述，用堆積算法進(jìn)行多序列對比。
Ad2如上所述進(jìn)行成對序列對比。如果保守二硫橋中的半胱氨酸和/或活性位點(diǎn)殘基(D10和D121)不能排布，則如上所述，用保守二硫橋中的半胱氨酸和/或活性位點(diǎn)殘基的強(qiáng)制配對進(jìn)行成對序列對比。序列對比的主要目的是定義用于模型結(jié)構(gòu)生成的SCR(見后)。
Ad3根據(jù)序列對比，結(jié)構(gòu)保守的區(qū)域(SCR)定義為沒有插入或缺失的重疊序列的連續(xù)區(qū)域。
Ad4用計(jì)算機(jī)程序Homology 95.0(Homology用戶指南，1995年10月，San Diego:Biosym/MSI,1995)，通過AssignCoords Sequences命令，能夠從參考結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)生成模型結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)。
Ad5用計(jì)算機(jī)程序Homology 95.0，通過檢索包含在Homology95.0中的環(huán)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，找到剩余區(qū)域即可變區(qū)域(VR)的可能構(gòu)象。對每個(gè)VR進(jìn)行該過程。
Ad6如果VR長度小于六個(gè)殘基，選擇數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果中的第一個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)來生成坐標(biāo)。在生成更長環(huán)的情況下，選擇列表中沒有嚴(yán)重原子重疊的第一個(gè)解決方案?？梢杂糜?jì)算機(jī)程序InsightⅡ 95.0(InsightⅡ95.0用戶指南，1995年10月，San Diego:Biosym/MSI,1995)中的BumpMonitor Add Intra命令分析原子重疊的程度，碰撞命令參數(shù)為0.25時(shí)說明嚴(yán)重重疊。如果在插入的環(huán)區(qū)域和蛋白質(zhì)的剩余部分之間存在十個(gè)以上碰撞，則試驗(yàn)下一個(gè)解決方案。如果用這些參數(shù)沒有找到解決方案，就選擇碰撞數(shù)最少的解決方案。用Homology 95.0程序中的AssignCoords Loops命令生成VR區(qū)域坐標(biāo)。
Ad7用Insight Ⅱ 95.0的生物聚合物模塊中的Bond Create命令生成二硫鍵，用Hydrogens命令設(shè)置質(zhì)子化狀態(tài)以便pH8.0與帶電帽匹配。最后，用residue replace＜D121 residue name＞ASP L命令將活性質(zhì)子供體(等價(jià)于參考結(jié)構(gòu)中D121的殘基)質(zhì)子化。為了完成模型數(shù)據(jù)，通過Potentials Fix命令用CVFF力場(forcefield)應(yīng)用適當(dāng)?shù)牧瞿０濉?br> Ad8最后，用分子力學(xué)程序Discover 95.0/3.0.1 (Discover95.0/3.0.0用戶指南，1995年10月，San Diego:Biosym/MSI,1995)，對模型結(jié)構(gòu)進(jìn)行500次能量最小化循環(huán)?；谂cHumicola insolens EGV纖維素酶的序列同源性，上述過程的結(jié)果是描述新纖維素酶核心結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)模型的原子坐標(biāo)。
纖維素酶結(jié)構(gòu)的重疊為了重疊兩種纖維素酶結(jié)構(gòu)，用Homology95.0(Homology用戶指南，1995年10月，San Diego:Biosym/MSI,1995)的StructureAlignment命令進(jìn)行結(jié)構(gòu)的重疊。命令的所有參數(shù)均選擇缺席值。
距離底物3和5內(nèi)的殘基的測定為了測定位于底物特定距離內(nèi)的氨基酸殘基，將一種給定的纖維素酶結(jié)構(gòu)重疊于如上所述的Humicola insolens EGV內(nèi)切葡聚糖酶與纖維七糖之間的復(fù)合體的模型結(jié)構(gòu)內(nèi)纖維素酶部分。然后用Insight Ⅱ 95.0(Insight Ⅱ 95.0用戶指南，1995年10月，San Diego:Biosym/MSI,1995)的Interface Subset命令找到位于底物特定距離內(nèi)的殘基。將特定距離作為參數(shù)提供給程序。
該測定結(jié)果列在下表2和3中。
表面可及性的測定為了測定溶劑可及性，使用Homology 95.0(Homology用戶指南，1995年10月，San Diego:Biosym/MSI,1995)中的Access_Surf命令。該程序使用了由Lee和Richards提出的定義(Lee,B.& Richards,F.M.“蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的翻譯靜態(tài)可及性的估定”，《分子生物學(xué)雜志》1971 55 379-400)。使用1.4的溶劑探針半徑，計(jì)算中僅包括了重原子(也就是非氫原子)。具有零可及性的殘基定義為埋藏殘基，所有其他殘基定義為暴露于溶劑中，位于酶結(jié)構(gòu)表面。
纖維素酶之間比活性的轉(zhuǎn)移水平為了轉(zhuǎn)移兩種纖維素酶之間的催化活性水平，用上述方法應(yīng)用下列方案。該方法突出了引起比活性差異的氨基酸殘基，為了從對比纖維素酶轉(zhuǎn)移比活性水平，序列內(nèi)一個(gè)或幾個(gè)這些氨基酸殘基必須被取代1)進(jìn)行所有已知的工業(yè)上有用的纖維素酶(Trichoderma reesei纖維素酶除外)的多序列對比。從這一鑒定，識別所涉及的兩種序列和Humicola insolens EGV纖維素酶序列之間的保守二硫橋，定位活性位點(diǎn)殘基(D10和D121)；2)將每一序列與Humicola insolens EGV纖維素酶核心結(jié)構(gòu)域(殘基1-201)進(jìn)行成對序列對比。如果保守的二硫橋中的半胱氨酸在相同位置沒有排布，和/或如果兩個(gè)活性位點(diǎn)殘基(D10和D121)在相同位置沒有排布，那么用強(qiáng)制配對方法進(jìn)行纖維素酶的配對序列對比。僅包括諸序列中與Humicola insolens EGV纖維素酶核心結(jié)構(gòu)域(殘基1-201)重疊的各殘基；3)構(gòu)造每個(gè)序列的基于同源性的結(jié)構(gòu)；4)測定每個(gè)基于同源性的結(jié)構(gòu)中位于距離底物3內(nèi)的殘基。在這些位置處序列之間的差異最可能是引起比活性差異的殘基。若在上述距離內(nèi)的任何序列中發(fā)現(xiàn)插入片段形式的殘基，則可能是整個(gè)插入片段引起比活性的差異，并且必須將整個(gè)插入片段轉(zhuǎn)移到?jīng)]有該插入片段的序列中，或者必須在具有該插入片段的序列中缺失掉整個(gè)插入片段；5)如果距離底物3內(nèi)的殘基的取代沒有恢復(fù)所有比活性，測定每個(gè)基于同源性的結(jié)構(gòu)中距離底物5內(nèi)的殘基將揭示最可能引起比活性剩余差異的殘基。若在任何序列中于上述距離內(nèi)找到插入片段形式的殘基，則可能是整個(gè)插入片段引起比活性的差異，并且整個(gè)插入片段必須轉(zhuǎn)移到?jīng)]有該插入片段的序列中，或者必須從具有該插入片段的序列中缺失掉整個(gè)插入片段。
在纖維素酶之間轉(zhuǎn)移對陰離子表面活性劑的穩(wěn)定性水平為了在兩種纖維素酶之間轉(zhuǎn)移對陰離子表面活性劑的穩(wěn)定性水平，用上述方法應(yīng)用下列方案。該方法突出了引起對陰離子表面活性劑穩(wěn)定性水平差異的氨基酸殘基，為了從對比纖維素酶轉(zhuǎn)移比活性水平，必須在一種序列中取代一個(gè)或幾個(gè)這些氨基酸殘基1)進(jìn)行所有已知的工業(yè)上有用的纖維素酶(Trichoderma reesei纖維素酶除外)的多序列對比。由此鑒定出所涉及的兩種序列與Humicolainsolens EGV纖維素酶序列之間保守的二硫橋，定位活性位點(diǎn)殘基(D10和D121)；2)將每一序列與Humicola insolens EGV纖維素酶核心結(jié)構(gòu)域(殘基1-201)進(jìn)行成對序列對比。如果保守二硫橋中的半胱氨酸在相同位置沒有排布，和/或如果兩個(gè)活性位點(diǎn)殘基(D10和D121)在相同位置沒有排布，那么用強(qiáng)制配對方法進(jìn)行纖維素酶的配對序列對比。僅包括諸序列中與Humicola insolens EGV纖維素酶核心結(jié)構(gòu)域(殘基1-201)重疊的各殘基；3)構(gòu)造每個(gè)序列的基于同源性的結(jié)構(gòu)；4)測定位于酶表面的殘基。通過計(jì)算表面可及性可做到這一點(diǎn)。具有大于0.02的表面可及性的殘基即暴露于表面；5)屬于下列氨基酸組D、E、H、K、R和C(如果不參與二硫橋的話)的暴露于表面的任一殘基，若在兩個(gè)序列之間不同，則最可能是它引起對陰離子表面活性劑穩(wěn)定性水平的差異。若在任何序列中發(fā)現(xiàn)上述氨基酸類型組內(nèi)殘基以插入片段形式存在，則可能是整個(gè)插入片段引起對陰離子表面活性劑的穩(wěn)定性水平的差異，并且必須將整個(gè)插入片段轉(zhuǎn)移到?jīng)]有該插入片段的序列中，或者必須從具有該插入片段的序列中缺失掉整個(gè)插入片段。
二硫橋二硫橋(也就是Cys-Cys橋)對酶結(jié)構(gòu)起到穩(wěn)定作用。據(jù)信一定量的穩(wěn)定性二硫橋?qū)Ρ３衷撁高m當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性來說是必需的。不過，預(yù)期也能夠從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中除去二硫橋，產(chǎn)生較不穩(wěn)定、尤其是較不耐熱、但仍具有顯著活性的酶變體。
因此在另一方面，本發(fā)明提供了一種纖維素酶變體，該變體具有下列二硫橋中的4個(gè)或更多個(gè)C11-C135；C12-C47；C16-C86；C31-C56；C87-C199；C89-C189和C156-C167(纖維素酶編號方式)。在一個(gè)更明確的實(shí)施方案中，本發(fā)明變體具有下列二硫橋中的5個(gè)或更多個(gè)C11-C135；C12-C47；C16-C86；C31-C56；C87-C199；C89-C189和C156-C167(纖維素酶編號方式)。在最明確的實(shí)施方案中，本發(fā)明變體具有下列二硫橋中的6個(gè)或更多個(gè)C11-C135；C12-C47；C16-C86；C31-C56；C87-C199；C89-C189和C156-C167(纖維素酶編號方式)。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種纖維素酶變體，其中在16、86、87、89、189和/或199位(纖維素酶編號方式)中的一處或多處，半胱氨酸已被另一種天然氨基酸取代。
結(jié)合裂隙取代在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了通過在位于底物結(jié)合裂隙內(nèi)的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基處進(jìn)行取代、插入和/或缺失而得自母體纖維素酶的纖維素酶變體。在靠近底物的位置引入的突變會影響酶-底物相互作用性的結(jié)合。
測定結(jié)構(gòu)中與可能的底物發(fā)生相互作用的殘基的一種適當(dāng)方式是將該結(jié)構(gòu)分配在“殼”中。殼的定義是第1個(gè)殼是直接與底物發(fā)生相互作用即底物與殘基(均包括氫原子)之間的最小原子間距離小于2.5的殘基，這將包括經(jīng)由氫鍵與其他非鍵性相互作用在內(nèi)的所有直接相互作用。接下來的(第2個(gè)、第3個(gè)等)殼的定義方式相同，是到底物或所有前面決定下來的殼的原子間距離小于2.5的殘基。這樣就可以將結(jié)構(gòu)分配在殼中。可用程序Insight Ⅱ 95.0(Insight Ⅱ 95.0用戶指南，1995年10月，San Diego:Biosym/MSI,1995)中的“subset zone”途徑來測定殼。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，按照本發(fā)明預(yù)期的氨基酸殘基位于底物結(jié)合裂隙中距離底物不超過5的位置。
當(dāng)對對比的纖維素酶進(jìn)行上文所公開的計(jì)算機(jī)模型方法處理時(shí)，揭示出下述位置在距離底物不超過5處 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、19、20、21、21a、42、44、45、47、48、49、49a、49b、74、82、95j、110、111、112、113、114、115、116、119、121、123、127、128、129、130、131、132、132a、133、145、146、147、148、149、150b、178和/或179(纖維素酶編號方式)，參見表2。
因此，在一個(gè)更明確的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過在一個(gè)或幾個(gè)這些氨基酸殘基進(jìn)行取代、插入和/或缺失而得自母體纖維素酶的纖維素酶變體。在一種具體的實(shí)施方案中，纖維素酶變體是由表2中識別的纖維素酶之一((a)Humicola insolens；(b)枝頂孢；(c)Volutellacollectotrichoides；(d)糞生糞殼；(e)Thielavia terrestris；(f)尖鐮孢；(g)嗜熱毀絲霉；(h)Crinipellis scabella；(i)菜豆殼球孢；(j)熒光假單胞菌；(K)玉蜀黍黑粉菌)，通過在表2中識別的這些纖維素酶的一處或幾處位置進(jìn)行取代、插入和/或缺失而衍生得到的。
表2距離底物小于5的氨基酸殘基由纖維素酶編號方式識別的位置(a)Humicola insolens；(b)枝頂孢；(c)Volutella collectotrichoides；(d)糞生糞殼；(e)Thielavia terrestris；(f)尖鐮孢；(g)嗜熱毀絲霉；(h)Crinipellis scabella；(i)菜豆殼球孢；(j)熒光假單胞菌；(K)玉蜀黍黑粉菌。
a b c d e f q h i j k4 Y5 S T T S S S T T T A A6 T T T T T T T T T T T7 R R R R R R R R R R R8 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y9 W W W W W W W W W W W10 D D D D D D D D D D D11 C12C C C C C C C C C C C13K K K K K K K K K K L14P P P P P P P P P P A15S S S S S S S S S H S16 C18W W W W W W W W W W W19A D D S P S P S T E20K E E G G G A21K K K K K K K K K K21a V42 G T D44 V R K Q V RG45S S S S S N S S S S47C C C C C C C C C C48E D D D N E D D D D S49 P49a C49b N74A A A A A A A A A A F82E E E E E E E E E95j P110 S N N S S N N N N N N111 T T T T T T T T T I V112 G G G G G G G G G G G113 G G G G G G G G G Y G114 D D D D D D D D D D D115 L L L L L L L L L V V116 G119 H H H H Q H H H H Q N121 D D D D D D D D D D D123 Q127 G G G G G G G G G G G128 G G G G G G G G G G G129 V L L V V V V V V V L130 G G G G G G G G G G G131 I I I L I I I L I A A132 F F F F F F F F F F F132a TP133 N N145 A D146 R R R Q Q Q R Q Q Q Q147 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y148 G G G G G G G G G G G149 GG G GG150b A178 D D D D D D D D D D P179 N N N N N N N N N N V在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，按照本發(fā)明預(yù)期的氨基酸殘基位于底物結(jié)合裂隙中距離底物不超過3。
在對對比的纖維素酶進(jìn)行上文所公開的計(jì)算機(jī)模型方法處理時(shí)，揭示了距離底物不超過3的下列位置6、7、8、10、12、13、14、15、18、20、21、45、48、74、110、111、112、113、114、115、119、121、127、128、129、130、131、132、132a、146、147、148、150b、178和/或179(纖維素酶編號方式)，參見表3。
因此，在一個(gè)更明確的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種通過在這些氨基酸殘基的一個(gè)或幾個(gè)進(jìn)行取代、插入和/或缺失而得自母體纖維素酶的纖維素酶變體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，纖維素酶變體是由表3中識別的纖維素酶之一((a)Humicola insolens；(b)枝頂孢；(c)Volutellacollectotrichoides；(d)糞生糞殼；(e)Thielavia terrestris；(f)尖鐮孢；(g)嗜熱毀絲霉；(h)Crinipellis scabella；(i)菜豆殼球孢；(j)熒光假單胞菌；(k)玉蜀黍黑粉菌)，通過在表3中識別的這些纖維素酶的一處或幾處位置進(jìn)行取代、插入和/或缺失而衍生得到的。
表3距離底物小于3的氨基酸殘基由纖維素酶編號方式識別的位置(a)Humicola insolens；(b)枝頂孢；(c)Volutella collectotrichoides；(d)糞生糞殼；(e)Thielavia terrestris；(f)尖鐮孢；(g)嗜熱毀絲霉；(h)Crinipellis scabella；(i)菜豆殼球孢；(j)熒光假單胞菌；(k)玉蜀黍黑粉菌。
a b c d e f g h i j k6 T T T T T T T T T T T7 R R R R R R R R R R R8 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y10D D D D D D D D D D12C C C C C C C C C C C13K K K K KK L14 PP P P P P A15S S S S S S S S S H S18W W W W W W W W W W W20 E E21KK45S S S S S N S S S S S48 DN E DD74AA A A A A A F110 N N S N N N N N N111 T T T T T T T T T112 G G G G G G G G G G G113 G G G G G G Y G114 D D D D D D D D D D D115 L L L L L L L L L V V119 H H H Q H H Q121 D D D D D D D D D D D127 GG G G G G128 GG G G G G G G129 V L L V V V V V V V L130 G G G G G G G G G G G131 I I I L I I I L I A A132 F F F F F F F F F F F132a TP146 QQ Q Q147 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y148 G G G G G G G G G G G150b A178 D D D D D D P179 N N N N N N N N N N部分保守的氨基酸殘基如本文所定義，“部分保守的氨基酸殘基”是按照表1識別的某個(gè)位置上的氨基酸殘基，在所述位置上，表1所示指示該位置的11個(gè)殘基中有7至10個(gè)氨基酸殘基(也就是超過63％)是相同的。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種纖維素酶變體，在該變體中，在按照表1的一處或幾處位置氨基酸殘基已經(jīng)變?yōu)楸Ｊ氐陌被釟埢谒鑫恢蒙?，?中識別的11個(gè)殘基中的7至10個(gè)氨基酸殘基是相同的。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種通過在下列位置中的一個(gè)或幾個(gè)進(jìn)行取代、插入和/或缺失而得自母體纖維素酶的纖維素酶變體13、14、15、20、21、22、24、28、32、34、45、48、50、53、54、62、63、64、65、66、68、69、70、71、72、73、74、75、79、85、88、90、92、93、95、96、97、98、99、104、106、110、111、113、115、116、118、119、131、134、138、140、146、152、153、163、166、169、170、171、172、173、174、174、177、178、179、180、193、196和/或197(纖維素酶編號方式)。
在一種更明確的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種已經(jīng)過取代、插入和/或缺失的纖維素酶變體，以使其在下表4中識別的位置含有諸氨基酸殘基中的一個(gè)或幾個(gè)。表4中的位置反映出結(jié)合裂隙中距離底物不超過5范圍內(nèi)存在的“部分保守的氨基酸殘基位置”以及非保守的位置，所有位置確實(shí)存在于表1中的對比序列中。
表4選擇的取代、插入和/或缺失由纖維素酶編號方式識別的位置位置 氨基酸殘基4 R,H,K,Q,V,Y,M5 S,T,A13 K,L14 P,A15 H,S16 C,A19 A,D,S,P,T,E20 A,E,G,K21 K,N21a V,*22 A,G,P24 *,L,V28 A,L,V32 D,K,N,S34 D,N38 F,I,L,Q42 D,G,T,N,S,K,*44 K,V,R,Q,G,P45 N,S46 G,S47 C,Q48 D,E,N,S49 P,S,A,G,*49a C,*49b N,*50 G,N53 A,G,K,S54 F,Y62 F,W63 A,D
64 D,I V65 D,E,N,S66 D,N,P,T68 F,L,P,T,V69 A,S,T70 L,Y71 A,G72 F,W,Y73 A,G74 A,F75 A,G,T,V79 G,T82 E,*88 A,G,Q,R90 F,Y92 A,L93 E,Q,T95 E,T95j P,*96 S,T97 A,G,T98 A,P99 L,V104 L,M106 F,V110 N,S111 I,T,V113 G,Y115 L,V116 G,Q,S118 G,N,Q,T119 H,N,Q129 L,V131 A,I,L132 A,P,T,*133 D,K,N,Q134 A,G138 E,Q145 A,D,N,Q146 Q,R150bA,*152 D,S153 A,K,L,R163 L,V,W166 G,S169 F,W170 F,R171 A,F,Y172 D,E,S173 E,W174 F,M,W177 A,N178 D,P179 N,V180 L,P193 I,L196 I,K,R197 S,T
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過如下表5-6所示在一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基處進(jìn)行取代、插入和/或缺失而得自母體纖維素酶的一種纖維素酶變體。該纖維素酶變體可以得自在所示位置具有所述氨基酸殘基的任意母體纖維素酶。特別是該母體纖維素酶可以是Humicola insolens纖維素酶；枝頂孢纖維素酶；Volutellacollectotrichoides纖維素酶；糞生糞殼纖維素酶；Thielavia terrestris纖維素酶；尖鐮孢纖維素酶；嗜熱毀絲霉纖維素酶；Crinipellisscabella纖維素酶；菜豆殼球孢纖維素酶；熒光假單胞菌纖維素酶；或玉蜀黍黑粉菌纖維素酶。
而且，該纖維素酶變體的特征可能在于性能得到改進(jìn)，特別是關(guān)于1·定義為催化活性增加的改進(jìn)性能；2·改變了的對陰離子表面活性劑的敏感性；和/或3·改變了的pH最優(yōu)值；也如表5-6所示。表5中列出的位置反映出在表1中對比的不同纖維素酶之間的性質(zhì)轉(zhuǎn)移。表6中列出的位置反映出從Humicolainsolens EGV向表1中對比的其他纖維素酶的性質(zhì)轉(zhuǎn)移。
表5優(yōu)選的纖維素酶變體由纖維素酶編號方式識別的位置K13L,L13K(1,2,3)；P14A,A14P(1)；S15H,H15S(1,3)；K20E,K20G,K20A,E20K,G20K,A20K,E20G,E20A,G20E,A20E,G20A,A20G(1,2,3)；K21N,N21K(1,2,3)；A22G,A22P,G22A,P22A,G22P,P22G(1)；V24*,V24L,*24V,L24V,*24L,L24*(1)；V28A,V28L,A28V,L28V,A28L,L28A(1)；N32D,N32S,N32K,D32N,S32N,K32N,D32S,D32K,S32D,K32D,S32K,K32S(2,3)；N34D,D34N(2)；I38L,I38F,I38Q,L38I,F38I,Q38I,L38F,L38Q,F38L,Q38L,F38Q,Q38F(1)S45N,N45S(1)；G46S,S46G(1)；E48D,E48N,D48E,N48E,D48N,N48D(1,2,3)；G50N,N50G(1)；A53S,A53G,A53K,S53A,G53A,K53A,S53G,S53K,G53S,K53S,G53K,K53G(1)；Y54F,F54Y(1,3)；W62F,F62W(1,2)；A63D,D63A(2,3)；V64I,V64D,I64V,D64V,I64D,D64I(2)；N65S,N65D,N65E,S65N,D65N,E65N,S65D,S65E,D65S,E65S,D65E,E65D(2)；D66N,D66P,D66T,N66D,P66D,T66D,N66P,N66T,P66N,T66N,P66T,T66P(2,3)；F68V,F68L,F68T,F68P,V68F,L68F,T68F,P68F,V68L,V68T,V68P,L68V,T68V,P68V,L68T,L68P,T68L,P68L,T68P,P68T(1,2)；A69S,A69T,S69A,T69A,S69T,T69S(1)；L70Y,Y70L(1)；G71A,A71G(1)；F72W,F72Y,W72F,Y72F,W72Y,Y72W(1)；A73G,G73A(1)；A74F,F74A(1)；T75V,T75A,T75G,V75T,A75T,G75T,V75A,V75G,A75V,G75V,A75G,G75A(1)；G79T,T79G(1)；W85T,T85W(1)；A88Q,A88G,A88R,Q88A,G88A,R88A,Q88G,Q88R,G88Q,R88Q,G88R,R88G(1,2,3)；Y90F,F90Y(1)；L92A,A92L(1)；T93Q,T93E,Q93T,E93T,Q93E,E93Q(2)；T95E,E95T(2)；S96T,T96S(1)；G97T,G97A,T97G,A97G,T97A,A97T(1)；P98A,A98P(1)；V99L,L99V(1)；M104L,L104M(1)；V106F,F106V(1,3)；S110N,N110S(1)；T111I,T111V,I111T,V111T,I111V,V111I(1)；G113Y,Y113G(1,3)；L115V,V115L(1)；G116S,G116Q,S116G,Q116G,S116Q,Q116S(1)；N118T,N118G,N118Q,T118N,G118N,Q118N,T118G,T118Q,G118T,Q118T,G118Q,Q118G(1)；H119Q,H119N,Q119H,N119H(1,2)；V129L,L129V(1)；I131L,I131A,L131I,A131I,L131A,A131L(1)；G134A,A134G(1)；Q138E,E138Q(1,2,3)；G140N,N140G(1)；R146Q,Q146R(1,2,3)；S152D,D152S(2)；R153K,R153L,R153A,K153R,L153R,A153R,K153L,K153A,L153K,A153K,L153A,A153L(2)；L163V,L163W,V163L,W163L,V163W,W163V(1)；G166S,S166G(1)；W169F,F169W(1)；R170F,F170R(1,2,3)；F171Y,F171A,Y171F,A171F,Y171A,A171Y(1)；D172E,D172S,E172D,S172D,E172S,S172E(2)；W173E,E173W(1,2,3)；F174M,F174W,M174F,W174F,M174W,W174M(1)；A177N,N177A(1)；D178P,P178D(1,2,3)；N179V,V179N(1)；P180L,L180P(1)；L193I,I193L(1)；R196I,R196K,I196R,K196R,I196K,K196I(2,3)；T197S,S197T(1)表6優(yōu)選的纖維素酶變體由纖維素酶編號方式識別的位置L13K(1,2,3)；A14P(1)；H15S(1,3)；E20K,G20K,A20K(1,2,3)；N21K(1,2,3)；G22A,P22A(1)；*24V,L24V(1)；A28V,L28V(1)；D32N,S32N,K32N(2,3)；D34N(2)；L38I,F38I,Q38I(1)；N45S(1)；S46G(1)；D48E,N48E(1,2,3)；N50G(1)；S53A,G53A,K53A(1)；F54Y(1,3)；F62W(1,2)；D63A(2,3)；I64V,D64V(2)；S65N,D65N,E65N(2)N66D,P66D,T66D(2,3)；V68F,L68F,T68F,P68F(1,2)；S69A,T69A(1)Y70L(1)A71G(1)W72F,Y72F(1)G73A(1)F74A(1)V75T,A75T,G75T(1)T79G(1)；T85W(1)；Q88A,G88A,R88A(1,2,3)F90Y(1)A92L(1)Q93T,E93T(2)；E95T(2)；T96S(1)；T97G,A97G(1)；A98P(1)；L99V(1)；L104M(1)；F106V(1,3)；N110S(1)；I111T,V111T(1)；Y113G(1,3)；V115L(1)；S116G,Q116G(1)；T118N,G118N,Q118N(1)；Q119H,N119H(1,2)；L129V(1)；L131I,A131I(1)；A134G(1)；E138Q(1,2,3)；N140G(1)；Q146R(1,2,3)；D152S(2)；K153R,L153R,A153R(2)；V163L,W163L(1)；S166G(1)；F169W(1)；F170R(1,2,3)；Y171F,A171F(1)；E172D,S172D(2)；E173W(1,2,3)；M174F,W174F(1)；N177A(1)；P178D(1,2,3)；V179N(1)；L180P(1)；I193L(1)；I196R,K196R(2,3)；S197T(1)改變了的對陰離子表面活性劑的敏感性如上所述，陰離子表面活性劑是經(jīng)常用來添加到洗滌劑組合物中的產(chǎn)品。有時(shí)候需要對陰離子表面活性劑穩(wěn)定性高的纖維素分解酶，而有時(shí)候偏愛敏感性高的纖維素分解酶。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了對陰離子表面活性劑的敏感性有所改變的纖維素酶變體。
因此，對陰離子表面活性劑的敏感性有所改變的本發(fā)明纖維素酶變體是通過在下列位置中的一處或幾處進(jìn)行取代、插入和/或缺失而得自母體纖維素酶的纖維素酶變體2、4、7、8、10、13、15、19、20、21、25、26、29、32、33、34、35、37、40、42、42a、43、44、48、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、70、72、76、79、80、82、84、86、88、90、91、93、95、95d、95h、95j、97、100、101、102、103、113、114、117、119、121、133、136、137、138、139、140a、141、143a、145、146、147、150e、150j、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160c、160e、160k、161、162、164、165、168、170、171、172、173、175、176、178、181、183、184、185、186、188、191、192、195、196、200和/或201(纖維素酶編號方式)。在表1中對比的至少一個(gè)纖維素酶序列中，這些位置含有帶電或可能帶電的氨基酸殘基。
在一種具體的實(shí)施方案中，纖維素酶變體是由下表7中識別的纖維素酶之一((a)Humicola insolens；(b)枝頂孢；(c)Volutellacollectotrichoides；(d)糞生糞殼；(e)Thielavia terrestris；(f)尖鐮孢；(g)嗜熱毀絲霉；(h)Crinipellis scabella；(i)菜豆殼球孢；(j)熒光假單胞菌；(k)玉蜀黍黑粉菌)，通過在表7中對這些纖維素酶識別出的一個(gè)或幾個(gè)位置進(jìn)行取代、插入和/或缺失而衍生得到的。
表7改變了的對陰離子表面活性劑的敏感性由纖維素酶編號方式識別的位置(a)Humicola insolens；(b)枝頂孢；(c)Volutella collectotrichoides；(d)糞生糞殼；(e)Thielavia terrestris；(f)尖鐮孢；(g)嗜熱毀絲霉；(h)Crinipellis scabella；(i)菜豆殼球孢；(j)熒光假單胞菌；(K)玉蜀黍黑粉菌。
a b c d e f q h i j k2 D4 R H R K H Y7 R R R R R R R R R R R8 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y10 D D D D D D D D D D D13 K K K K K K K K K K15H19D D E20 K E E21 K K K K K K K K K K25 Y26R R K29 K YRD32D D D D D D D D K33R RK K R34 D35D D D37 R R R40 DD D DD D42 D D K42a DK43 D44 K R KR K K48 E D D D E D D D D53 K54 Y Y Y Y Y Y Y Y55 Y58 D D D D D59Y K63 D64 D65 DE66 D D D D D D D67 D E E D70Y Y Y Y Y Y Y Y Y72Y76 K K K H K79D80 K82 E E E E E E E E E E84 D D86 D88R90 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y91 E E E K Y93 E95 E95d Y95h H95i D D97 K100 K K101 R102K K K K K K K K K K103K K K KK113 Y114D D D D D D D D D D D117 D D119H H H H H H H H121D D D D D D D D D D D133D D D D D K136 K137 RD K138 E E139 Y140a K141 E143a E L145 D D146R R R R147Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y150e K150j Y151 H K152D153R R R R R R K R R154D E D155EE E E E156 Y157DD D D EK158R E K159 Y160c R160e D160k R161D E E K162K164K R K K K K165 D D E168Y H H K170R R R R R R R R R R171 Y Y172D D D D D D D D D E173 E175KK EE E176 D D D178D D D D D D D D D D181 D E D K183D K184 Y185R R R K E R E K K186 R R EE R188 R K191 K K192EE E E E E195 DD D196R R R R R K R R R200R R K K K201R R R R R R R R R R R酶組合物在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及含有如上所述表現(xiàn)有纖維素分解活性的酶的酶組合物。
除了本發(fā)明的纖維素酶以外，本發(fā)明的酶組合物還可以含有一種或幾種其他酶類型，例如半纖維素酶，如木聚糖酶和甘露聚糖酶；其他纖維素酶組分，殼多糖酶、脂肪酶、酯酶、果膠酶、角質(zhì)酶、肌醇六磷酸酶、氧化還原酶、過氧化物酶、漆酶、氧化酶、pactinmethylesterase、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)、蛋白酶或淀粉酶。
酶組合物可以按照本領(lǐng)域的已知方法進(jìn)行制備，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，酶組合物可以是顆粒或微粒的形式。組合物中欲包含的酶可以按照本領(lǐng)域的已知方法進(jìn)行穩(wěn)定化。
下文給出本發(fā)明的酶組合物的優(yōu)選用途例子。本發(fā)明酶組合物的劑量和使用組合物的其他條件可以根據(jù)本領(lǐng)域的已知方法決定。
按照本發(fā)明的酶組合物可用于下列目的中的至少一種。
用途在洗滌和穿著過程中，染色的織物或服裝中的染料通常含從織物中滲出，而使織物看上去褪色和陳舊。從織物上除去表面纖維將部分地恢復(fù)織物原來的顏色和外觀。本文所用術(shù)語“顏色澄清”指的是通過多次洗滌周期，織物或服裝的最初顏色部分恢復(fù)。
術(shù)語“脫球”指從織物表面除去小纖維球。
術(shù)語“浸泡液”指可以在進(jìn)行常規(guī)洗滌過程之前浸泡衣物的水溶液。浸泡液可以含有一種或幾種常用于洗滌或洗衣過程中的成分。
術(shù)語“洗滌液”指在其中對衣物進(jìn)行洗滌過程的水溶液，洗滌過程也就是通常用手或洗衣機(jī)進(jìn)行的化學(xué)與機(jī)械混合動(dòng)作。習(xí)慣上，洗滌液是一種粉末或液體洗滌劑組合物的水溶液。
術(shù)語“漂洗液”指習(xí)慣上在進(jìn)行洗滌過程后立即浸入和處理衣物以漂洗衣物(也就是從根本上除去衣物中的洗滌劑溶液)的水溶液，漂洗液可以含有一種織物調(diào)理或軟化組合物。
用本發(fā)明方法進(jìn)行處理的衣物可以是常規(guī)的可洗滌的衣物。優(yōu)選地，大部分衣物是縫合或未縫合的織物，包括由棉、棉混合物或天然或人造纖維素(例如來源于含木聚糖的纖維素纖維，如來自木漿)或其混合物制成的編織物、紡織物、斜紋粗布工裝褲、紗和毛巾料?；旌衔锏睦邮敲藁蛉嗽炖w維/粘膠與一種或幾種伴隨材料的混合物，所述伴隨材料例如是羊毛、合成纖維(例如聚酰胺纖維、丙烯酸纖維、聚酯纖維、聚乙烯醇纖維、聚氯乙烯纖維、聚偏二氯乙烯纖維、聚亞胺酯纖維、聚脲纖維、芳族聚酰胺纖維)和含纖維素的纖維(例如人造纖維/粘膠、苧麻、亞麻/亞麻布、黃麻、醋酸纖維素纖維、水溶性纖維素(lyocell))。
洗滌劑的公開和例子表面活性劑系統(tǒng)按照本發(fā)明的洗滌劑組合物含有一個(gè)表面活性劑系統(tǒng)，其中該表面活性劑可以選自非離子和/或陰離子和/或陽離子和/或兩性和/或兩性離子和/或半極性表面活性劑。
通常表面活性劑含量為0.1-60％(重量)。
優(yōu)選將表面活性劑配制成可與組合物中存在的酶組分相容的形式。在液體或凝膠組合物中，該表面活性劑最優(yōu)選以這樣一種方式進(jìn)行配制，使得它能促進(jìn)、或至少不降低這些組合物中任意一種酶的穩(wěn)定性。
欲按照本發(fā)明使用的優(yōu)選系統(tǒng)含有一種或幾種本文所述的非離子和/或陰離子表面活性劑作為表面活性劑。
烷基酚的聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧丁烯縮合物適合用作本發(fā)明表面活性劑系統(tǒng)的非離子表面活性劑，其中優(yōu)選聚氧乙烯縮合物。這些化合物包括烷基酚與烯化氧的縮合產(chǎn)物，該烷基酚具有一個(gè)含約6至約14個(gè)碳原子(優(yōu)選為約8至約14個(gè)碳原子)的烷基，該烷基為直鏈或支鏈構(gòu)型。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，環(huán)氧乙烷存在的量為每摩爾烷基酚對應(yīng)環(huán)氧乙烷的含量等于約2至約25摩爾，更優(yōu)選為約3至約15摩爾。商業(yè)上可得到的這種類型的非離子表面活性劑包括Igepal TM CO-630,GAF公司有售；Triton TMX-45、X-114、X-100和X-102，均在Rohm & Haas公司有售。這些表面活性劑常被稱為烷基酚烷氧基化物(例如烷基酚乙氧基化物)。
脂族伯醇和仲醇與約1至約25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物適合用作本發(fā)明非離子表面活性劑系統(tǒng)的非離子表面活性劑。脂族醇的烷基鏈可以是直鏈或支鏈的，可以是伯醇或仲醇，一般含有約8至約22個(gè)碳原子。優(yōu)選的縮合產(chǎn)物是，來自醇的部分具有一個(gè)含有約8至約20個(gè)碳原子，更優(yōu)選為約10至約18個(gè)碳原子的烷基，并且每摩爾醇與約2至約10摩爾環(huán)氧乙烷縮合。所述縮合產(chǎn)物中，相對于每摩爾醇，存在約2至約7摩爾環(huán)氧乙烷，最優(yōu)選為2至5摩爾環(huán)氧乙烷。這種類型的非離子表面活性劑商業(yè)上可得到的例子包括TergitolTM 15-S-9(C11-C15線性醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、TergitolTM 24-L-6 NMW(C12-C14伯醇與6摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，具有狹窄的分子量分布)，二者均在聯(lián)合碳化物公司有售；由殼牌化學(xué)公司銷售的NeodolTM 45-9(C14-C15線性醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM 23-3(C12-C13線性醇與3.0摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM 45-7(C14-C15線性醇與7摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM 45-5(C14-C15線性醇與5摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)，由寶潔公司銷售的Kyro TM EOB(C13-C15醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)，和由Hoechst銷售的Genapol LA 050(C12-C14醇與5摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)。這些產(chǎn)物中優(yōu)選的HLB范圍為8-11，最優(yōu)選為8-10。
也可用作本發(fā)明表面活性劑系統(tǒng)的非離子表面活性劑的是US4565647中公開的烷基多糖，它具有一個(gè)疏水性基團(tuán)和一個(gè)多糖，該疏水性基團(tuán)含有約6至約30個(gè)碳原子，優(yōu)選為約10至約16個(gè)碳原子，該多糖例如是多糖苷，其親水性基團(tuán)含有約1.3至約10個(gè)、優(yōu)選為約1.3至約3個(gè)、最優(yōu)選為約1.3至約2.7個(gè)糖單元?？梢允褂煤?或6個(gè)碳原子的任意還原糖，例如葡萄糖、半乳糖，半乳糖基部分可以被取代為葡糖基部分(可選地，疏水性基團(tuán)連接在2-、3-、4-等位置，于是與葡糖苷或半乳糖苷相反，得到葡萄糖或半乳糖)。糖間鍵例如可以位于附加的糖單元的一個(gè)位置與前面的糖單元上2-、3-、4-和/或6-位之間。
優(yōu)選的烷基多糖苷具有式R2O(CnH2nO)t(糖基)x的結(jié)構(gòu)。
其中R2選自由烷基、烷基苯基、羥基烷基、羥基烷基苯基和它們的混合物組成的組，其中的烷基含有約10至約18個(gè)、優(yōu)選為約12至約14個(gè)碳原子；n為2或3，優(yōu)選為2；t為0至約10，優(yōu)選為0；x為約1.3至約10，優(yōu)選為約1.3至約3，最優(yōu)選為約1.3至約2.7。糖基優(yōu)選得自葡萄糖。為了制備這些化合物，先生成醇或烷基多乙氧基醇，然后與葡萄糖或葡萄糖源反應(yīng)，生成葡糖苷(連接在1位上)。然后附加的糖基單元可以通過它們的1位與前面的糖基單元2-、3-、4-和/或6-位(優(yōu)選主要在2位)之間的連接而連接上去。
環(huán)氧乙烷與一種疏水性堿的縮合產(chǎn)物也適合用作本發(fā)明的附加的非離子表面活性劑系統(tǒng)，該疏水性堿是由環(huán)氧丙烷與丙二醇縮合形成的。優(yōu)選這些化合物的疏水部分分子量為約1500至約1800，并表現(xiàn)出水不溶性。向該疏水部分加入聚氧乙烯部分趨向從整體上增加分子的水溶性，聚氧乙烯含量約為縮合產(chǎn)物總重量的50％(這一點(diǎn)相當(dāng)于與達(dá)約40摩爾的環(huán)氧乙烷縮合)時(shí)，產(chǎn)物的液體特征仍舊保留。這種類型的化合物例子包括某些商業(yè)上可得到的Pluronic TM表面活性劑，BASF有售。
也適合用作本發(fā)明非離子表面活性劑系統(tǒng)的非離子表面活性劑的是環(huán)氧乙烷與得自環(huán)氧丙烷和乙二胺反應(yīng)的產(chǎn)物的縮合產(chǎn)物。這些縮合產(chǎn)物的疏水部分由乙二胺和過量環(huán)氧丙烷的反應(yīng)產(chǎn)物組成，一般具有約2500至約3000的分子量。該疏水部分與環(huán)氧乙烷縮合的程度是，縮合產(chǎn)物含有約40％至約80％(重量)的聚氧乙烯，并具有約5000至約11000的分子量。這種類型的非離子表面活性劑例子包括某些商業(yè)上可得到的Tetronic TM化合物，BASF有售。
優(yōu)選用作本發(fā)明表面活性劑系統(tǒng)的非離子表面活性劑的是烷基酚的聚氧乙烯縮合物、脂族伯醇和仲醇與約1至約25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合物、烷基多糖以及它們的混合物。最優(yōu)選的是具有3至15個(gè)乙氧基的C8-C14烷基酚乙氧基化物、具有2至10個(gè)乙氧基的C8-C18脂肪醇的乙氧基化物(優(yōu)選平均為C10)以及它們的混合物。
非常優(yōu)選的非離子表面活性劑是下式的多羥基脂肪酰胺表面活性劑，

