專利名稱：毒素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適于用作殺蟲劑的毒素的分離和特性。
對(duì)具有抗昆蟲，并且尤其是抗棉鈴蟲昆蟲活性的毒素產(chǎn)生特殊興趣的原因在于這類昆蟲的重大經(jīng)濟(jì)學(xué)意義。新化合物的鑒定為發(fā)展另一類農(nóng)業(yè)殺蟲劑提供了基礎(chǔ)。
隨著昆蟲對(duì)殺蟲劑抗性的增強(qiáng)、人們對(duì)殺蟲劑不利作用的認(rèn)識(shí)以及逐漸對(duì)環(huán)境因素的更優(yōu)先考慮，對(duì)取代現(xiàn)有化學(xué)性昆蟲控制方法的要求也在日益明顯?，F(xiàn)有控制方法繼后花費(fèi)和所造成的損失使一些先前有利可圖的農(nóng)用工業(yè)變得毫無(wú)生氣。
近來(lái)，人們對(duì)毒液尤其是蜘蛛毒及其所含毒素的藥理和化學(xué)檢測(cè)產(chǎn)生了新的興趣。
基于一些蜘蛛毒液或者有關(guān)具有可逆作用的低分子量多胺毒素能夠殺滅某些昆蟲，一些作者1，2，3已提出了從蜘蛛毒中開(kāi)發(fā)出殺蟲劑物質(zhì)的總體方案。
棉鈴蟲(Heliothis armigera)是澳大利亞農(nóng)用作物的主要害蟲。棉鈴蟲是一種遷移性飛蛾，其幼蟲以多種農(nóng)作物為食。棉鈴蟲屬具有世界性分布。美洲棉鈴蟲存在于從加拿大到烏拉圭的美洲大陸。與其非常相似的棉鈴蟲見(jiàn)于南部歐洲、非洲、近東、中東、遠(yuǎn)東、澳大利亞、新西蘭和許多太平洋島嶼。在澳大利亞，棉鈴蟲成災(zāi)并對(duì)棉花、煙草、馬鈴薯、綠豆、甜玉米、苜蓿、大豆、高梁、豌豆、亞麻子、紅花、油菜子、向日葵和白羽扇豆造成嚴(yán)重?fù)p害。然而，基于對(duì)棉鈴蟲所付出的代價(jià)和因其造成的損失，棉花是目前上述這些作物中最為重要的受害作物。
本發(fā)明人從澳大利亞的漏斗網(wǎng)蜘蛛(funnel-web spiders)(Atrax和Hadronyche屬)中分離出一同源系列的新型殺蟲劑肽，它們具有相對(duì)低的分子量(約為4000a.m.u.)，并證明在將此類肽注射到棉鈴蟲標(biāo)本中時(shí)不可逆的毒性?？梢灶A(yù)見(jiàn)此類肽將對(duì)大量其它種類的昆蟲顯示出毒性。通過(guò)給諸如蝗蟲、蟑螂、麻蠅和甲蟲類害蟲注射上述毒素已顯示出其致死性或毒性。
本發(fā)明所分離并確定特性的毒素僅顯示出與以前報(bào)道的昆蟲活性毒素有限的相似性。例如，從Plectreurys種4中分離的昆蟲特異性毒素是以相似的乙腈濃度經(jīng)層析洗脫分離的，它們是單鏈毒素，估計(jì)其分子量為約7000a.m.u.，遠(yuǎn)大于本發(fā)明毒素的約4000a.m.u.的分子量。相反，最初從Hololean種5中分離的活性化合物被認(rèn)為是由總的分子量約16000a.m.u.的二個(gè)亞單位組成的，但隨后的報(bào)道述及從上述昆蟲中分離出了單鏈昆蟲毒素18。據(jù)信它們是通過(guò)突觸前鈣通道阻斷機(jī)制發(fā)揮作用的。
在所公開(kāi)的資料中，來(lái)自Agelenopsis毒液6的μ-agatoxin與本發(fā)明的毒素最為相似，它們具有相似的大小(36-38個(gè)殘基，分子量約為4200a.m.u.)，并且是單鏈毒素。