其中R1為H，或R1為C1-4烴基、2-羥乙基、2-羥丙基或它們的混合物；R2為C5-31烴基；Z為具有一個(gè)線性烴基鏈的多羥基烴基(其中具有至少3個(gè)直接連接在鏈上的羥基)，或其烷氧基化衍生物。優(yōu)選地，R1為甲基，R2為直鏈C11-15烷基或C16-18烷基或鏈烯基鏈(例如椰油烷基)，或它們的混合物，Z為在還原性胺化反應(yīng)中得自一種還原糖，例如葡萄糖、果糖、麥芽糖或乳糖。
非常優(yōu)選的陰離子表面活性劑包括烷氧基化硫酸烷基酯表面活性劑。它們的例子是式RO(A)mSO3M的水溶性鹽或酸，式中R為未取代的C10-C24烷基或具有一個(gè)C10-C24烷基組分的羥基烷基，優(yōu)選為C12-C20烷基或羥基烷基，更優(yōu)選為C12-C18烷基或羥基烷基；A為乙氧基或丙氧基單元；m大于零，一般在約0.5至約6之間，更優(yōu)選在約0.5與約3之間；M為H或一個(gè)陽離子，例如可以是金屬陽離子(例如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂等)、銨或取代的銨陽離子。乙氧基化硫酸烷基酯以及丙氧基化硫酸烷基酯是本文預(yù)期使用的。取代的銨陽離子的特例包括甲基、二甲基、三甲基銨陽離子和季銨陽離子，例如四甲基銨和二甲基哌啶鎓陽離子，和那些得自烷基胺例如乙胺、二乙胺、三乙胺、它們的混合物等等的陽離子。表面活性劑的例子有聚乙氧基化(1.0)硫酸C12-C18烷基酯(C12-C18E(1.0)M)、聚乙氧基化(2.25)硫酸C12-C18烷基酯(C12-C18E(2.25)M)、聚乙氧基化(3.0)硫酸C12-C18烷基酯(C12-C18E(3.0)M)和聚乙氧基化(4.0)硫酸C12-C18烷基酯(C12-C18E(4.0)M)，其中M可方便地選自鈉和鉀。
所用的適當(dāng)陰離子表面活性劑是烷基磺酸酯表面活性劑，包括C8-C20羧酸(也就是脂肪酸)的線性酯，該羧酸用氣態(tài)SO3磺酸化，方法按照《The Journal of the American Oil Chemists Society》52(1975),pp.323-329。適當(dāng)?shù)脑习ǖ米耘Ｖ?、棕櫚油等的天然脂肪物質(zhì)。
優(yōu)選的烷基磺酸酯表面活性劑-尤其是用于洗衣-含有下列結(jié)構(gòu)式的烷基磺酸酯表面活性劑

其中R3為C8-C20烴基，優(yōu)選為烷基，或它們的組合；R4為C1-C6烴基，優(yōu)選為烷基，或它們的組合；M為陽離子，它與烷基磺酸酯生成一種水溶性鹽。適當(dāng)?shù)某甥}陽離子包括金屬離子，例如鈉、鉀和鋰離子，以及取代的或未取代的銨陽離子，例如一乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺。優(yōu)選地，R3為C10-C16烷基，R4為甲基、乙基或異丙基。尤其優(yōu)選的是磺酸甲酯，其中R3為C10-C16烷基。
其他適當(dāng)?shù)年庪x子表面活性劑包括硫酸烷基酯表面活性劑，它們是式ROSO3M的水溶性鹽或酸，其中R優(yōu)選為C10-C24烴基，優(yōu)選為具有C10-C20烷基組分的烷基或羥基烷基，更優(yōu)選為C12-C18烷基或羥基烷基；M為H或陽離子，例如堿金屬陽離子(例如鈉、鉀、鋰)或者銨或取代的銨(例如甲基、二甲基、三甲基銨陽離子和季銨陽離子，例如四甲基銨和二甲基哌啶鎓陽離子，和得自烷基胺例如乙胺、二乙胺、三乙胺的季銨陽離子，以及它們的混合物，等等)。一般地，較低洗滌溫度(例如約50℃以下)優(yōu)選C12-C16烷基鏈，較高洗滌溫度(例如約50℃以上)優(yōu)選C16-C18烷基鏈。
可用于清潔目的的其他陰離子表面活性劑也可以包括在本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物中。這些可以包括皂鹽(例如包括鈉、鉀、銨和取代的銨鹽，如一、二和三乙醇胺鹽)，C8-C22伯或仲鏈烷基磺酸鹽，C8-C24烯屬磺酸酯，磺化的多羧酸(由堿土金屬檸檬酸鹽的熱解產(chǎn)物，按照例如英國專利說明書第1082179所述進(jìn)行磺化反應(yīng)制得)，C8-C24烷基聚乙二醇醚硫酸酯(含有達(dá)10摩爾的環(huán)氧乙烷)；烷基甘油磺酸鹽，脂肪酰甘油磺酸鹽，脂肪油烯基甘油磺酸鹽，烷基酚環(huán)氧乙烷醚硫酸鹽，石蠟磺酸鹽，烷基磷酸鹽，羥乙基磺酸鹽如?；u乙基磺酸鹽，N-?；；撬猁}(N-acyl taurates)，烷基琥珀酰胺酸鹽和硫代琥珀酸鹽，硫代琥珀酸單酯(尤其是飽和和不飽和的C12-C18單酯)和硫代琥珀酸二酯(尤其是飽和和不飽和的C6-C12二酯)，酰基肌氨酸鹽，烷基多糖的硫酸鹽如烷基多葡糖苷的硫酸鹽(下文將描述的非離子型非硫酸化化合物)，支鏈伯烷基硫酸鹽，和烷基多乙氧基羧酸鹽例如式RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+，其中R為C8-C22烷基，k為一個(gè)1至10的整數(shù)，M為一個(gè)可形成可溶性鹽的陽離子。樹脂酸和氫化樹脂酸也是適宜的，例如松香、氫化松香、存在于松油中的或得自松油的樹脂酸和氫化樹脂酸。
烷基苯磺酸鹽是非常優(yōu)選的。尤其優(yōu)選的是線性(直鏈)烷基苯磺酸鹽(LAS)，其中的烷基優(yōu)選含有10至18個(gè)碳原子。
進(jìn)一步的例子描述在《表面活性劑與洗滌劑》(Ⅰ卷和Ⅱ卷，Schwartz,Perry和Berch)中。各種這樣的表面活性劑一般也公開在US 3929678(第23欄第58行至第29欄第23行，在此引入作為參考)中。
當(dāng)包括在其中時(shí)，本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物一般含有重量百分比為約1-40％、優(yōu)選約3-20％的這樣的陰離子表面活性劑。
本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物也可以含有陽離子、兩性、兩性離子和半極性表面活性劑，以及非離子和/或除了上述以外的陰離子表面活性劑。
適用于本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物中的陽離子清潔表面活性劑是那些具有一個(gè)長鏈烴基者。這樣的陽離子表面活性劑的例子包括銨表面活性劑，例如烷基三甲基銨鹵化物，和那些具有下式結(jié)構(gòu)的表面活性劑[R2(OR3)y][R4(OR3)y]2R5N+X-其中R2為在烷基鏈中具有約8至約18個(gè)碳原子的烷基或烷基芐基，每個(gè)R3選自由-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH(CH2OH)-、-CH2CH2CH2-和它們的混合物組成的組；每個(gè)R4選自由下列基團(tuán)組成的組C1-C4烷基，C1-C4羥基烷基，連接兩個(gè)R4基團(tuán)所生成的芐基環(huán)結(jié)構(gòu)-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH、其中R6為分子量小于約1000的任意己糖或己糖聚合物，若y不是0則為氫；R5與R4相同，或者是一個(gè)烷基鏈，其中的碳原子總數(shù)或R2加R5的碳原子總數(shù)不超過18；每個(gè)y為0至約10,y值總計(jì)為0至約15；X為任意相容的陰離子。
非常優(yōu)選的陽離子表面活性劑是可用于本發(fā)明組合物中的水溶性季銨化合物，具有下式結(jié)構(gòu)式R1R2R3R4N+X-(ⅰ)其中R1為C8-C16烷基；每個(gè)R2、R3和R4獨(dú)立為C1-C4烷基、C1-C4羥基烷基、芐基和-(C2H4O)xH，其中x為2至5之間的一個(gè)值；X為一個(gè)陰離子。R2、R3或R4中至多其一為芐基。
R1優(yōu)選的烷基鏈長為C12-C15，特別是當(dāng)該烷基是得自椰油或棕櫚仁脂的鏈長度混合物，或由烯烴加長或OXO醇合成得到時(shí)。
R2、R3和R4優(yōu)選的基團(tuán)是甲基和羥乙基，陰離子X可選自鹵離子、甲基硫酸根、乙酸根和磷酸根離子。
適用此處的式(ⅰ)季銨化合物的例子有氯化或溴化椰油三甲基銨；氯化或溴化椰油甲基二羥乙基銨；氯化癸基三乙基銨；氯化或溴化癸基二甲基羥乙基銨；氯化或溴化C12-C15二甲基羥乙基銨；氯化或溴化椰油二甲基羥乙基銨；甲基硫酸肉豆蔻基三甲基銨；氯化或溴化月桂基二甲基芐基銨；氯化或溴化月桂基二甲基(氧乙烯基)4銨；膽堿酯類(式(ⅰ)化合物，其中R1為

烷基，R2、R3、R4為甲基)；二烷基咪唑啉(式(Ⅰ)化合物)。
可用在這里的其他陽離子表面活性劑也描述在US 4228044和EP000224中。
當(dāng)包括在其中時(shí)，本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物一般含有重量百分比為0.2-25％、優(yōu)選約1-8％的這種陽離子表面活性劑。
兩性表面活性劑也適合用在本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物中。這些表面活性劑可以被廣泛描述為仲胺或叔胺的脂族衍生物、或雜環(huán)仲胺和叔胺的脂族衍生物，其中的脂族原子團(tuán)可以是直鏈或支鏈的。脂族取代基之一含有至少約8個(gè)碳原子，一般為約8-18個(gè)碳原子，并且至少一個(gè)脂族取代基含有一個(gè)陰離子的水增溶的基團(tuán)，例如羧基、磺酸根、硫酸根。兩性表面活性劑例如參見US 3929678(第19欄第18-35行)。
當(dāng)包括在其中時(shí)，本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物一般含有重量百分比為0.2-15％、優(yōu)選約1-10％的這樣的兩性表面活性劑。
兩性離子表面活性劑也適合用在衣物洗滌劑組合物中。這些表面活性劑可以被廣泛描述為仲胺和叔胺的衍生物、雜環(huán)仲胺和叔胺的衍生物，或季銨、季鏻或叔锍化合物的衍生物。兩性離子表面活性劑例如參見US 3929678(第19欄第38行到第22欄第48行)。
當(dāng)包括在其中時(shí)，本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物一般含有重量百分比為0.2-15％、優(yōu)選為約1-10％的這種兩性離子表面活性劑。
半極性非離子表面活性劑是一類特殊的非離子表面活性劑，包括水溶性氧化胺，它含有一個(gè)約10-18個(gè)碳原子的烷基部分和選自由含有約1至約3個(gè)碳原子的烷基和羥基烷基組成之組的兩個(gè)部分；還包括水溶性氧化膦，它含有一個(gè)約10至約18個(gè)碳原子的烷基部分和選自由含有約1至約3個(gè)碳原子的烷基和羥基烷基組成之組的兩個(gè)部分；還包括水溶性亞砜，它含有一個(gè)約10至約18個(gè)碳原子的烷基部分和選自由含有約1至約3個(gè)碳原子的烷基和羥基烷基部分組成之組的一個(gè)部分。
半極性非離子洗滌劑表面活性劑包括具有下式結(jié)構(gòu)的氧化胺表面活性劑