本發(fā)明的昆蟲活性毒素是一組同源性毒素，完全不同于以前從澳大利亞漏斗網(wǎng)蜘蛛8，9中分離的哺乳動(dòng)物毒素，因此預(yù)期本發(fā)明的毒素對(duì)哺乳動(dòng)物系統(tǒng)沒(méi)有生物活性。事實(shí)上，當(dāng)分別將500pmol的In2毒素和400pmol的In3毒素注射到一只成年小鼠尾靜脈中時(shí)未發(fā)現(xiàn)有任何活性，并且，已顯示出V1對(duì)新生小鼠無(wú)毒性。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一種相對(duì)分子量約為4000a.m.u.的多肽毒素，該毒素含有36-37個(gè)氨基酸殘基，并能夠形成3個(gè)鏈間二硫鍵，這種含二硫鍵的毒素對(duì)幼蟲和/或成蟲具有毒性，該毒性典型地是根據(jù)幼蟲的異常運(yùn)動(dòng)和在通常時(shí)間不能化蛹以致最終死亡來(lái)證明的。
本文所定義的本發(fā)明毒素不包括在天然環(huán)境中存在的毒素。以適于測(cè)序形式分離的毒素一般純度約為95%，盡管很顯然該純度級(jí)并非商業(yè)產(chǎn)品所必需的。
本發(fā)明包括羧酰胺化和游離酸兩種形式的毒素。
本發(fā)明的優(yōu)選毒素為本文所定義的In1、In2、In3、MR1、V1、Fla和F1b。
本發(fā)明的毒素可從蜘蛛毒液中分離得到。
它們也可以用化學(xué)方法合成，或者通過(guò)重組技術(shù)從編碼毒素或其前蛋白的分離之基因，或從合成基因的c DNA拷貝制得。
用重組技術(shù)制備本發(fā)明的毒素時(shí)，可通過(guò)構(gòu)建編碼本發(fā)明毒素之氨基酸順序的DNA探針來(lái)制備毒素。
然后可用這些探針從蜘蛛細(xì)胞的DNA中分離編碼毒素前蛋白的基因，或者從蜘蛛細(xì)胞mRNA制成cDNA，克隆到適宜的載體中以形成DNA庫(kù)。這類DNA庫(kù)可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備?？捎脴?biāo)準(zhǔn)方法對(duì)分離的前蛋白基因測(cè)序，并且可將所說(shuō)基因插入到例如適宜昆蟲病毒(如桿狀病毒)的基團(tuán)組中，以使相應(yīng)的毒素前蛋白在病毒對(duì)昆蟲和/或其幼蟲的感染過(guò)程中作為晚期蛋白得以表達(dá)。此外，還可以對(duì)植物細(xì)胞系進(jìn)行基因工程化處理以使之表達(dá)毒素基因。在Ciba Geigy AG.關(guān)于與本發(fā)明毒素?zé)o關(guān)的蝎毒的澳大利亞專利申請(qǐng)46881/89中，教導(dǎo)了將毒素基因摻入到昆蟲病毒或植物宿主中的合適方法。另外，合成的毒素基因能夠用標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)構(gòu)建，并最好利用有關(guān)昆蟲病毒或植物基因密碼子以及昆蟲病毒或植物的共同起始順序的知識(shí)，從而能將合成的毒素基因插入昆蟲病毒或植物表達(dá)系統(tǒng)中。無(wú)論是從天然來(lái)源分離得到的，還是合成的編碼本發(fā)明毒素的多核苷酸都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
重組蛋白的羧酰胺化可在翻譯后實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了經(jīng)基因工程化加工以表達(dá)本發(fā)明毒素的昆蟲病毒和植物品種。在典型的情況下，昆蟲病毒和植物品種將表達(dá)沒(méi)有其它漏斗網(wǎng)蜘蛛蛋白的本發(fā)明毒素。