其中R3為含有約8至約22個(gè)碳原子的烷基、羥基烷基或烷基苯基，或它們的混合物；R4為含有約2至約3個(gè)碳原子的亞烷基或羥基亞烷基，或它們的混合物；x為0至約3；每個(gè)R5為含有約1至約3個(gè)碳原子的烷基或羥基烷基，或含有約1至約3個(gè)環(huán)氧乙烷基的一個(gè)多氧乙烯基。R5基團(tuán)可以彼此連接，例如通過一個(gè)氧原子或氮原子連接，而形成環(huán)結(jié)構(gòu)。
這些氧化胺表面活性劑特別包括C10-C18烷基二甲基胺氧化物和C8-C12烷氧基乙基二羥基乙基胺氧化物。
當(dāng)包括在其中時(shí)，本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物一般含有重量百分比為0.2-15％、優(yōu)選為約1-10％的這種半極性非離子表面活性劑。
助洗劑系統(tǒng)按照本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步含有一種助洗劑系統(tǒng)。任何常規(guī)的助洗劑系統(tǒng)都適用于本文，包括硅鋁酸鹽物質(zhì)、硅酸鹽、多羧酸鹽和脂肪酸、諸如乙二胺四乙酸鹽等物質(zhì)、諸如氨基多膦酸鹽等金屬離子螯合劑，特別是乙二胺四亞甲基膦酸和二亞乙基三胺五亞甲基膦酸。盡管出于明顯的環(huán)境原因，磷酸鹽助洗劑不太優(yōu)選，但在此處也可使用。
適用的助洗劑可以是一種無機(jī)離子交換物質(zhì)，一般是一種無機(jī)水合的硅鋁酸鹽物質(zhì)，更具體地說是一種水合的合成沸石，如水合的沸石A、X、B、HS或MAP。
另一種適用的無機(jī)助洗劑物質(zhì)是分層硅酸鹽，例如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是一種由硅酸鈉(Na2Si2O5)組成的結(jié)晶性分層硅酸鹽。
適用的含有一個(gè)羧基的多羧酸鹽包括乳酸、乙醇酸及其醚衍生物，如比利時(shí)專利831368、821369和821370中所公開的那些。含有兩個(gè)羧基的多羧酸鹽包括琥珀酸、丙二酸、(亞乙二氧基)二乙酰乙酸(diacetic acid)、馬來酸、二乙醇酸、酒石酸、丙醇二酸和富馬酸的水溶性鹽，以及公開在德國Offenle-enschrift 2446686和2446487、US3935257中的羧酸醚，公開在比利時(shí)專利No.840623中的亞磺酰羧酸鹽。含有三個(gè)羧基的多羧酸鹽特別包括水溶性檸檬酸鹽、aconitrate和檸康酸鹽，以及琥珀酸鹽衍生物，如公開在英國專利No.1379241中的羧甲氧基琥珀酸鹽、公開在荷蘭專利申請7205873中的乳酰氧基琥珀酸鹽(Lactoxysuccinates)，和氧化多羧酸鹽物質(zhì)，如公開在英國專利No.1387447中的2-氧雜-1,1,3-丙烷三羧酸鹽。
含有四個(gè)羧基的多羧酸鹽包括公開在英國專利No.1261829中的氧聯(lián)二琥珀酸鹽，含有磺基取代基的1,1,2,2-乙烷四羧酸鹽、1,1,3,3-丙烷四羧酸鹽包括公開在英國專利No.1398421、1398422和US 3936448中的磺基琥珀酸鹽衍生物，和描述在英國專利No.1082179中的磺化的熱解檸檬酸鹽，而含有膦基(phosphone)取代基的多羧酸鹽公開于英國專利No.1439000中。
脂環(huán)和雜環(huán)多羧酸鹽包括環(huán)戊烷-順式，順式-順式四羧酸鹽、環(huán)戊二烯化(cyclopentadienide)五羧酸鹽、2,3,4,5-四氫呋喃-順式，順式，順式-四羧酸鹽、2,5-四氫呋喃-順式-二羧酸鹽、2,2,5,5-四氫呋喃四羧酸鹽、1,2,3,4,5,6-己烷六羧酸鹽以及多元醇如山梨糖醇、甘露糖醇和木糖醇的羧甲基衍生物。芳族多羧酸鹽包括公開在英國專利No.1425343中的苯六甲酸、1,2,4,5-苯四酸和苯二甲酸衍生物。
上述中優(yōu)選的多羧酸鹽是每分子含有不超過三個(gè)羧基的羥基羧酸鹽，更優(yōu)選為檸檬酸鹽。
優(yōu)選用在本發(fā)明組合物中的助洗劑系統(tǒng)包括諸如沸石A等水不溶性硅鋁酸鹽助洗劑或多層硅酸鹽(SKS-6)和諸如檸檬酸等水溶性羧酸鹽螯合劑的混合物。
一種適宜包含在按照本發(fā)明的洗滌劑組合物中的螯合劑是乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)或其堿金屬、堿土金屬、銨或取代的銨鹽，或它們的混合物。優(yōu)選的EDDS化合物是游離酸形式和其鈉鹽或鎂鹽。優(yōu)選的EDDS鈉鹽例子包括Na2EDDS和Na4EDDS。優(yōu)選的EDDS鎂鹽例子包括MgEDDS和M92EDDS。最優(yōu)選用于包含在按照本發(fā)明的組合物中的是鎂鹽。
優(yōu)選的助洗劑系統(tǒng)包括諸如沸石A等水不溶性硅鋁酸鹽助洗劑和諸如檸檬酸等水溶性羧酸鹽螯合劑的混合物。
其他能構(gòu)成用于顆粒狀組合物中助洗劑系統(tǒng)的一部分的助洗劑物質(zhì)包括無機(jī)物質(zhì)，如堿金屬碳酸鹽、碳酸氫鹽、硅酸鹽，和有機(jī)物質(zhì)，如有機(jī)膦酸鹽、氨基多亞烷基膦酸鹽和氨基多羧酸鹽。
其他適用的水溶性有機(jī)鹽是均聚合或共聚合的酸或它們的鹽，其中多羧酸含有至少兩個(gè)羧基，這兩個(gè)羧基被不超過兩個(gè)碳原子彼此分開。
這種類型的聚合物公開在GB-A-1596756中。這樣的鹽的例子是分子量為2000-5000的聚丙烯酸鹽和它們與馬來酸酐的共聚物，該共聚物的分子量為20000至70000，尤其約為40000。
洗滌助洗劑鹽的含量通常為5％至80％(以組合物重量計(jì))。液體洗滌劑的助洗劑濃度優(yōu)選為5％至30％。
酶除了本發(fā)明的酶制劑以外，優(yōu)選的洗滌劑組合物含有其他的酶，該酶提供清潔作用和/或織物護(hù)理效果。
這樣的酶包括蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、纖維素酶、過氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)。
蛋白酶任何適用于堿性溶液中的蛋白酶均可使用。適用的蛋白酶包括動(dòng)物、植物或微生物來源的蛋白酶。微生物來源的蛋白酶是優(yōu)選的。包括化學(xué)或基因加工過的突變體。蛋白酶可以是一種絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選為堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的例子是枯草桿菌蛋白酶，尤其是得自芽孢桿菌屬的枯草桿菌蛋白酶，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carisberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(描述在WO 89/06279中)。胰蛋白酶樣蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如豬或牛來源)和描述在WO 89/06270中的鐮孢屬蛋白酶。
優(yōu)選的商業(yè)上可得到的蛋白酶包括Novo Nordisk A/S(丹麥)公司產(chǎn)品，商品名為Alcalase、Savinase、Primase、Durazym和Esperase；Genencor國際公司產(chǎn)品，商品名為Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect和Purafect OXP；以及Solvay酶公司產(chǎn)品，商品名為Opticlean和Optimase。蛋白酶摻入本發(fā)明組合物中的水平，按組合物的重量計(jì)，酶蛋白質(zhì)濃度可以是0.00001％至2％，優(yōu)選為0.0001％至1％，更優(yōu)選為0.001％至0.5％，進(jìn)而更優(yōu)選為0.01％至0.2％。
脂肪酶任何適用于堿性溶液中的脂肪酶均可使用。適用的脂肪酶包括那些細(xì)菌或真菌來源的脂肪酶。包括經(jīng)化學(xué)或基因改造的突變體。
有用的脂肪酶的例子包括一種Humicola lanuginosa脂肪酶，如EP258068和EP 305216所述；一種Rhizomucor miehei脂肪酶，例如EP238023所述；一種假絲酵母屬脂肪酶，如C.antarctica脂肪酶，例如EP 214761所述的C.antarctica脂肪酶A或B，一種假單胞菌屬脂肪酶，如產(chǎn)堿假單胞菌和類產(chǎn)堿假單胞菌脂肪酶，例如EP 218272所述，一種洋蔥假單胞菌脂肪酶，例如EP 331376所述，一種施氏假單胞菌脂肪酶，例如GB 1372034所述，一種熒光假單胞菌脂肪酶，一種芽胞桿菌屬脂肪酶，例如枯草桿菌脂肪酶(Dartois等，(1993)，生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)，1131,253-260)、嗜熱脂肪芽胞桿菌脂肪酶(JP 64/744992)和短小芽胞桿菌脂肪酶(WO 91/16422)。
而且，可以使用大量克隆的脂肪酶，包括沙門柏干酪青霉脂肪酶(Yamaguchi等，(1991)，基因103,61-67)，白地霉脂肪酶(Schimada,Y.等，(1989)，生物化學(xué)雜志，106,383-388)和各種根霉菌屬脂肪酶，如R.delemar脂肪酶(Hass,M.J.等，(1991)，基因，109,117-113)、雪白根霉脂肪酶(Kugimiya等，(1992)，生物科學(xué)、生物技術(shù)與生物化學(xué)，56,716-719)和米根霉脂肪酶。
也可使用其他類型的脂解酶，如角質(zhì)酶，例如WO 88/09367所述的得自門多薩假單胞菌的角質(zhì)酶，或得自Fusarium solani pisi的角質(zhì)酶(例如WO 90/09446所述)。
尤其適用的脂肪酶是M1 LipaseTM、Luma fastTM和LipomaxTM(Genencor)、LipolaseTM與Lipolase UltraTM(NovoNordisk A/S)和Lipase P“Amano”(Amano藥學(xué)有限公司)。
脂肪酶摻入洗滌劑組合物中的水平，按組合物重量計(jì)，酶蛋白質(zhì)量一般為0.00001％至2％，優(yōu)選為0.0001％至1％，更優(yōu)選為0.001％至0.5％，進(jìn)而更優(yōu)選為0.01％至0.2％。
淀粉酶任何適用于堿性溶液中的淀粉酶(a和/或b)均可使用。適用的淀粉酶包括那些細(xì)菌或真菌來源的淀粉酶。包括經(jīng)化學(xué)或基因改造的突變體。淀粉酶包括例如從一種特殊的地衣芽孢桿菌菌株得到的淀粉酶，GB 1296839對此有更為詳細(xì)的描述。商業(yè)上可得到的淀粉酶為DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(可從NovoNordisk A/S得到)，RapidaseTM和Maxamyl PTM(可從Genencor得到)。
淀粉酶摻入洗滌劑組合物中的水平，按組合物重量計(jì)，酶蛋白質(zhì)量一般為0.00001％至2％，優(yōu)選為0.0001％至1％，更優(yōu)選為0.001％至0.5％，進(jìn)而更優(yōu)選為0.01％至0.2％。
纖維素酶任何適用于堿性溶液中的纖維素酶均可使用。適用的纖維素酶包括那些細(xì)菌或真菌來源的纖維素酶。包括經(jīng)化學(xué)或基因改造的突變體。適用的纖維素酶公開在US 4435307中，它公開了由Humicolainsolens產(chǎn)生的真菌纖維素酶。尤其適用的纖維素酶是具有顏色護(hù)理效果的纖維素酶。這種纖維素酶的例子描述在歐洲專利申請No.0495257中的纖維素酶和本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶。
商業(yè)上可得到的纖維素酶包括由Humicola insolens菌株產(chǎn)生的CelluzymeTM(Novo Nordisk A/S)和KAC-500(B)TM(花王公司)。
纖維素酶摻入洗滌劑組合物中的水平，以組合物重量計(jì)，酶蛋白質(zhì)量一般為0.00001％至2％，優(yōu)選為0.0001％至1％，更優(yōu)選為0.001％至0.5％，進(jìn)而更優(yōu)選為0.01％至0.2％。
過氧化物酶/氧化酶過氧化物酶與過氧化氫或其來源(例如過碳酸鹽、過硼酸鹽或過硫酸鹽)結(jié)合使用。氧化酶與氧結(jié)合使用。兩種類型的酶均用于“溶液漂白”，也就是當(dāng)在一種洗滌液中一起洗滌織物時(shí)，特別是與例如WO 94/12621和WO 95/01426所述的一種增強(qiáng)劑一起使用時(shí)，防止紡織品染料從染色的織物轉(zhuǎn)移到另一個(gè)織物上。適用的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細(xì)菌或真菌來源的那些酶。包括經(jīng)化學(xué)或基因改造的突變體。
過氧化物酶/氧化酶摻入洗滌劑組合物中的水平，以組合物重量計(jì)，酶蛋白質(zhì)量一般為0.00001％至2％，優(yōu)選為0.0001％至1％，更優(yōu)選為0.001％至0.5％，進(jìn)而更優(yōu)選為0.01％至0.2％。
此處也包括上述酶的混合物，特別是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和/或纖維素酶的混合物。
加入洗滌劑組合物中的本發(fā)明的酶或任一種其他的酶摻入洗滌劑組合物中的水平，以組合物重量計(jì)，酶蛋白質(zhì)量一般為0.00001％至2％，優(yōu)選為0.0001％至1％，更優(yōu)選為0.001％至0.5％，進(jìn)而更優(yōu)選為0.01％至0.2％。
漂白劑能夠包括在本發(fā)明洗滌劑組合物中的其它可選洗滌劑成分包括漂白劑，例如PB1、PB4和粒徑為400-800微米的過碳酸鹽。這些漂白劑組分可以包括一種或幾種氧漂白劑，并且根據(jù)所選擇的漂白劑，還可以包括一種或幾種漂白活化劑。當(dāng)含有氧漂白劑時(shí)，其濃度一般為約1％至約25％。一般來說，漂白化合物是非液體制劑如顆粒狀洗滌劑中可選擇加入的組分。
此處可用的漂白劑組分可以是任何可用于洗滌劑組合物中的漂白劑，包括氧漂白劑以及本領(lǐng)域已知的其他漂白劑。
適用于本發(fā)明的漂白劑可以是一種活化的或未活化的漂白劑。
能夠使用的一類氧漂白劑包括過羧酸漂白劑及其鹽。這類漂白劑的適用例子包括一過氧鄰苯二甲酸鎂六水合物、間氯過苯甲酸的鎂鹽、4-壬氨基-4-氧代過氧丁酸和二過氧十二烷二酸。這樣的漂白劑公開在US4483781、US 740446、EP 0133354和US 4412934中。高度優(yōu)選的漂白劑也包括如US 4634551所述的6-壬氨基-6-氧代過氧己酸。
另一類能夠使用的漂白劑包括鹵素漂白劑。次石鹽漂白劑的例子例如包括三氯異氰脲酸、二氯異氰脲酸鈉和鉀、N-氯和N-溴鏈烷磺胺。以最終產(chǎn)物重量計(jì)，這樣的物質(zhì)一般加入0.5-10％，優(yōu)選為1-5％。
過氧化氫釋放劑能夠與漂白活化劑結(jié)合使用，漂白活化劑例如是四乙酰乙二胺(TAED)、壬酰氧基苯磺酸鹽(NOBS，描述在US 4412934中)、3,5-三甲基-己酰氧基苯磺酸鹽(ISONOBS，描述在EP 120591中)或五乙酰葡萄糖(PAG)，它們被過水解而生成過酸作為活性漂白物質(zhì)，從而改進(jìn)漂白作用。另外，非常適用的是漂白活化劑C8(6-辛酰氨基己?；?氧基苯磺酸鹽、C9(6-壬酰氨基己?；?氧基苯磺酸鹽和C10(6-癸酰氨基己?；?氧基苯磺酸鹽或它們的混合物。同樣適用的活化劑還有如歐洲專利申請No.91870207.7所公開的?；说臋幟仕狨?。
專利申請USSN 08/136626中描述了包括過氧酸在內(nèi)的漂白劑和含有漂白活化劑與過氧漂白化合物的漂白系統(tǒng)，它們可用于按照本發(fā)明的清潔組合物中。
也可以通過加入一種酶系統(tǒng)(也就是一種酶及其底物)使過氧化氫存在，該酶系統(tǒng)能夠在洗滌和/或漂洗過程的開始或過程中產(chǎn)生過氧化氫。這樣的酶系統(tǒng)公開在歐洲專利申請EP 0537381中。
不同于氧漂白劑的漂白劑也是本領(lǐng)域已知的，可在此處應(yīng)用。特別值得關(guān)注的一種非氧漂白劑類型包括光活化的漂白劑，例如磺化的鋅和/或鋁酞菁染料。這些物質(zhì)在洗滌過程中沉淀在底物上。一旦受光照射，并在氧的存在下(例如將衣物懸掛在日光下曬干)，磺化的鋅酞菁染料被活化，隨后底物被漂白。優(yōu)選的鋅酞菁染料和光活化的漂白過程描述在US 4033718中。一般地，洗滌劑組合物將含有重量百分比為約0.025-1.25％的磺化鋅酞菁染料。
漂白劑還可以含有一種錳催化劑。該錳催化劑例如可以是“低溫漂白的高效錳催化劑”，自然，369,1994,pp.637-639中描述的化合物之一。
泡沫抑制劑另一種可選成分是泡沫抑制劑，例如聚硅氧烷和硅石-聚硅氧烷混合物。聚硅氧烷一般能以烷基化的聚硅氧烷物質(zhì)為代表，而硅石通常以細(xì)分形式使用，例如各種硅補(bǔ)強(qiáng)劑與干凝膠和疏水性硅石。這些物質(zhì)可作為微粒而加入，其中泡沫抑制劑被有利地、可釋放地加入到水溶性或水可分散的、實(shí)質(zhì)上為非表面活性洗滌劑的不滲透性載體中。另一種選擇是，可將泡沫抑制劑溶于或分散于液體載體中，并通過噴淋在一種或幾種其他組分上而利用。
一種優(yōu)選的聚硅氧烷泡沫控制劑公開在US 3933672中。其他特別有用的泡沫抑制劑是自乳化的聚硅氧烷泡沫抑制劑，描述在德國專利申請DTOS 2646126中。這種化合物的一個(gè)例子是DC-544，商業(yè)上可從Dow Corning得到，該化合物是一種硅氧烷-乙二醇共聚物。尤其優(yōu)選的泡沫控制劑是含有硅油和2-烷基鏈烷醇的混合物的泡沫抑制劑系統(tǒng)。適用的2-烷基鏈烷醇為2-丁基辛醇，該化合物是商業(yè)上可得到的，其商品名為Isofol 12 R。
這樣的泡沫抑制劑描述在歐洲專利申請EP 0593841中。
尤其優(yōu)選的聚硅氧烷泡沫控制劑描述在歐洲專利申請No.92201649.8中。所述組合物可含有與發(fā)煙無孔隙硅石例如AerosilR結(jié)合使用的聚硅氧烷/硅石混合物。
上述泡沫抑制劑的使用濃度通常為組合物重量的0.001-2％，優(yōu)選為0.01-1％。
其他組分用在洗滌劑組合物中的其他組分可以是污垢懸浮劑、污垢釋放劑、光增白劑、研磨劑、殺菌劑、晦暗抑制劑、著色劑和/或包封或非包封的香料。
尤其適用的包封物料是水溶性膠囊，它由多糖和多羥基化合物的基質(zhì)組成，例如描述在GB 1464616中。
其他適用的水溶性包封物料包括得自取代的二羧酸的未凝膠化淀粉酸酯的糊精，例如描述在US 3455838中。這些酸酯糊精優(yōu)選是從蠟狀玉米、蠟狀高梁、西米、木薯淀粉和馬鈴薯等制得的。所述包封物料的適當(dāng)例子包括由National Starch生產(chǎn)的N-Lok。N-Lok包封物料由加工過的玉米淀粉和葡萄糖組成。該淀粉是通過加入單功能取代基如辛烯基琥珀酸酐而改造的。
此處適用的抗再沉積與污垢懸浮劑包括纖維素衍生物，例如甲基纖維素、羧甲基纖維素和羥乙基纖維素，以及均聚合或共聚合的多羧酸或其鹽。這種類型的聚合物包括前述作為助洗劑的聚丙烯酸酯和馬來酸酐-丙烯酸共聚物，以及馬來酸酐與乙烯、甲基乙烯基醚或甲基丙烯酸的共聚物，馬來酸酐至少占共聚物的20摩爾百分比。這些物料通常的使用濃度為組合物重量的0.5％至10％，更優(yōu)選0.75％至8％，最優(yōu)選為1％至6％。
優(yōu)選的熒光增白劑為適合的陰離子，其例子有4,4’-雙-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2:2’-二磺酸二鈉、4,4’-雙-(2-嗎啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2:2’-二磺酸二鈉、4,4’-雙-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2:2’-二磺酸二鈉、4’,4”-雙-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2-磺酸一鈉、4,4’-雙-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羥乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2’-二磺酸二鈉、4,4’-雙-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2’-二磺酸二鈉、4,4’-雙-(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羥乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2’-二磺酸二鈉、2-(芪基-4”-(萘并-1’,2’:4,5)-1,2,3-三唑-2”-磺酸鈉和4,4’-雙-(2-磺基苯乙烯基)聯(lián)苯。
其他有用的聚合物料是聚乙二醇，特別是分子量為1000-10000，更特別是2000至8000，最優(yōu)選為約4000的聚乙二醇。按重量計(jì)，這些物料的使用濃度為0.20-5％，更優(yōu)選為0.25-2.5％。在過渡金屬元素雜質(zhì)的存在下，這些聚合物和前述均聚合或共聚合的多羧酸鹽對于改進(jìn)潔白度的保持、織物灰分沉積和對粘土、蛋白質(zhì)性和可氧化污垢的清潔性能具有重要作用。
通常，可用于本發(fā)明組合物中的污垢釋放劑是對苯二酸與1,2-亞乙基二醇和/或丙二醇單元以各種方式的共聚物或三元共聚物。這樣的聚合物例子公開在US 4116885與4711730和EP 0272033中。按照EP0272033，一種特別優(yōu)選的聚合物具有下式結(jié)構(gòu)(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[(T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25((PEG)43CH3)0.75其中PEG為-(OC2H4)O-,PO為(OC3H6O),T為(pOOC6H4CO)。
也非常有用的是作為對苯二酸二甲酯、磺基間苯二酸二甲酯、乙二醇和1,2-丙二醇的無規(guī)共聚物的改性聚酯，末端基團(tuán)主要由磺基苯甲酸酯組成，其次為乙二醇和/或1,2-丙二醇的單酯。目的是“主要”得到兩個(gè)末端均以磺基苯甲酸基結(jié)束的聚合物，在本文中，大多數(shù)所述共聚物將是以磺基苯甲酸基結(jié)束末端的。不過，一些共聚物將是不完全被覆蓋的，因此它們的端基可以由乙二醇和/或1,2-丙二醇的單酯組成，由此構(gòu)成這類聚合物的“次要”部分。
按重量計(jì)，這里所選擇的聚酯含有約46％的對苯二甲酸二甲酯、約16％的1,2-丙二醇、約10％的乙二醇、約13％的磺基苯甲酸二甲酯和約15％磺基間苯二甲酸，分子量約為3000。該聚酯及其制備方法詳細(xì)描述在EP 311342中。
軟化劑織物軟化劑也可以加入按照本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物中。這些軟化劑可以是無機(jī)或有機(jī)的類型。無機(jī)軟化劑例如有公開在GB-A-1400898和US 5019292中的綠土。有機(jī)的織物軟化劑包括公開在GB-A-1 514276和EP 0011340中的水不溶性叔胺，它們與單C12-C14季銨鹽的結(jié)合公開在EP-B-0 026528中，以及公開在EP 0242919中的二長鏈酰胺。其他有用的織物軟化系統(tǒng)的有機(jī)成分包括公開在EP0299575和0313146中的高分子聚氧乙烯物料。
按重量計(jì)，綠土的濃度范圍通常為5％至15％，更優(yōu)選為8-12％，該物料是作為干燥的混合組分加入到制劑的其他組分中的。按重量計(jì)，諸如水不溶性叔胺或二長鏈酰胺物料等有機(jī)的織物軟化劑的加入濃度為0.5至5％，通常為1至3％，而高分子聚氧乙烯物料和水溶性陽離子物料的加入濃度為0.1至2％，通常為0.15至1.5％。這些物料通常被加入到組合物的噴霧干燥的部分中，不過在某些情況下，可以更為方便地將其作為干燥的混合顆粒加入、或作為熔化的液體噴淋到組合物的其他固體組分上。
聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑按照本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以含有0.001至10％、優(yōu)選為0.01至2％、更優(yōu)選為0.05至1％(按重量計(jì))的聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑。通常向洗滌劑組合物中加入所述的聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑，是為了抑制染料從染色的織物轉(zhuǎn)移到與之一起洗滌的織物上。在從染色的織物中洗下來的褪色染料附著于洗滌中的其他物品上之前，這些聚合物能夠絡(luò)合或吸收這些染料。
尤其適用的聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑是聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮與N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或它們的混合物。
加入這樣的聚合物也提高了按照本發(fā)明的酶的性能。
按照本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是液體、糊狀、凝膠、條狀或顆粒形式。
可以按照例如公開在US 4106991和4661452(均為Novo IndustriA/S)中的方法產(chǎn)生無塵顆粒，并且可以任選地按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行包衣。蠟狀包衣材料的例子有聚(氧乙烯)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG)，其平均分子量為1000至20000；具有16至50個(gè)環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中醇含有12至20個(gè)碳原子，并且其中具有15至80個(gè)環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸的單、二和三甘油酯。適用于流體床技術(shù)的成膜包衣材料例子由GB 1483591給出。
按照本發(fā)明的顆粒組合物也可以是“致密的形式”，也就是它們可以具有比常規(guī)顆粒洗滌劑相對更高的密度，也就是550至950g/l；在這種情況下，按照本發(fā)明的顆粒洗滌劑組合物與常規(guī)的顆粒洗滌劑相比，將含有更少量的“無機(jī)填料鹽”；典型的填料鹽是堿土金屬的硫酸鹽和氯化物，一般為硫酸鈉；“致密的”洗滌劑一般含有不超過10％的填料鹽。按照本發(fā)明的液體組合物也可以是“濃縮的形式”，在這種情況下，按照本發(fā)明的液體洗滌劑組合物與常規(guī)的液體洗滌劑相比，將含有更少量的水。一般地，以洗滌劑組合物的重量計(jì)，濃縮的液體洗滌劑的水分含量小于30％，更優(yōu)選為小于20％，最優(yōu)選為小于10％。
本發(fā)明組合物例如可以配制成適合手洗和機(jī)洗的衣物洗滌劑組合物，包括洗衣添加劑組合物和適用于著色織物預(yù)處理的組合物，漂洗中加入的織物軟化劑組合物，和用于一般家庭硬物表面清潔與餐具清潔的組合物。
下列實(shí)例意圖例證本發(fā)明的組合物，而不是限制或規(guī)定本發(fā)明的范圍。
在洗滌劑組合物中，縮略的組分符號具有下列含義LAS直鏈C12烷基苯磺酸鈉TAS牛脂烷基硫酸鈉XYAS C1X-C1Y烷基硫酸鈉SS 式2-丁基辛酸的次級皂類表面活性劑25EY 與平均為Y摩爾的環(huán)氧乙烷縮合的主要為C12-C15的直鏈伯醇45EY 與平均為Y摩爾的環(huán)氧乙烷縮合的主要為C14-C15的直鏈伯醇XYEZS 每摩爾與平均為Z摩爾的環(huán)氧乙烷縮合的C1X-C1Y烷基硫酸鈉非離子物質(zhì) 平均乙氧基化度為3.8、平均丙氧基化度為4.5的C13-C15混合的乙氧基化/丙氧基化脂肪醇，商品名為Plurafax LF404,BASF Gmbh生產(chǎn)CFAA C12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺TFAA C16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺硅酸鹽 非晶形的硅酸鈉(SiO2∶Na2O比例=2.0)NaSKS-6式d-Na2Si2O5的結(jié)晶性多層硅酸鹽碳酸鹽 無水碳酸鈉磷酸鹽 三磷酸鈉MA/AA 1∶4馬來酸/丙烯酸共聚物，平均分子量約80000聚丙烯酸酯 平均分子量為8000的聚丙烯酸酯均聚物，商品名為PA30,BASF Gmbh生產(chǎn)沸石A 式Nal2(AlO2SiO2)12,27H2O的水合硅鋁酸鈉，主要粒徑在1至10微米范圍內(nèi)檸檬酸鹽 檸檬酸三鈉二水合物檸檬酸 檸檬酸過硼酸鹽 無水過硼酸鈉一水合物漂白劑，經(jīng)驗(yàn)式為NaBO2.H2O2PB4無水過硼酸鈉四水合物過碳酸鹽 無水過碳酸鈉漂白劑，經(jīng)驗(yàn)式為2Na2CO3.3H2O2TAED 四乙?；叶稢MC羧甲基纖維素鈉DETPMP 二乙三胺五(亞甲基膦酸)，商品名為Dequest2060，孟山都公司有售PVP聚乙烯吡咯烷酮聚合物EDDS 乙二胺-N,N’-二琥珀酸，鈉鹽形式的[S,S]異構(gòu)體泡沫抑制劑 25％石蠟(熔點(diǎn)50℃),17％疏水性硅石，58％石蠟油顆粒狀泡沫 12％聚硅氧烷/硅石，18％十八烷醇，70％顆抑制劑 粒形式的淀粉硫酸鹽 無水硫酸鈉HMWPEO 高分子量的聚氧乙烯TAE 25 牛脂醇乙氧基化物(25)洗滌劑實(shí)例Ⅰ如下可以制得按照本發(fā)明的顆粒狀織物清洗組合物直鏈C12烷基苯磺酸鈉 6.5硫酸鈉 15.0沸石A26.0次氮基三乙酸鈉 5.0本發(fā)明的酶 0.1PVP 0.5TAED 3.0硼酸 4.0過硼酸鹽 18.0苯酚磺酸鹽 0.1次要成分 加至100
洗滌劑實(shí)例Ⅱ如下可以制得按照本發(fā)明的致密顆粒狀織物清潔組合物(密度為800g/l)45AS8.025E3S 2.025E53.025E33.0TFAA2.5沸石A 17.0NaSKS-6 12.0檸檬酸 3.0碳酸鹽 7.0MA/AA 5.0CMC 0.4本發(fā)明的酶 0.1TAED6.0過碳酸鹽22.0EDDS0.3顆粒狀泡沫抑制劑3.5水/次要成分 加至100％洗滌劑實(shí)例Ⅲ如下制得尤其可用于彩色織物洗滌的按照本發(fā)明的顆粒狀織物清潔組合物L(fēng)AS 10.7-TAS 2.4 -TFAA - 4.045AS 3.1 10.045E7 4.0 -
25E3S - 3.068E11 1.8 -25E5 - 8.0檸檬酸鹽 15.07.0碳酸鹽- 10檸檬酸2.5 3.0沸石A 32.125.0Na-SKS-6 - 9.0MA/AA 5.0 5.0DETPMP0.2 0.8本發(fā)明的酶0.100.05硅酸鹽2.5 -硫酸鹽5.2 3.0PVP 0.5 -聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物/- 0.2乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮的共聚物過硼酸鹽 1.0 -苯酚磺酸鹽0.2 -水/次要成分 加至100％洗滌劑實(shí)例Ⅳ如下可以制得提供“洗滌中軟化”能力的按照本發(fā)明的顆粒狀織物清潔組合物45AS - 10.0LAS 7.6 -68AS 1.3 -45E7 4.0 -25E3 - 5.0
氯化椰油烷基-二甲基羥1.4 1.0乙基銨檸檬酸鹽 5.0 3.0Na-SKS-6 - 11.0沸石A15.015.0MA/AA4.0 4.0DETPMP 0.4 0.4過硼酸鹽 15.0-過碳酸鹽 - 15.0TAED 5.0 5.0綠土 10.010.0HMWPEO - 0.1本發(fā)明的酶 0.100.05硅酸鹽 3.0 5.0碳酸鹽 10.010.0顆粒狀泡沫抑制劑 1.0 4.0CMC 0.2 0.1水/次要成分 加至100％洗滌劑實(shí)例V如下可以制得按照本發(fā)明的高效型液體織物清潔組合物Ⅰ ⅡLAS酸形式- 25.0檸檬酸 5.0 2.025AS酸形式 8.0 -25AE2S酸形式 3.0 -25AE78.0 -CFAA 5 -DETPMP 1.0 1.0
脂肪酸 8 -油酸 - 1.0乙醇 4.0 6.0丙二醇 2.0 6.0本發(fā)明的酶 0.100.05氯化椰油 烷基二甲基羥乙 - 3.0基銨綠土 - 5.0PVP 2.0 -水/次要成分加至100％紡織品應(yīng)用在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶在生物拋光過程中的用途。生物拋光是對紗表面進(jìn)行的一種特殊處理，它可提高織物的手感和外觀質(zhì)量，且不損失織物的可濕性。生物拋光最重要的效果特征在于較少起毛和起球、增加光澤/光亮、提高織物手感、增加柔軟持久性和改變水吸收本領(lǐng)。通常在生產(chǎn)編織和紡織織物的濕潤過程中進(jìn)行生物拋光。濕潤過程例如包括下列步驟，脫漿、擦洗、漂白、洗滌、染色/印花和涂飾。每一步過程中，織物或多或少地受到機(jī)械作用。一般來說，紡織品在編織或紡織后，對織物要進(jìn)行脫漿步驟，隨后為擦洗等步驟。脫漿是除去紡織品上漿料的作用。在機(jī)械織布機(jī)上進(jìn)行紡織之前，為了提高拉伸強(qiáng)度，經(jīng)常在經(jīng)紗上涂上淀粉漿或淀粉衍生物。紡織后，為了保證均勻和耐洗效果，必須在對織物進(jìn)行進(jìn)一步處理之前除去所涂上的漿料。已知為了達(dá)到生物拋光效果，需要結(jié)合使用纖維分解作用和機(jī)械作用。還已知在纖維素酶處理與常規(guī)的軟化劑處理結(jié)合時(shí)，可達(dá)到“超柔軟性”效果。預(yù)期本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶用于纖維素織物的生物拋光是有利的，例如能夠?qū)崿F(xiàn)更徹底的拋光。應(yīng)用例如WO 93/20278所述的方法可以獲得生物拋光。
石洗已知為染色織物、尤其是斜紋粗棉布織物或牛仔褲提供“石洗”外觀(顏色的局部磨損)的方法是在浮石存在下洗滌由這樣的織物制成的斜紋粗棉布或牛仔褲，以提供所需的織物顏色局部變淺，或者是用酶特別是用纖維素分解酶處理織物。既可以單獨(dú)用本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行處理，例如公開在US 4832864中的方法，也可以與傳統(tǒng)少于過程所需量的浮石結(jié)合使用，還可以與珍珠巖結(jié)合使用，例如公開在WO95/09225中的方法。
紙漿和紙的應(yīng)用在造紙紙漿工業(yè)中，本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶可以被有利地應(yīng)用，例如下述-用于去皮在機(jī)械轉(zhuǎn)桶去皮之前用內(nèi)切葡聚糖酶預(yù)處理可以降解形成層，有利于節(jié)約能量。
-用于脫纖維在精制或打漿之前用內(nèi)切葡聚糖酶處理含纖維素纖維的物料，由于纖維間表面上的纖維素酶的水解作用，可以減少能量消耗。與已知酶的使用相比，內(nèi)切葡聚糖酶的使用可以更好地節(jié)約能量，因?yàn)閾?jù)信，本發(fā)明的酶組合物具有更高的穿透纖維壁的能力。
-用于纖維改性作用，也就是改進(jìn)纖維性質(zhì)，其中需要穿越纖維壁的部分水解作用，這要求穿透更深的酶(例如，為了使粗纖維更柔韌)。對高產(chǎn)量紙漿來說，例如機(jī)械紙漿或回收紙漿混合物，纖維的深處理目前尚不可能。這歸因于纖維壁結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，由于纖維壁孔基質(zhì)的物理限制，該結(jié)構(gòu)防止酶分子的通過。預(yù)期本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶能夠透入纖維壁。
-用于改進(jìn)排水。用水解酶例如纖維素酶處理紙漿，可以提高造紙紙漿的排水能力。使用本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶可能更為有效，導(dǎo)致諸如在碎屑部分(由纖維碎片組成)強(qiáng)烈水合的微纖維束高度疏松(該碎屑部分通過阻斷纖維間和造紙機(jī)線網(wǎng)中的空隙可限制排水率)。當(dāng)用纖維素酶處理紙漿時(shí)，其加拿大標(biāo)準(zhǔn)自由度(CSF)升高，Schopper-Riegler排水指數(shù)降低，例如參見US專利4923565；TAPPIT227,SCANC19:65.ence.
-用于纖維間成鍵。在造紙紙漿的生產(chǎn)中應(yīng)用水解酶以提高纖維間的成鍵。酶可清洗掉纖維表面的雜質(zhì)，例如纖維素碎片，于是擴(kuò)大了附著于纖維壁的纖維素的暴露面積，進(jìn)而提高了纖維至纖維的氫鍵能力。該過程也被稱為去角質(zhì)化。由含有纖維素酶的酶制劑所產(chǎn)生的紙和紙板的強(qiáng)度增加，克數(shù)減少，表面更光滑，可印刷性提高。
-用于酶的脫墨。利用水解酶如纖維素酶在打漿過程中或緊接打漿后進(jìn)行回收紙的部分水解，已知能促進(jìn)油墨顆粒的除去和附聚。本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶的使用可以更為有效地疏松表面結(jié)構(gòu)中的油墨，因?yàn)樵撁阜肿幽芨玫赝溉肜w維壁的纖絲基質(zhì)內(nèi)，于是軟化表面，由此有效地疏松油墨顆粒。疏松的油墨顆粒的附聚作用也得以增強(qiáng)，這是因?yàn)閷Ω街诎l(fā)源于纖維的油墨顆粒上的纖維素片段進(jìn)行了更為有效的水解作用。
木質(zhì)纖維素紙漿的處理例如可按照WO 91/14819、WO91/14822、WO 92/17573和WO 92/18688所述的方法進(jìn)行。
植物材料的降解在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶和/或酶制劑用于降解植物材料例如細(xì)胞壁方面的用途。
預(yù)期本發(fā)明新穎的內(nèi)切葡聚糖酶和/或酶制劑可用于制備酒、果汁或蔬菜汁，以提高產(chǎn)量。按照本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶也可以用于各種植物細(xì)胞壁來源的物料或廢料的酶水解作用，例如農(nóng)業(yè)殘余物，如麥秸、玉米穗軸、玉米全植株、堅(jiān)果殼、草、蔬菜皮、豆皮、廢谷粒、制糖用甜菜漿，等等。可以對植物材料進(jìn)行降解，以改進(jìn)不同種類的處理過程，促進(jìn)其他組分的純化或提取，象谷類植物中β葡聚糖或β葡聚糖低聚物的純化，提高飼料價(jià)值，降低水結(jié)合能力，提高廢水廠的降解能力，提高例如草和玉米向青貯飼料的轉(zhuǎn)化，等等。
實(shí)施例下列實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，諸實(shí)施例不以任何方式限制所要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。
材料和方法纖維素分解活性本發(fā)明的纖維素酶變體表現(xiàn)出改進(jìn)的性能。一些變體可表現(xiàn)出關(guān)于催化活性提高的改進(jìn)性能。
在本