本發(fā)明還提供了所說(shuō)毒素的變異體，其中的一種變異體是對(duì)應(yīng)于或包括本發(fā)明多肽毒素之一部分的多肽，或者是一種相對(duì)分子量約為4000a.m.u.的多肽，其含有36-37個(gè)殘基，并能夠形成3個(gè)鏈間二硫鍵，對(duì)昆蟲和/或其幼蟲具有毒性，并與本發(fā)明的毒素同源。為了便于描述，兩個(gè)肽順序間的“同源性”意味著相似但不完全相同，表明第一個(gè)順序是從第二個(gè)順序衍生的。尤其是如果將一多肽和本發(fā)明毒素的氨基酸順序進(jìn)行比較，顯示出相同順序達(dá)約70%以上時(shí)，該多肽即和本發(fā)明的毒素同源。這種順序比較可通過(guò)已知的計(jì)算法進(jìn)行，例如由Lipman和Pearson10所描述的計(jì)算法，它們很容易借助計(jì)算機(jī)完成。
根據(jù)本發(fā)明，可以通過(guò)常規(guī)的位點(diǎn)特異性誘變方法或化學(xué)合成方法生產(chǎn)同源性多肽，所說(shuō)的誘變方法是一條常規(guī)鑒定能夠被修飾而不使所產(chǎn)生的多肽喪失生物活性之分子殘基的途徑。
那些對(duì)應(yīng)或包含本發(fā)明毒素的一部分但不與本發(fā)明毒素完全相同的變異體也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，它們是那些保持了毒素對(duì)于昆蟲和/或其幼蟲之毒性的分子。
這些變異體可經(jīng)肽合成技術(shù)進(jìn)行合成制備、重組制備或經(jīng)裂解本發(fā)明的分離的毒素來(lái)制備。
可以按檢測(cè)本發(fā)明毒素的方法檢測(cè)本發(fā)明變異體的毒性。
編碼本發(fā)明毒素之變異體的多核昔酸也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。可以對(duì)昆蟲病毒和植物進(jìn)行基因工程化加工處理，使之以類似于表達(dá)毒素本身的方式表達(dá)變異體，并且這些昆蟲病毒和植物也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一種用于釋放第一個(gè)實(shí)施方案中的毒素或毒素變異體的殺蟲劑組合物。例如，當(dāng)毒素或變異體可作為晚期蛋白由昆蟲病毒表達(dá)時(shí)，可將編碼毒素或變異體的病毒施用于希望被保護(hù)的作物。該病毒可配入農(nóng)業(yè)上可接受載體、稀釋劑和/或賦形劑中。適當(dāng)?shù)闹苿┌切┺r(nóng)業(yè)配制劑中常規(guī)應(yīng)用的制劑，并包括含水載體。該組合物按標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)業(yè)方法配制。適宜的病毒包括桿狀病毒。
此外，可以對(duì)另外一種適當(dāng)植物的作物本身進(jìn)行基因工程化處理以使之表達(dá)毒素。
根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一種控制作物被害蟲侵害的方法，該方法包括用第二個(gè)實(shí)施方案中的組合物處理作物或害蟲和/或其幼蟲。毒素或變異體可以以經(jīng)工程化處理后能夠表達(dá)作為晚期蛋白之毒素或變異體的昆蟲病毒形式加以應(yīng)用?？梢杂脷⑾x劑組合物處理害蟲和/或其幼蟲，例如，可用一種引誘劑將害蟲吸引至組合物處。
另外，該方法可包括提供經(jīng)工程化處理以表達(dá)毒素的作物或植物?？捎行У貞?yīng)用該方法的作物包括棉花、煙草、馬鈴薯、綠豆、甜玉米、苜蓿、大豆、高梁、豌豆、亞麻子、紅花、油菜子、向日葵和白羽扇豆。


圖1 顯示雌性Atrax infentus蜘蛛毒液的層析圖。HPLC梯度如下流率1ml/分鐘，0-24分鐘內(nèi)0-50%乙腈，24-29分鐘為50-60%乙腈，29-34分鐘為60-0%乙腈。
圖2 顯示雌性Hadronyche versutus蜘蛛毒液的層析圖。HPLC梯度與
圖1相同。
圖3 顯示雄性Atrax robustus蜘蛛毒液的色譜圖。HPLC梯度與
圖1 相同。
圖4 顯示粗MR1毒素重新分級(jí)分離后的層析圖。HPLC梯度如下流率1ml/分鐘，0-15分鐘為20-35%乙腈，15-20分鐘為35-50%乙腈，20-25分鐘為50-60%乙腈，25-28分鐘為60-20%乙腈。
圖5 顯示通過(guò)氣相測(cè)序獲得的毒素In1、In2、In3、MR1和V1的氨基酸順序。
附注1、劃下線的殘基也從金黃葡萄球菌V8蛋白酶消化物測(cè)序得到。
2、盡管結(jié)構(gòu)以酰胺化羧基末端表示，但有證據(jù)表明在這些毒素中羧基末端是游離酸。
3、MR1中最后的半胱氨酸殘基是根據(jù)順序同源性推測(cè)的。在測(cè)序過(guò)程中，前5個(gè)這類殘基是作為羧甲基衍生物檢測(cè)的。
圖6 表示金黃葡萄球菌8白酶消化之In1、In2和In3的層析圖。HPLC條件同
圖1。
圖7 顯示V1毒素對(duì)棉鈴蟲幼蟲之有效劑量(50%)的概率單位評(píng)估。ED50＝7μg/幼蟲。
圖8 和圖9 顯示對(duì)毒素F1初步分級(jí)分離的結(jié)果。圖8 顯示蜘蛛毒的分級(jí)分離，圖9 顯示粗F1的第二次分級(jí)分離。
圖10 顯示重折疊In2的RP-HPLC分級(jí)分離。
圖11 顯示In2A-COOH、In2A-CONH2和天然In2A的RP-HPLC結(jié)果。
圖12 顯示In2A-COOH、In2A-CONH2和天然In2A的陽(yáng)離子交換層析結(jié)果。
圖13 顯示A.formidabilis毒液的有代表性的層析，其HPLC條件如下流率1ml/分鐘緩沖液A0.1%TFA/H2O緩沖液B0.1%TFA/80%乙腈檢測(cè)210nm處紫外吸光率梯度 024 50%B502 60%B602 80%B802 0%B
圖14 顯示在下列HPLC條件下對(duì)粗F1第二次分級(jí)分離產(chǎn)生F1a和F1b
流率1ml/分鐘緩沖液A0.01M NH4AC，pH5.8緩沖液B20%緩沖液A，80%乙腈檢測(cè)210nm紫外吸光率梯度17%B-24%B(0-8分鐘)
圖15 顯示毒素Fla和Flb的氣相測(cè)序結(jié)果。
圖16 顯示本發(fā)明毒素間順序的CLUSTAL比較。
圖17 顯示漏斗網(wǎng)蜘蛛毒素與已公開(kāi)的興奮性毒素間的CLUSTAL比較。
圖18 顯示漏斗網(wǎng)蜘蛛毒素與已公開(kāi)的抑制性毒素間的CLUSTALA比較。
材料Atrax infensus蜘蛛采集自Toowoomba，Queensland數(shù)公里范圍內(nèi)。其余的蜘蛛采自Greater Sydney地區(qū)。
通過(guò)將蜘蛛招引至攻擊部位然后，從毒牙尖端收集所自發(fā)地排泄的毒液這一相當(dāng)簡(jiǎn)單的方法對(duì)所有漏斗網(wǎng)蜘蛛進(jìn)行拔毒。