發(fā)明內(nèi)容
中，纖維素酶活性以S-CEVU表示。纖維素分解酶水解CMC，由此提高保溫混合物的粘度。可用一種振動(dòng)粘度計(jì)(例如MIVI 3000，來自法國Sofraser)測定粘度的降低。
可以按照下列分析方法(試驗(yàn))測定纖維素分解活性，以S-CEVU表示通過測量樣本降低羧甲基纖維素(CMC)溶液粘度的能力，S-CEVU試驗(yàn)可定量測定該樣本中存在的催化活性的量。該試驗(yàn)的進(jìn)行條件為40℃；pH 7.5；0.1M磷酸鹽緩沖液；時(shí)間30分鐘；使用降低CMC(羧甲基纖維素Hercules 7 LFD)底物粘度的相對酶標(biāo)準(zhǔn)；酶濃度約為0.15 S-CEVU/ml。主要標(biāo)準(zhǔn)(arch standard)定義為8200 S-CEVU/g。
實(shí)施例1纖維素酶變體的制備根據(jù)所公開的序列比較(表1)和計(jì)算機(jī)模擬方法，119位被識別為值得關(guān)注的特定的點(diǎn)，可用于制備纖維素酶變體。119位(纖維素酶編號方式)位于距離底物3內(nèi)。在119位，野生型Humicola insolens纖維素酶具有組氨酸殘基(H)，而野生型Thielavia terrestris纖維素酶具有谷氨酰胺殘基(Q)。
本實(shí)驗(yàn)中，用組氨酸取代Thielavia terrestris纖維素酶中的谷氨酰胺(由此得到纖維素酶變體Thielavia terrestris/Q119H)。對所得變體測試其比活性。
除非另有所述，所有的Humicola insolens變體均用來自Stratagene的ChameleonTM雙鏈位點(diǎn)特異性誘變試劑盒進(jìn)行構(gòu)建。使用下列合成的寡核苷酸作為選擇引物S/M GAATGACTTGGTTGACGCGTCACCAGTCAC，或M/S GAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCAC.
S/M用MIuⅠ位點(diǎn)取代了質(zhì)粒的β-內(nèi)酰胺酶基因中的ScaⅠ位點(diǎn)，M/S則相反。后者用來在由第一個(gè)選擇引物所生成的變體中引入次級突變。
為了構(gòu)建Thielavia terrestris纖維素酶變體，使用Thielaviaterrestris EG V纖維素酶cDNA，該cDNA可從以DSM 10811保藏的質(zhì)粒中得到。按照《布達(dá)佩斯條約》，DSM 10811于1995年6月30日保藏于德意志微生物保藏中心。質(zhì)粒用限制性內(nèi)切核酸酶BamHⅠ和NotⅠ消化。分離4153bp載體部分和1211bp BamHⅠ-NotⅠ片段。分別用HgiAⅠ和EcoRⅤ消化等量的1211bp片段，分離出487bp BamHⅠ-HgiAⅠ和690bp EcoRⅤ-NotⅠ片段。
在5倍摩爾過量的合成DNA片段的存在下，連接這些片段和載體部分，該合成DNA片段得自下述兩個(gè)單鏈DNA寡聚物的退火物18802:CACTGGCGGCGACCTGGGATCTAACCACTTCGAT18803:ATCGAAGTGGTTAGATCCCAGGTCGCCGCCTGTGCTC將連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株XL1中，從所得轉(zhuǎn)化體中分離出Thielavia terrestris/Q119H，用DNA測序驗(yàn)證。
所有纖維素酶變體都是由下述方法產(chǎn)生的，即克隆基因，并利用在真菌淀粉酶啟動(dòng)子與來自黑曲霉的AMG終止子之間插入了該基因的質(zhì)粒，將該基因轉(zhuǎn)化到米曲霉中(Christensen,T.Woldike,H.Boel,E.,Mortensen,S.B.,HjortshФj,K.,Thim,L.和Hansen,M.T.(1988)，生物技術(shù)，6:1419-1422)。
利用它們與微晶纖維素的結(jié)合，對具有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域CBD的纖維素酶進(jìn)行純化。發(fā)酵后通過從生產(chǎn)生物體中分離細(xì)胞外液而回收克隆產(chǎn)物。然后用親和色譜法高度純化纖維素酶，該方法使用150克微晶纖維素與pH7.5、20mM磷酸鈉的懸液。將微晶纖維素懸液與總共含有約1克蛋白質(zhì)的粗發(fā)酵液混合。在4℃下混合20分鐘后，將微晶纖維素一結(jié)合酶裝入柱子中，柱子大小為50倍200mm，共約400ml。
柱子用200ml緩沖液洗滌，然后用相同緩沖液中的0.5M NaCl洗滌，直至不再有蛋白質(zhì)洗脫出來，再用500ml緩沖液洗滌(20mMTris,pH8.5)。最后，純的全長酶用pH11.8的1％三乙胺洗脫。洗脫出的酶溶液調(diào)至pH8，用具有DOW GR61PP膜(截留20KD分子的聚丙烯)的Amicon管單元濃縮至5mg蛋白質(zhì)/ml。酶已完全被純化，在SDS-PAGE中得到一條帶。
天然缺乏CBD、或接頭已被蛋白水解切割、或通過在催化結(jié)構(gòu)域后引入終止密碼子而除去了CBD的纖維素酶不能用微晶纖維素純化?；厥盏募?xì)胞外蛋白質(zhì)中無生產(chǎn)生物體。用陽離子交換色譜法純化核心纖維素酶而去除曲霉屬蛋白質(zhì)。將發(fā)酵液調(diào)至pH3.5，過濾除去沉淀的蛋白質(zhì)。然后在截留6KD分子的DOW GR81PP膜上超濾蛋白質(zhì)(濃縮并用水洗滌)，直至洗出液的電導(dǎo)率小于1000mS/cm。最后將樣本上柱，柱子是已用pH3.5的20mM檸檬酸鹽緩沖液平衡的S-Sepharose柱。
該酶將在此低pH下與S-Sepharose結(jié)合，用梯度為0至500mM的NaCl洗脫時(shí)，它作為單峰而洗脫下來。洗脫出的純酶在具有DOWGR81PP膜的Amicon管中濃縮。所有純化的纖維素酶在SDS-PAGE中均為一條帶。
比活性數(shù)據(jù)總結(jié)在下表中