將通過(guò)從活蜘蛛毒牙中直接吸取而收集的毒液置入硅烷化(Coatasil，Ajax Chemicals，Australia)的玻璃吸移管中，并于-20℃下凍存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^(guò)用0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液反復(fù)洗從吸移管吸回的毒液，然后凍干。乙腈購(gòu)自Mallinckrodt Australia，三氟乙酸(TFA)和七氟丁酸(HFBA)購(gòu)自Pierce Chemical Co.，二硫蘇糖醇和4-乙烯吡啶購(gòu)自Sigma Chemical CO.，內(nèi)蛋白酶Glu-C(金黃葡萄球菌V8蛋白酶)購(gòu)自ICN Immunobiologicals，Costa Mesa，California，U.S.A.，碘乙酸由Merck Inc.提供。所用的全部HPLC水由Liquipure Modulab Water System生產(chǎn)，并通過(guò)0.45mm尼龍膜真空過(guò)濾。
棉鈴蟲的培養(yǎng)用于蜘蛛毒液和毒液部分試驗(yàn)的棉鈴蟲標(biāo)本保存于空調(diào)實(shí)驗(yàn)室中，并用基本同于Teakle和Jensenll已描述的飼養(yǎng)H.punctigera的方法飼養(yǎng)。簡(jiǎn)而言之，將棉鈴蟲的成蟲樣本(每種性別各約15只)置于5升的容的環(huán)形的飼養(yǎng)倉(cāng)內(nèi)，其上部分襯以紙巾。在3-4天內(nèi)，蛾進(jìn)行了交配，并且雌性成蟲產(chǎn)卵于紙巾上。在0.2%次氯酸鈉溶液中將紙巾輕柔攪拌5分鐘以洗下蟲卵。該步驟也具有對(duì)蟲卵表面進(jìn)行消毒的作用。
將蟲卵收集到潮濕的棉紙中，然后放入-3升聚氯乙烯袋內(nèi)，直至1-2天后蟲卵孵化為止。將所得的初齡幼蟲轉(zhuǎn)入單個(gè)30ml塑料杯中，每個(gè)杯內(nèi)含有約10ml含青豆、麥芽、球擬酵母、抗壞血酸和山梨酸并以對(duì)羥苯甲酸M和甲醛作防腐劑的合成飼料。在25℃下經(jīng)過(guò)約12天后，幼蟲進(jìn)入第六齡期，然后或者被用于蜘蛛毒/毒液餾分的試驗(yàn)，或者化蛹并最終形成新一代成蟲。
毒液和其部分的生物檢測(cè)盡管發(fā)現(xiàn)粗漏斗網(wǎng)蜘蛛毒液/毒液部分對(duì)棉鈴蟲樣本的成蟲和第六齡幼蟲同樣有效，但因?yàn)槌上x在形成后的幾天內(nèi)將由于自然原因死亡，所以決定用終齡期幼蟲完成所需的全部試驗(yàn)，而且，通過(guò)幼蟲表現(xiàn)的異常運(yùn)動(dòng)和在通常時(shí)間內(nèi)的化蛹失敗來(lái)證實(shí)被驗(yàn)毒液或其部分的毒性。
已經(jīng)認(rèn)識(shí)到終齡期棉鈴蟲幼蟲可能對(duì)毒素的作用有相對(duì)的抗性，但并不認(rèn)為這是一個(gè)嚴(yán)重的缺陷，因?yàn)閷?duì)第六齡期棉鈴蟲幼蟲有效的毒液或毒素可能對(duì)其它昆蟲更為有效。
通過(guò)輕輕地限制幼蟲的運(yùn)動(dòng)，然后用帶有30號(hào)針頭的微量注射器在幼蟲體側(cè)表皮下注射5μl毒素/毒素部分來(lái)對(duì)每種毒液或其部分進(jìn)行試驗(yàn)?？偣?0只幼蟲(6或7只用于以后的A.formidabilis毒液部分的試驗(yàn))注射毒液/部分，而另外10只幼蟲(6或7只用于以后的A.formidabilis實(shí)驗(yàn))注射0.75%Nacl溶液作為對(duì)照。將注射后的幼蟲放回其各自的培養(yǎng)杯中，并在以后的3天內(nèi)觀察毒性癥狀。如果在這些天中大多數(shù)幼蟲出現(xiàn)了持續(xù)且無(wú)目的的蠕動(dòng)現(xiàn)象或出現(xiàn)持續(xù)且無(wú)目的的蠕動(dòng)繼而死亡，則可認(rèn)為粗毒液或毒液部分含有毒性成分。
毒液分級(jí)分離用0.1%TFA水溶液將凍干的毒液重新配成10-50mg/ml的不同濃度，利用與LKB“Wavescan”數(shù)據(jù)操作軟件相連的LKB2240快速光譜檢測(cè)器在Pharmacia LKB HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行分級(jí)分離。所用柱子為Waters Deltapak C18(3.9mm×150mm，10μm×300
)、Waters Deltapak C4(7.8mm×300mm，15μm×300
)和Biorad MA7 P陰離子交換柱(7.8mm×50mm)。HPLC洗脫梯度由溶于恒定0.1%TFA中的不斷增加濃度的乙腈溶液組成。將含層析峰的各管手工收集到聚丙烯容器中，并冷凍干燥。
已發(fā)現(xiàn)在毒素MR1的純化過(guò)程中用增加的乙腈梯度和恒定的0.05%HFBA對(duì)其進(jìn)行第二次分級(jí)分離是必要的。同樣，手工收集各管，并基于生物測(cè)定結(jié)果選擇之。
為了對(duì)A.formidabilis毒進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)，將凍干的毒液用0.1%TFA水溶液重新配成50μg/μl的濃度，并且通過(guò)WatersDeltaPak柱(3.9mm×150mm C18-300A)在ICI Kortec儀器上進(jìn)行逆相HPLC并檢測(cè)210nm處的吸光率以分級(jí)分離之。洗脫梯度由溶于0.1%TFA，pH2或0.01M乙酸銨，pH5.8中的濃度漸增的乙腈溶液組成。根據(jù)紫外吸光率檢測(cè)被洗脫的成分，并將其手工收集到聚丙烯容器中，然后凍干。
肽的特性利用略加修改的標(biāo)準(zhǔn)ABI程序，在Applied Biosystems Model 470A氣相測(cè)序儀上進(jìn)行肽序列測(cè)定。PTH-氨基酸也用聯(lián)機(jī)的120A型分析儀(Applied Biosystems)進(jìn)行鑒定。
可使用Waters Picotag工作站，并利用Waters或Applied Biosystems HPCL系統(tǒng)對(duì)PTC-氨基酸進(jìn)行定量氨基酸分析。首先使用加在含0.1%酚之氣相中的恒沸鹽酸，在氣相中于150℃下將樣品水解1小時(shí)。
利用BioIon Biopolymer質(zhì)譜分析儀(Applied Biosystems)進(jìn)行全部的質(zhì)譜分析，一般加速電壓為15000伏，收集時(shí)間為約2000秒(3，000，000起動(dòng)脈沖)。
在分析毒素F1a和F1b的情況下，用溶于標(biāo)準(zhǔn)Tris還原緩沖液(pH8.2)中的二硫蘇糖醇對(duì)其進(jìn)行烷基化和還原，然后用4-乙烯呲啶標(biāo)記半胱氨酸殘基。然后將還原混合物注入HPLC中，以分離純的被還原和烷基化的肽。