從本實(shí)驗(yàn)可以看到，通過向Thielavia terrestris纖維素酶引入突變Q119H，所得纖維素酶變體的比活性升高到同源的Humicola insolens纖維素酶的水平。
實(shí)施例2具有改進(jìn)的堿性性能曲線的Thielavia terrestris變體在本實(shí)驗(yàn)中，如實(shí)施例1所述構(gòu)建Thielavia terrestris/Q119D，不過使用下列構(gòu)建方法如下所述，為了便于盒交換和標(biāo)準(zhǔn)引物利用，對編碼CT1的DNA添加上一個(gè)C末端Xba1位點(diǎn)，并亞克隆到pCaHj418載體中。在一個(gè)反應(yīng)程序?yàn)?4℃2′-3×(94℃30″-72℃1′)-25×(94℃30″-55℃30″-72℃1′)-72℃5′的Pwo聚合酶PCR中，利用PCT1作為模板，并應(yīng)用下述兩種引物8939: CGACTTCAATGTCCAGTCGG25335: GCGCTCTAGAGGATTAAAGGCACTGC所得718bp PCR產(chǎn)物用Sal1和Xba1消化，分離出165bp片段。該片段與來自pCT1-2的833bp BamH1-Sal1片段一起連接至pCaHj418的4.1kb Xba1-BamH1載體片段中。
從該連接中，從大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中分離出pCT1418。
如上所述，通過ChameleonTM雙鏈位點(diǎn)特異性誘變試劑盒(來自Stratagene)構(gòu)建PCT2，其中用pCT1418作為模板，用S/M引物作為選擇引物，并用下列誘變引物109330:CGACCTGGGATCGAACGACTTCGATATCGCCATGC分離出成功突變的質(zhì)粒pCT2，經(jīng)DNA測序驗(yàn)證，轉(zhuǎn)化至米曲霉菌株JaL228中。
如實(shí)施例9所述，在pH7.0和pH10.0下，測試Thielavia terrestris纖維素酶和Thielavia terrestris/Q119D變體對PASC的活性。
結(jié)果列在下表中，其中比較了pH10與pH7下的活性。證明了Thielavia terrestris/Q119D變體與母體Thielavia terrestris纖維素酶相比，其堿性活性相對更高。


實(shí)施例3纖維素酶雜合變體的構(gòu)建質(zhì)粒pCT3具有編碼Thielavia terrestris內(nèi)切葡聚糖酶核心酶的DNA以及隨后的灰腐質(zhì)霉的接頭CBD。
應(yīng)用PWO聚合酶，借助于序列重疊延伸PCR構(gòu)建pCT3。
從灰腐質(zhì)霉的一個(gè)cDNA克隆，由下列引物生成一個(gè)415bp片段109452:CGACTCCAGCTTCCCCGTCTTCACGCCCCC107819:CGAGCTTCTAGATCTCGACTAGAGGCACTGGGAG從pCT1418(公開在實(shí)施例2中)，由下列引物生成一個(gè)876bp PCR片段101621:GGATGCCATGCTTGGAGGATAGCAACC107823:GGGGGCGTGAAGACGGGAAGCTGGAGTCG對兩個(gè)反應(yīng)來說，使用下列設(shè)置96℃1′-3×(94℃30″-50℃1′-72℃1′)-25×(94℃30″-61℃30″-72℃1′)-72℃7′。
將分離出的各PCR片段用作一個(gè)組合PCR反應(yīng)的模板，使用引物101621和107819,PCR設(shè)置如下94℃1′-3×(94℃30″-70℃1′-72℃2′)-20×(94℃30″-61℃30″-72℃1′5″)-72℃7′。
分離出所得的1261bp PCR產(chǎn)物，用限制酶BamH1和Xba1切割，分離出所得的1172bp DNA中片段，將它們連接至經(jīng)BamH1-Xba1消化的pCaHj418的4.1kb載體片段中。
分離出正確的克隆，對分離自源于上述連接反應(yīng)的大腸桿菌XL1轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序以證實(shí)正確的克隆。
灰腐質(zhì)霉的cDNA序列CAAGAACCTCACACTCATTTTATTCACGCTCATTTATTCTAAAACTTCAATATGCGCTCTGCTCCTATTTTCCGCACGGCCCTGGCGGCTGCGCTCCCCCTTGCCGCACTCGCCGCCGATGGCAAGTCGACCAGATACTGGGACTGCTGCAAGCCATCGTGCTCTTGGCCCGGAAAGGCACTCGTGAACCAGCCTGTCTTCACTTGCGACGCCAAATTCCAGCGCATCACCGACCCCAATACCAAGTCGGGCTGCGATGGCGGCTCGGCCTTTTCGTGTGCTGACCAGACCCCCTGGGCTCTGAACGACGATGTCGCCTATGGCTTCGCTGCCACGGCTATTTCGGGTGGATCGGAAGCCTCGTGGTGCTGCGCATGCTACGCTCTTACTTTCACCTCGGGCCCTGTGGCCGGCAAGACCATGGTCGTCCAGTCGACCAACACCGGCGGCGATCTCGGCAGCAACCATTTCGACCTCCAGATTCCAGGCGGCGGTGTCGGCATCTTTGATGGGTGCACCCCCCAGTTCGGAGGTCTCGCTGGCGAACGCTACGGTGGCATCTCAGACCGCAGCTCCTGCGACTCGTTCCCTGCGGCGCTCAAGCCCGGCTGCCTCTGGCGCTTCGATTGGTTCAAGAACGCCGACAACCCGACCTTTACCTTCAAGCAGGTGCAGTGCCCCGCCGAGCTTGTTGCCAGGACCGGCTGCAAGCGCGAGGATGACGGCAACTTCCCCGTCTTCACGCCCCCCGCGGGTAGCAACACCGGCGGTAGCCAGTCGAGCTCCACTATCGCTTCCAGCTCGACCTCCAAGGCTCAGACTTCGGCCGCCAGCTCCACCTCCAAGGCTGTCGTGACTCCCGTCTCCAGCTCCACCTCGAAGGCCGCTGAGGTCCCCAAATCCAGCTCGACCTCCAAGGCTGCCGAGGTCGCCAAGCCCAGCTCAACTTCGACCTCGACCTCGACCTCGACCAAGGTCAGCTGCTCTGCGACCGGTGGCTCCTGCGTCGCTCAGAAGTGGGCGCAGTGCGGCGGCAATGGCTTCACCGGCTGCACGTCGTGCGTCAGCGGCACCACCTGCCAGAAGCAAAATGACTGGTACTCCCAGTGCCTCTAAGTCGTTTGTAGTAGCAGTTTGAAGGATGTCAGGGATGAGGGAGGGAGGAGTGGGGGAAAAGTACGCCGCAGTTTTTTGGTAGACTTACTGTATTGTTGAGTAATTACCCATTCGCTTCTTGTACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA實(shí)施例4雜合纖維素酶變體的構(gòu)建質(zhì)粒pPsF45具有編碼Pseudomonas cellolytica內(nèi)切葡聚糖酶核心酶的DNA，該酶以H.insolens EGV內(nèi)切葡聚糖酶信號肽為首，后面為同一酶的接頭CBD。
利用上述Stratagene Chameleon試劑盒構(gòu)建該雜合酶的兩種變體PsF45/H15S和PsF45/Q119H(纖維素酶編號方式)，其中應(yīng)用下述誘變引物PsF45/H15S: GCTGCAAGCCGTCCTGTGGCTGGAGCGCTAACGTGCCCGCGPsF45/Q119H: CGATGTTTCCGGAGGCCACTTTGACATTCTGGTTCC與模板序列的偏差以粗體表示。
選擇引物可將質(zhì)粒內(nèi)酰胺酶基因中單一Sca1位點(diǎn)轉(zhuǎn)換為Mlu1位點(diǎn)GAATGACTTGGTTGACGCGTCACCAGTCAC兩種變體經(jīng)DNA測序驗(yàn)證，鑒定出了每一種變體的一個(gè)正確克隆。
將攜有變體序列的兩種質(zhì)粒pPsF45H15S和pPsF45Q119H與AMDS選擇質(zhì)粒pToC202一起轉(zhuǎn)化米曲霉菌株JaL142。在經(jīng)由孢子的3次再分離步驟后，從所得轉(zhuǎn)化體中分離出LaC2829和LaC2830。
實(shí)施例5二硫橋的除去二硫橋已知具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。除去纖維素酶中的二硫橋，在保留顯著活性的同時(shí)，將使酶去穩(wěn)定(熱穩(wěn)定性)。當(dāng)需要對該酶進(jìn)行快速滅活，例如在斜紋粗棉布或紡織品應(yīng)用中或在低溫過程中，這可能比較有用。
在本實(shí)施例中，通過突變二硫橋所涉及的兩個(gè)殘基之一或二者，構(gòu)建了Humicola insolens EGV纖維素酶和Humicola insolens纖維素酶的五種變體。按照下文公開的材料和方法，測量比活性。酶的解鏈溫度用差示掃描量熱法(Differential Scanning Calometry,DSC)測量。用MicroCalc公司的MC量熱計(jì)在中性pH(7.0)下進(jìn)行DSC，掃描率恒定，溫度從20℃升至90℃，升溫速率為每小時(shí)升90℃。
結(jié)果列在下表中，這一結(jié)果說明二硫橋的除去引起變體的解鏈溫度顯著降低，但仍保留了顯著活性