酶促消化基本上按Houmard等人12的方法，在設(shè)計(jì)為將反應(yīng)限制為僅裂解谷氨酸殘基的條件下，在碳酸氫銨緩沖系統(tǒng)(pH7.8)中用內(nèi)蛋白酶Glu-C(金黃葡萄球菌V8蛋白酶)裂解被還原和烷基化的肽。用HPLC分級(jí)分離消化產(chǎn)物，手工收集所得各部分并用于進(jìn)一步的分析。
肽順序的計(jì)算機(jī)排列用通過(guò)AARNET設(shè)施從作者處獲得的CLUSTALV17組件對(duì)肽順序進(jìn)行一一相對(duì)的排列和比較。
蜘蛛種的初步篩選進(jìn)行了大量的棉鈴蟲試驗(yàn)，以證實(shí)能夠提供具有殺蟲劑價(jià)值之毒素的蜘蛛種。結(jié)果如表6、7、8和9所示。
毒素的分離
圖1 顯示雌性Atrax infensus蜘蛛毒液的層析圖。生物檢測(cè)表明標(biāo)記為In1、In2和In3的峰對(duì)棉鈴蟲幼蟲有毒性。來(lái)自雌性Hadronyche versutus蜘蛛(圖2)和雄性Atrax robustus蜘蛛(圖3和4)的毒液在類似的分級(jí)分離/生物檢測(cè)中也顯示有分別稱為V1和MR1的活性成分，生物檢測(cè)結(jié)果示于表1中。
發(fā)現(xiàn)從Atrax infensus種的雌性蜘蛛每吸取一次可獲得約0.8mg干重的毒液，雌性H.versutus蜘蛛每吸取一次獲得0.55-1.4mg干重的毒液。得自雄性A.robustus蜘蛛的毒液量最少，每吸取一次僅獲得約0.02mg干重的毒液。已估計(jì)了每毫克干重毒液中的毒素的產(chǎn)量并示于表1中。
從澳大利亞漏斗網(wǎng)蜘蛛毒液中分離出了五種昆蟲活性毒素，并確定了特性，其順序示于圖5中。這些毒素的一個(gè)特性是這一系列毒素具有相當(dāng)?shù)耐葱?，在整個(gè)系列中，36個(gè)氨基酸殘基中的26個(gè)(72%)或37個(gè)氨基酸殘基中的26個(gè)(70%)是保守的，尤其是在羧基末端的區(qū)域。
毒素的特性毒素In1、In2、In3、MR1和V1的氣相測(cè)序獲得了如圖5所示的順序。一般情況下，每次測(cè)定在測(cè)序儀載片上加500pmol-1nmol天然毒素。對(duì)經(jīng)二硫蘇糖醇還原和經(jīng)碘乙酸烷基化的肽作進(jìn)一步的序列測(cè)定，以鑒定半胱氨酸殘基。為了進(jìn)一步明確羧基末端區(qū)，用金黃葡萄球菌V8蛋白酶在對(duì)谷氨酸殘基的羧基端進(jìn)行限制性裂解的條件下消化In1、In2、In3和V1。這些消化產(chǎn)物的In2和In3部分得到如圖6所示的層析圖。該步驟產(chǎn)生了9或10個(gè)氨基酸的羧基末端肽，對(duì)它們?cè)俅芜M(jìn)行氣相測(cè)序(圖5中劃下線的殘基)，發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié)果與推測(cè)的順序相符。
完整肽及金黃葡萄球菌V8片段的氨基酸分析也與測(cè)序結(jié)果一致(見(jiàn)表2)。這些結(jié)構(gòu)的最終證明是由等離子體解吸質(zhì)譜分析法提供的，其中，在每種情況下都發(fā)現(xiàn)了與計(jì)算的質(zhì)量相關(guān)的離子(見(jiàn)表3)。
對(duì)于V1而言，將所產(chǎn)生的肽消化產(chǎn)物再次用RP-HPLC進(jìn)行分級(jí)分離，產(chǎn)生圖7所示的層析圖。對(duì)所收集的部分進(jìn)行如前所述的氨基酸分析和氣相測(cè)序，得到示于表4的數(shù)據(jù)。從中可見(jiàn)，得自酶解產(chǎn)生之片段的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了得自完整肽的氨基酸順序。