>
實(shí)施例6結(jié)合裂隙內(nèi)距離底物＜5的保守殘基的突變在將距離底物5內(nèi)的位置與表1中的序列對比相比較時(shí)，在下列位置上，諸位置的氨基酸殘基類型在對比的纖維素酶中保守6、7、8、9、10、11、12、18、45、112、114、121、127、128、130、132、147、148、149。保守的殘基通常被認(rèn)為對活性是極其重要的，但是本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，在保持顯著活性的同時(shí)，某種變異性也是允許的。只有兩個(gè)殘基D10和D121(纖維素酶編號方式)是保持適當(dāng)活性所必需的。
如材料和方法中公開的內(nèi)容制備Humicola insolens EGV纖維素酶的變體并測定比活性。
突變類型和變體的比活性總結(jié)在下表中


從本實(shí)驗(yàn)可以看到，在保留纖維素酶變體顯著活性的同時(shí)，是能夠?qū)Y(jié)合裂隙內(nèi)的保守殘基進(jìn)行突變的。
實(shí)施例7結(jié)合裂隙中距離底物＜5的非保守殘基的突變根據(jù)表1中的序列對比和所公開的計(jì)算機(jī)模擬方法，位于距離底物5以內(nèi)且在對比序列中不保守的下列殘基鑒定為制備纖維素酶變體的關(guān)注點(diǎn)。
在本實(shí)驗(yàn)中，如以下材料和方法所述，對Humicola insolens EGV纖維素酶中位于距離底物不超過5的非保守殘基進(jìn)行改造，測量其比活性。
突變類型和變體比活性總結(jié)在下表中


從本實(shí)驗(yàn)可以看到，在保留全部或大部分纖維素酶活性的同時(shí)是能夠?qū)Y(jié)合裂隙中大多數(shù)非保守殘基進(jìn)行突變的。
實(shí)施例8對洗滌劑中陰離子表面活性劑的耐受性A·本發(fā)明的變體可表現(xiàn)出改進(jìn)性能，它們對陰離子表面活性劑的敏感性有所改變。陰離子表面活性劑是經(jīng)常加入洗滌劑組合物中的產(chǎn)品。就已測試的纖維素酶來說，纖維素酶的解折疊伴隨著蛋白質(zhì)內(nèi)部熒光的衰減。內(nèi)部熒光來自Trp側(cè)鏈(較小程度上來自Tyr側(cè)鏈)，它對側(cè)鏈環(huán)境的疏水性敏感。解折疊導(dǎo)致親水性更強(qiáng)的環(huán)境，這是由于側(cè)鏈更多地暴露在溶劑中，由此使得熒光熄滅。
熒光用Perkin/ElmerTMLS50熒光分光計(jì)分析。實(shí)際中，通過在280nm下激發(fā)、在345nm下發(fā)射，得到熒光在解折疊時(shí)發(fā)生的巨大改變。在5μg/ml的蛋白質(zhì)濃度下，發(fā)射和激發(fā)的狹縫寬度(調(diào)節(jié)信號強(qiáng)度)通常均為5nm。熒光在2ml石英比色杯中測量，該比色杯用循環(huán)水浴恒溫，并用小塊磁鐵攪拌。磁鐵攪拌器安裝在分光計(jì)內(nèi)。
可以用可得到的軟件實(shí)時(shí)追蹤解折疊。在TimeDrive選項(xiàng)中監(jiān)測快速解折疊(在不到5-10分鐘內(nèi)結(jié)束)，其中每幾(2-5)秒鐘測量一次熒光。對稍慢些的解折疊來說，用Wavelength Program選項(xiàng)能一次測量比色杯支座中的四個(gè)比色杯，其中每30秒鐘測量一次每個(gè)比色杯中的熒光。所有情況下，向恒溫的比色杯溶液中加入少量(一般50μl)的濃縮酶溶液以引發(fā)解折疊，其中利用磁鐵的快速旋轉(zhuǎn)使混合在幾秒鐘內(nèi)完成。
在GraphPad Prism軟件程序中測量數(shù)據(jù)。所有情況中解折疊均為單指數(shù)函數(shù)，由該函數(shù)可以得到解折疊的單半衰期(或解折疊速率常數(shù))。
典型的解折疊條件是a．10mM CAPS pH10,1000ppm LAS,40℃b．10mM HEPES pH10,200ppm LAS,25℃兩種情況中，蛋白質(zhì)濃度均為5-10μg/ml(蛋白質(zhì)濃度不是決定性的，因?yàn)長AS是過量的)。在這些條件下，Humicola insolens纖維素酶的解折疊可與其他酶進(jìn)行比較(表1)。這使我們能夠得出對陰離子表面活性劑的穩(wěn)定性的下列級別順序Thielavia terrestris/Q119H≌Thielavia terrestris》Humicola insolens≌Humicola insolens/H119Q

a．解折疊是雙指數(shù)的。慢周期的t1/2約為120秒。
B．酶的表面靜電學(xué)改變將影響對諸如LAS(直鏈烷基苯磺酸酯)等陰離子表面活性劑的敏感性。尤其是除去了帶正電的殘基和/或引入了帶負(fù)電的殘基的變體，其對LAS的耐受性會提高，相反，也就是引入帶正電的殘基和/或除去帶負(fù)電的殘基將使變體對LAS的耐受性降低。殘基Arg(R)、Lys(K)和His(H)被看作帶正電或可能帶正電的殘基，殘基Asp(D)、Glu(E)和Cys(C)(如果沒有包括在二硫橋中)則被看作是帶負(fù)電或可能帶負(fù)電的殘基。已經(jīng)含有這些殘基之一的位置是誘變的第一目標(biāo)，第二目標(biāo)是在另一種纖維素酶中的等同位置上具有這些殘基之一的那些位置，第三目標(biāo)是暴露于表面的任何殘基。在本實(shí)驗(yàn)中，將野生型Humicola insolens纖維素酶與屬于上述三組的所有Humicolainsolens纖維素酶變體進(jìn)行比較，其中比較它們對洗滌劑中LAS的穩(wěn)定性。
纖維素酶對陰離子表面活性劑的耐受性測量為陰離子表面活性劑存在時(shí)對PASC(磷酸溶脹纖維素)的活性與無陰離子表面活性劑存在時(shí)對PASC的活性之比。
反應(yīng)介質(zhì)含有5.0g/l商業(yè)常用的來自洗滌劑生產(chǎn)商丹麥NOPA的粉末洗滌劑。將洗滌劑制成無表面活性劑的形式以用于本實(shí)驗(yàn)，pH調(diào)至7.0。反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)一步含有0.5g/l PASC，加入或不加入1g/l LAS(直鏈烷基苯磺酸酯，這是一種陰離子表面活性劑)，反應(yīng)在30℃溫度下進(jìn)行30分鐘。纖維素酶的劑量為0.20 S-CEVU/l。保溫30分鐘后，反應(yīng)用2N NaOH終止，通過對羥基苯甲酰肼(p-hydroxybenzoic acidhydrazide)的還原反應(yīng)測定還原性糖末端的量。還原的對羥基苯甲酰肼的吸收度的降低與纖維素酶的活性有關(guān)。
LAS耐受性提高的變體的突變類型和對LAS的耐受性總結(jié)在下表中


從該表可以看到，導(dǎo)致帶正電殘基的除去和/或帶負(fù)電殘基的引入的殘基突變提高了變體對LAS的耐受性。
如上所述，LAS耐受性降低的變體的突變類型和對LAS的耐受性總結(jié)在下表中


從該表可以看到，導(dǎo)致帶正電殘基的引入和/或帶負(fù)電殘基的除去的殘基突變降低了變體對LAS的耐受性。
實(shí)施例9pH活性曲線的改變纖維素酶的pH活性曲線受特異的可滴定基團(tuán)的pH依賴性行為支配，這種基團(tuán)一般是活性部位內(nèi)的酸性殘基。通過改變這些殘基的靜電環(huán)境，能夠改變其pH曲線，這可通過取代帶電或可能帶電的殘基，如Arg(R)、Lys(K)、Tyr(Y)、His(H)、Glu(E)、Asp(D)或Cys(C)(如果不參與二硫橋的話)，或者是在結(jié)合裂隙中距離底物5內(nèi)的位置進(jìn)行突變，改變這些特異的可滴定基團(tuán)的表面可及性而達(dá)到。
在本實(shí)施例中，分別在pH7和pH10下，測試了Humicola insolens纖維素酶和涉及帶電或可能帶電的殘基的取代的Humicola insolens纖維素酶變體對PASC的活性。
為了測定纖維素酶的pH最優(yōu)值，我們選擇了有機(jī)緩沖液，因?yàn)楸娝苤?，比如硼酸鹽與單糖及低聚糖形成共價(jià)絡(luò)合物，磷酸鹽能夠與鈣離子沉淀。在《生物化學(xué)研究數(shù)據(jù)》，牛津科學(xué)出版社，第三版，第223至241頁中，可找到合適的有機(jī)緩沖液。鑒于它們的pKa值，我們決定使用4-5.5范圍內(nèi)的乙酸鈉、6.0的MES、6.5-7.5范圍內(nèi)的MOPS、8.0-8.5范圍內(nèi)的巴比妥酸鈉和9.0-10.5范圍內(nèi)的甘氨酸。
方法方法是在不同pH下酶促降解羧甲基纖維素。制備4.0至10.5范圍內(nèi)的緩沖液，間隔為0.5pH單位。根據(jù)羧甲基纖維素中新還原末端的生成來進(jìn)行分析，目測檢驗(yàn)它們在強(qiáng)堿環(huán)境中與PHBAH的反應(yīng)，生成黃色化合物，該化合物在410nm下具有最大吸收。
實(shí)驗(yàn)方案緩沖液制備稱取0.2mol每種緩沖物質(zhì)，各溶于1升Milli Q水中。將250ml 0.2M緩沖溶液與200ml Milli Q水混合。用RadiometerPHM92實(shí)驗(yàn)室計(jì)測量pH，該實(shí)驗(yàn)室計(jì)已用來Radiometer的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液校準(zhǔn)。用4M NaOH或4M HCl將緩沖液的pH調(diào)至實(shí)際的pH，用水調(diào)至總體積為500ml。當(dāng)調(diào)節(jié)巴比妥酸鈉至pH8.0時(shí)，也許有一些沉淀，可以加熱至50℃而將其再溶解。
乙酸100％0.2mol=12.01gMES 0.2mol=39.04gMOPS 0.2mol=41.86g巴比妥酸鈉0.2mol=41.24g甘氨酸0.2mol=15.01g緩沖液
pH:4.0,4.5,5.0,5.5乙酸鈉0.1MpH:6.0 Na-MES 0.1MpH:6.5,7.0,7.5Na-MOPS 0.1MpH:8.0,8.5 巴比妥酸鈉0.1MpH:9.0,9.5,10.0,10.5 甘氨酸鈉0.1M測量視作主值而無終止試劑的一系列管的真實(shí)pH,pH測量是在40℃保溫20分鐘后進(jìn)行的。
底物制備在帶有磁棒的250ml圓錐形玻璃燒瓶中，將2.0g CMC用2.5ml96％乙醇濕潤，加入100ml Milli Q水，然后在熱磁力攪拌器上煮沸至透明。沸騰約2分鐘后，在磁力攪拌器上冷卻至室溫。
終止試劑溶于2％NaOH的1.5g PHBAH和5g酒石酸鉀鈉。
過程用5ml玻璃試管得到3個(gè)主值和2個(gè)空白值(1個(gè)主值用于pH測定)。

在Heidolph REAX 2000混合器上，以最大速度(9)持久混合。在溫控水浴上的保溫過程中不攪拌。加入PHBAH試劑并混合后，立即煮沸樣本10分鐘。在冷自來水中冷卻5分鐘。在410nm讀取吸收值。
活性測定將2個(gè)主值在410nm的吸收值相加再除以2,2個(gè)空白值相加再除以2,2個(gè)平均值相減。將最大值作為100％，計(jì)算百分率。
將測得的pH對相對活性繪圖。
緩沖試劑乙酸100％，來自MERCK，目錄號1.00063，批號K20928263422,pKa4.76,MW60.05；MES(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)，來自SIGMA，目錄號M-8250，批號68F-5625,pKa6.09,MW195.2；MOPS(3-(N-嗎啉代)丙磺酸)，來自SIGMA，目錄號M-1254，批號115F-5629,pKa7.15,MW209.3；巴比妥酸鈉(5,5-二乙基巴比妥酸鈉鹽)，來自MERCK，目錄號6318，批號K20238018 404,pKa7.98,MW206.2；甘氨酸，來自MERCK，目錄號4201，批號K205535601 405,pKa9.78,MW75.07；PHBAH(對羥基苯甲酰肼)，來自SIGMA，目錄號H-9882，批號53H-7704；酒石酸鉀鈉(酒石酸鉀鈉四水合物)，來自MERCK，目錄號8087，批號A653387 304；NaOH(氫氧化鈉)，來自MERCK，目錄號1.06498，批號C294798404；CMC(羧甲基纖維素)，由Hercules(FMC)7LF提供(1989年11月)。
纖維素酶對陰離子表面活性劑的耐受性測定為中性pH(pH7.0)下對PASC(磷酸溶脹纖維素)的活性與堿性pH(pH10.0)下對PASC的活性之比。反應(yīng)介質(zhì)含有5.0g/l商業(yè)上常用的來自洗滌劑生產(chǎn)商丹麥NOPA的粉末洗滌劑。分別將pH調(diào)至pH7.0和pH10.0。反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)一步含有0.5g/l PASC，反應(yīng)在30℃溫度下進(jìn)行30分鐘。纖維素酶的劑量為0.20 S-CEVU/l。保溫30分鐘后，用2N NaOH終止反應(yīng)，通過對羥基苯甲酰肼的還原反應(yīng)測定還原性糖末端的量。還原了的對羥基苯甲酰肼的吸收值的降低與纖維素酶的活性有關(guān)。
結(jié)果結(jié)果列在下表中，將pH10相對于pH7下的活性與野生類型的Humicola insolens纖維素酶的活性進(jìn)行比較。

從上表可以看到，通過產(chǎn)生涉及可能帶電的殘基的變體和/或改變結(jié)合裂隙中距離底物小于5的殘基，能夠提高相對堿性活性。
類似地，下表說明，通過涉及可能帶電的殘基的其他突變和/或改變結(jié)合裂隙中距離底物小于5的殘基，能夠提高相對酸性活性。



因此，本實(shí)施例證實(shí)，通過產(chǎn)生涉及可能帶電的殘基的變體和/或改變結(jié)合裂隙中距離底物小于5的殘基，可以使相對活性的pH曲線向酸性或堿性pH改變。
實(shí)施例10所制備的抗陰離子表面活性劑的纖維素酶的洗滌性能在0.1升mini-Terg-o-Meter中，以與纖維素酶一起洗滌的磨損的黑棉樣本的“顏色澄清度”測量所制備的抗陰離子表面活性劑的纖維素酶的應(yīng)用效果以及天然纖維素酶的應(yīng)用效果。在不同陰離子表面活性劑濃度中進(jìn)行洗衣。
反應(yīng)介質(zhì)含有pH7.0的磷酸鹽緩沖液和范圍在0.2-1.0g/L的不同濃度的LAS。兩個(gè)樣本在40℃下洗滌30分鐘，漂洗，然后干燥。該洗衣周期重復(fù)四次。所有的酶均在每個(gè)LAS濃度下進(jìn)行測試。
最后，相對于用不同劑量天然纖維素酶即來自Humicola insolensDSM 1800的真菌43kD內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶(可以商品名Carezyme購得)洗滌的類似樣本標(biāo)準(zhǔn)，對黑棉條進(jìn)行評分，效果以PSU(布塊得分單位)表示。

權(quán)利要求
1·含有表現(xiàn)出纖維素分解活性的催化性核心結(jié)構(gòu)域的酶變體，該變體通過氨基酸殘基的取代、插入或缺失或者它們的任意組合而得自一種天然存在的母體纖維素酶，并且-在5位(纖維素酶編號方式)具有丙氨酸殘基(A)、絲氨酸殘基(S)或蘇氨酸殘基(T)；-在8位(纖維素酶編號方式)具有苯丙氨酸殘基(F)或酪氨酸殘基(Y)；-在9位(纖維素酶編號方式)具有苯丙氨酸殘基(F)、色氨酸殘基(W)或酪氨酸殘基(Y)；-在10位(纖維素酶編號方式)具有天冬氨酸殘基(D)；-在121位(纖維素酶編號方式)具有天冬氨酸殘基(D)。
2·根據(jù)權(quán)利要求1的變體，該變體在119位(纖維素酶編號方式)具有的氨基酸殘基選自下列成員組氨酸(H)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)；優(yōu)選選自組氨酸(H)和天冬氨酸(D)。
3·根據(jù)權(quán)利要求1或2的變體，該變體在6位(纖維素酶編號方式)具有選自蘇氨酸(T)和絲氨酸(S)的一個(gè)氨基酸殘基。
4·根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的變體，該變體在7位(纖維素酶編號方式)具有的氨基酸殘基選自下列成員精氨酸(R)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、色氨酸(W)和賴氨酸(K)，優(yōu)選選自精氨酸(R)、亮氨酸(L)和異亮氨酸(I)。
5·一種纖維素酶變體，該變體具有下列二硫橋中的4個(gè)或更多個(gè)C11-C135；C12-C47；C16-C86；C31-C56；C87-C199；C89-C189和C156-C167(纖維素酶編號方式)。
6·根據(jù)權(quán)利要求5的纖維素酶變體，該變體具有下列二硫橋中的5個(gè)或更多個(gè)C11-C135；C12-C47；C16-C86；C31-C56；C87-C199；C89-C189和C156-C167(纖維素酶編號方式)。
7·根據(jù)權(quán)利要求5的纖維素酶變體，該變體具有下列二硫橋中的6個(gè)或更多個(gè)C11-C135；C12-C47；C16-C86；C31-C56；C87-C199；C89-C189和C156-C167(纖維素酶編號方式)。
8·根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的纖維素酶變體，在該變體中，在16、86、87、89、189和/或199位(纖維素酶編號方式)中的一個(gè)或多個(gè)位置，半胱氨酸殘基被不同的天然氨基酸殘基所取代。
9·根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的纖維素酶變體，該變體選自由衍生自Humicola insolens內(nèi)切葡聚糖酶V(EGV)的下述變體組成的組C12G/C47M、C47G、C87M/C199G和C16M/C86G。
10·一種降低纖維素酶熱穩(wěn)定性的方法，該方法包括通過氨基酸的取代、缺失或插入而除去下述二硫橋中的一個(gè)或多個(gè)C11-C135；C12-C47；C16-C86；C31-C56；C87-C199；C89-C189和C156-C167(纖維素酶編號方式)。
11·一種纖維素酶變體，該變體是通過在位于底物結(jié)合裂隙中距離底物在酶-底物相互作用距離內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處進(jìn)行取代、插入和/或缺失而得自母體纖維素酶。
12·根據(jù)權(quán)利要求11的纖維素酶變體，該變體是通過在位于底物結(jié)合裂隙中距離底物不超過5的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處進(jìn)行取代、插入和/或缺失而得自母體纖維素酶。
13·根據(jù)權(quán)利要求12的纖維素酶變體，該變體是通過在下列位置中的一處或多處進(jìn)行取代、插入和/或缺失而得自母體纖維素酶4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、19、20、21、21a、42、44、45、47、48、49、49a、49b、74、82、95j、110、111、112、113、114、115、116、119、121、123、127、128、129、130、131、132、132a、133、145、146、147、148、149、150b、178和/或179(纖維素酶編號方式)。
14·根據(jù)權(quán)利要求12的纖維素酶變體，該變體是通過在下列位置中的一處或多處進(jìn)行取代、插入和/或缺失而得自母體纖維素酶4、5、13、14、15、16、19、20、21、21a、42、44、47、48、49、49a、49b、74、82、95j、110、111、113、115、116、119、123、129、131、132a、133、145、146、150b、178和/或179(纖維素酶編號方式)。
15．根據(jù)權(quán)利要求13的纖維素酶變體，其選自由得自Humicolainsolens內(nèi)切葡聚糖酶V(EGV)的下列變體組成的組T6S,R7I,R7W,Y8F,W9F,C12M/C47G,W18Y,W18F,S45T,S45N,D114N,F132D,Y147D,Y147C, Y147W,Y147V,Y147R,Y147G,Y147Q,Y147N,Y147K,Y147H,Y147F和Y147S。
16．根據(jù)權(quán)利要求13的纖維素酶變體，其選自由得自Humicolainsolens內(nèi)切葡聚糖酶V(EGV)的下列變體組成的組R4H,R4Q,K13L,K13R,K13Q,P14A,P14T,S15T,S15H,C16M/C86G,A19P,A19T,A19G,A19S,K20G,D42Y,D42W,C47G,E48D,E48Q,E48D/P49*,E48N/P49*,S110N,L115I,G116D,H119R,H119Q,H119F,N123A,N123M,N123Q,N123Y,N123D,V129L,D133N和D178N。
17·根據(jù)權(quán)利要求11的纖維素酶變體，該變體是通過在位于底物結(jié)合裂隙中距離底物不超過3的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處進(jìn)行取代、插入和/或缺失而得自母體纖維素酶。
18·根據(jù)權(quán)利要求17的纖維素酶變體，該變體是通過在下列位置中的一處或多處進(jìn)行取代、插入和/或缺失而得自母體纖維素酶6、7、8、10、12、13、14、15、18、20、21、45、48、74、110、111、112、113、114、115、119、121、127、128、129、130、131、132、132a、146、147、148、150b、178和/或179(纖維素酶編號方式)。
19·根據(jù)權(quán)利要求17的纖維素酶變體，該變體是通過在下列位置中的一處或多處進(jìn)行取代、插入和/或缺失而得自母體纖維素酶13、14、15、20、21、48、74、110、111、113、115、119、129、131、146、150b、178和/或179(纖維素酶編號方式)。
20·一種纖維素酶變體，在該變體中，在按照表1的一個(gè)或多個(gè)位置，氨基酸殘基已變?yōu)楸Ｊ氐陌被釟埢谒鑫恢蒙?，?中識別的11個(gè)殘基中的7至10個(gè)氨基酸殘基是相同的。
21·根據(jù)權(quán)利要求20的纖維素酶變體，該變體是通過在下列位置中的一處或多處進(jìn)行取代、插入和/或缺失而得自母體纖維素酶13、14、15、20、21、22、24、28、32、34、45、48、50、53、54、62、63、64、65、66、68、69、70、71、72、73、74、75、79、85、88、90、92、93、95、96、97、98、99、104、106、110、111、113、115、116、118、119、131、134、138、140、146、152、153、163、166、169、170、171、172、173、174、174、177、178、179、180、193、196和/或197(纖維素酶編號方式)。
22·根據(jù)權(quán)利要求21的纖維素酶變體，該變體含有下列突變中的一個(gè)或多個(gè)(纖維素酶編號方式)K13L或L13K；P14A或A14P；S15H或H15S；K20E,K20G,K20A, E20K,G20K,A20K, E20G,E20A,G20E,A20E,G20A,或A20G；K21N或N21K；A22G,A22P,G22A,P22A,G22P，或P22G；V24*,V24L,*24V,L24V,*24L，或L24*；V28A,V28L,A28V,L28V,A28L，或L28A；N32D,N32S,N32K,D32N,S32N,K32N,D32S,D32K,S32D,K32D,S32K，或K32S；N34D或D34N；I38L,I38F,I38Q,L38I,F38I,Q38I,L38F,L38Q,F38L,Q38L,F38Q，或Q38F；S45N或N45S；G46S或S46G；E48D,E48N,D48E, N48E,D48N,or N48D；G50N或N50G；A53S,A53G,A53K,S53A,G53A,K53A,S53G,S53K,G53S,K53S,G53K，或K53G；Y54F或F54Y；W62F或F62W；A63D或D63A；V64I,V64D,I64V,D64V,I64D，或D64I；N65S,N65D,N65E,S65N,D65N,E65N,S65D,S65E,D65S,E65S,D65E，或E65D；D66N,D66P,D66T,N66D,P66D,T66D,N66P,N66T,P66N,T66N,P66T，或T66P；F68V,F68L,F68T,F68P,V68F,L68F,T68F,P68F,V68L,V68T,V68P,L68V,T68V,P68V,L68T,L68P,T68L,P68L,T68P，或P68T；A69S,A69T,S69A,T69A,S69T，或T69S；L70Y或Y70L；G71A或A71G；F72W,F72Y,W72F,Y72F,W72Y，或Y72W；A73G或G73A；A74F或F74A；T75V,T75A,T75G,V75T,A75T,G75T,V75A,V75G,A75V,G75V,A75G，或G75A；G79T或T79G；W85T或T85W；A88Q,A88G,A88R,Q88A,G88A,R88A,Q88G,Q88R,G88Q,R88Q,G88R，或R88G；Y90For F90Y；L92A或A92L；T93Q,T93E,Q93T,E93T,Q93E，或E93Q；T95E或E95T；S96T或T96S；G97T,G97A,T97G,A97G,T97A，或A97T；P98A或A98P；V99L或L99V；M104L或L104M；V106F或F106V；S110N或N110S；T111I,T111V,I111T,V111T,I111V，或V111I；G113Y或Y113G；L115V或V115L；G116S,G116Q,S116G,Q116G,S116Q，或Q116S；N118T,N118G,N118Q,T118N,G118N,Q118N,T118G,T118Q,G118T,Q118T,G118Q，或Q118G；H119Q,H119N,Q119H，或N119H；V129L或L129V；I131L,I131A,L131I,A131I,L131A，或A131L；G134A或A134G；Q138E或E138Q；G140N或N140G；R146Q或Q146R；S152D或D152S；R153K,R153L,R153A,K153R,L153R,A153R,K153L,K153A,L153K,A153K,L153A，或A153L；L163V,L163W,V163L,W163L,V163W，或W163V；G166S或S166G；W169F或F169W；R170F或F170R；F171Y,F171A,Y171F,A171F,Y171A，或A171Y；D172E,D172S,E172D,S172D,E172S，或S172E；W173E或E173W；F174M,F174W,M174F,W174F,M174W，或W174M；A177N或N177A；D178P或P178D；N179V或V179N；P180L或L180P；L193I或I193L；R196I,R196K,I196R,K196R,I196K，或K196I；和/或T197S或S197T。
23·一種纖維素酶變體，該變體是通過在下列位置(纖維素酶編號方式)中的一處或多處進(jìn)行取代、插入和/或缺失而得自母體纖維素酶，并且該變體在位置4具有R、H、K、Q、V、Y或M；在位置5具有S、T或A；在位置13具有K或L；在位置14具有P或A；在位置15具有H或S；在位置16具有C或A；在位置19具有A、D、S、P、T或E；在位置20具有A、E、G或K；在位置21具有K或N；在位置21a具有V或*；在位置22具有A、G或P；在位置24具有L、V或*；在位置28具有A、L或V；在位置32具有D、K、N或S；在位置34具有D或N；在位置38具有F、I、L或Q；在位置42具有D、G、T、N、S、K或*；在位置44具有K、V、R、Q、G或P；在位置45具有N或S；在位置46具有G或S；在位置47具有C或Q；在位置48具有D、E、N或S；在位置49具有P、S、A、G或*；在位置49a具有C或*；在位置49b具有N或*；在位置50具有G或N；在位置53具有A、G、K或S；在位置54具有F或Y；在位置62具有F或W；在位置63具有A或D；在位置64具有D、I或V；在位置65具有D、E、N或S；在位置68具有D、N、P或T；在位置69具有A、S或T；在位置70具有L或Y；在位置71具有A或G；在位置72具有F、W或Y；在位置73具有A或G；在位置74具有A或F；在位置75具有A、G、T或V；在位置79具有G或T；在位置82具有E或*；在位置88具有A、G、Q或R；在位置90具有F或Y；在位置92具有A或L；在位置93具有E、Q或T；在位置95具有E或T；在位置95j具有P或*；在位置96具有S或T；在位置97具有A、G或T；在位置98具有A或P；在位置99具有L或V；在位置104具有L或M；在位置106具有F或V；在位置110具有N或S；在位置111具有I、T或V；在位置113具有G或Y；在位置115具有L或V；在位置116具有G、Q或S；在位置118具有G、N、Q或T；在位置119具有H、N或Q；在位置129具有L或V；在位置131具有A、I或L；在位置132具有A、P或T；在位置133具有D、K、N或Q；在位置134具有A或G；在位置138具有E或Q；在位置145具有A、D、N或Q；在位置146具有Q或R；在位置150b具有A或*；在位置152具有D或S；在位置153具有A、K、L或R；在位置163具有L、V或W；在位置166具有G或S；在位置169具有F或W；在位置170具有F或R；在位置171具有A、F或Y；在位置172具有D、E或S；在位置173具有E或W；在位置174具有F、M或W；在位置177具有A或N；在位置178具有D或P；在位置179具有N或V；在位置180具有L或P；在位置193具有I或L；在位置196具有I、K或R；和/或在位置197具有S或T。
24·具有改變了的陰離子表面活性劑敏感性的纖維素酶變體，該變體通過在下列位置中的一處或多處進(jìn)行取代，插入和/或缺失而得自母體纖維素酶2、4、7、8、10、13、15、19、20、21、25、26、29、32、33、34、35、37、40、42、42a、43、44、48、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、70、72、76、79、80、82、84、86、88、90、91、93、95、95d、95h、95j、97、100、101、102、103、113、114、117、119、121、133、136、137、138、139、140a、141、143a、145、146、147、150e、150j、151、152、153、154、155、156157、158、159、160c、160e、160k、161、162、164、165、168、170、171、172、173、175、176、178、181、183、184、185、186、188、191、192、195、196、200和/或201(纖維素酶編號方式)。
25·一種纖維素酶變體，該變體在下列位置中的一處或多處，氨基酸殘基已發(fā)生取代17、85、86、87、88和/或89(纖維素酶編號方式)。
26·一種Humicola insolens EGV變體，其中引入了一個(gè)或多個(gè)下列突變D42W、D42Y或L70Y。
27·一種Thielavia terrestris纖維素酶變體，在該變體中引入了一個(gè)或多個(gè)下列突變P19A、G20K、Q44K、N48E、Q119H或Q146R。
28·Thielavia terrestris/Q119H變體。
29·一種熒光假單胞菌纖維素酶變體，在該變體中引入了一個(gè)或多個(gè)下列突變Y4R、H15S、N119Q或Q146R。
30·一種Crinipellis scabella纖維素酶變體，在該變體中引入了一個(gè)或多個(gè)下列突變V4R、T132a*、Q133D或Q146R。
31·一種通過氨基酸的取代、缺失或插入來改進(jìn)纖維素分解酶性質(zhì)的方法，該方法包括下列步驟a·構(gòu)建至少兩個(gè)氨基酸序列的多重對比，所述序列已知具有與來自Humicola insolens的內(nèi)切葡聚糖酶V(EGV)類似的三維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫4ENG項(xiàng)可知；b·以EGV結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，構(gòu)建該纖維素分解酶的基于同源性的三維結(jié)構(gòu)；c·識別距離底物結(jié)合裂隙不超過5的氨基酸殘基位置；d·識別酶的暴露于表面的氨基酸殘基；e·識別酶的所有帶電或可能帶電的氨基酸殘基位置；f·選擇一個(gè)或多個(gè)位置，在所述位置處氨基酸殘基將被取代、缺失或?qū)⒉迦氚被釟埢?；g·用常規(guī)的蛋白質(zhì)工程技術(shù)進(jìn)行取代、缺失或插入。
32·根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中步驟f是通過選擇一些位置進(jìn)行的，作為步驟a的對比結(jié)果，所述位置在所對比的多數(shù)序列中、優(yōu)選至少約63％的對比序列中攜帶相同的氨基酸殘基。
33·根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中步驟f是通過選擇在所對比的序列中攜帶不同氨基酸殘基的位置進(jìn)行的。
34·一種改進(jìn)天然存在的母體纖維素酶的比活性的方法，該方法是通過在距離底物結(jié)合裂隙不超過5，更優(yōu)選不超過3，進(jìn)一步優(yōu)選不超過2.5的氨基酸殘基位置處進(jìn)行取代、缺失或插入而進(jìn)行的。
35·一種改變天然存在的母體纖維素酶的pH活性曲線、pH活性最優(yōu)值、pH穩(wěn)定性曲線或pH穩(wěn)定性最優(yōu)值的方法，該方法是通過在距離底物結(jié)合裂隙不超過5，更優(yōu)選不超過3，進(jìn)一步更優(yōu)選不超過2.5氨基酸殘基位置處或在酶的暴露于表面的氨基酸殘基位置處進(jìn)行取代、缺失或插入而從局部或整體上改變靜電環(huán)境而進(jìn)行的，優(yōu)選是通過涉及一個(gè)帶電或可能帶電的殘基的取代而進(jìn)行的，該殘基是原始?xì)埢蛉〈鷼埢?br> 36·一種改變天然存在的母體纖維素酶在陰離子表面活性劑或陰離子洗滌劑組分存在下的穩(wěn)定性的方法，該方法是通過在該酶的一個(gè)或多個(gè)暴露于表面的氨基酸殘基位置處進(jìn)行取代、缺失或插入而從局部或整體上改變靜電環(huán)境而進(jìn)行的。
全文摘要
一種通過氨基酸的取代、缺失或插入來改進(jìn)纖維素分解酶性質(zhì)的方法,該方法包括下列步驟:a構(gòu)建至少兩個(gè)氨基酸序列的多重對比,所述序列已知具有與來自Humicolainsolens的內(nèi)切葡聚糖酶V(EGV)類似的三維結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫4ENG項(xiàng)可知;b以EGV結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),構(gòu)建該纖維素分解酶的基于同源性的三維結(jié)構(gòu);c識別距離底物結(jié)合裂隙不超過5A的氨基酸殘基位置;d識別酶的暴露于表面的氨基酸殘基;e識別酶的所有帶電或可能帶電的氨基酸殘基位置;f選擇一個(gè)或多個(gè)位置,在所述位置處氨基酸殘基將被取代、缺失或?qū)⒉迦氚被釟埢?g用常規(guī)的蛋白質(zhì)工程技術(shù)進(jìn)行取代、缺失或插入;和由該方法得到的纖維素酶變體。
文檔編號C12R1/645GK1230987SQ9719798
公開日1999年10月6日 申請日期1997年9月17日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月17日
發(fā)明者K·V·安德森, M·舒雷恩, L·克里斯丁森, B·達(dá)姆加德, C·范德奧斯坦 申請人:諾沃挪第克公司