如前所述，這些毒素顯示了相當(dāng)程度的同源性，尤其在半胱氨酸殘基的位置上。由此可推知，所有毒素中的二硫鍵將是相同的。已知這一點(diǎn)對(duì)于生物活性是很重要的，因?yàn)樵趯?duì)被還原和烷基化的In1進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)生物檢測(cè)過(guò)程中未觀察到可檢測(cè)出的毒性作用。所有的半胱氨酸殘基似乎都參予二硫鍵的形成，因?yàn)樵谕榛安贿M(jìn)行還原繼而進(jìn)行氣相測(cè)序的嘗試中，未發(fā)現(xiàn)天然肽有游離半胱氨酸。
A.formidabilis毒液的初步分析檢測(cè)得自雌性Atrax formidabilis漏斗網(wǎng)蜘蛛的毒液。
應(yīng)用與處理毒素V1(包括第二次分級(jí)分離，見(jiàn)圖8和圖9)相同的HPLC柱、梯度和溶劑。由于可得到的formidabilis毒液的量非常有限，因而所收集的部分不足以進(jìn)行生物測(cè)定。取而代之的是選擇相當(dāng)于H.vertusus和A.robustus的V1與R1分級(jí)分離層析的峰值部分用于氣相測(cè)序和氨基酸分析。這些分析的結(jié)果如表4和表5所示。
當(dāng)這些數(shù)據(jù)不具有結(jié)構(gòu)確定性時(shí)，則表明在該毒液中存在第六種毒素。
A.formidabilis毒素的其他特征從雄性和雌性Atrax formidabilis蜘蛛中按前述方法抽取毒液，每次抽取獲得平均為1.2mg干重的毒液。在對(duì)毒液進(jìn)行所有的處理之后，以0.02吸光率單位/μg干重的比值為基礎(chǔ)根據(jù)210nm處紫外光吸收對(duì)毒素V1進(jìn)行定量分析，每毫克毒液平均分別產(chǎn)生8.8μg和4.2μg的毒素F1a和F1b。
在得自雌性蜘蛛的毒液中發(fā)現(xiàn)了兩種毒素，未檢測(cè)得自特定雄性蜘蛛的毒液。
圖13顯示得自A.formidabilis的毒液在恒定0.1%TFA中的有代表性層析圖。從中明顯可見(jiàn)與其他種澳大利亞漏斗網(wǎng)蜘蛛毒液的相似性。標(biāo)記為“粗F1”的峰相當(dāng)于在其他相關(guān)蜘蛛種中具有殺蟲劑活性的峰。因?yàn)閼岩稍摲宀患?，于是在恒?.01M NH4 Ac(pH5.8)中進(jìn)行第二次分級(jí)分離得到
圖14所描繪的層析圖，并清楚地顯示了本文記作F1a和F1b的兩種成分的存在。關(guān)于F1a的羧基末端順序還有一個(gè)問(wèn)題，即雖然所有的其它毒素具有C末端RCD，但Fla似乎在C末端具有CRND。然而，末端D殘基可能是由于在測(cè)序儀中N至D的斷裂而造成的測(cè)序假象。分子的質(zhì)譜分析將揭示正確的C末端。對(duì)源于該毒液(等于2mg干重)的所有部分進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)生物測(cè)定，結(jié)果表明只有部分F1a和F1b(分別為A1491-1和A1491-2)具有表10所示的活性。雖然部分A1477-6也顯示出一些活性但最肯定的活性只是因?yàn)樗菑摹按諪1”獲得的。對(duì)兩個(gè)部分進(jìn)行氣相測(cè)序，順序的測(cè)定結(jié)果示于
圖15中。還對(duì)F1a和F1b進(jìn)行了氨基酸分析，結(jié)果示于表11中。
將In1-3、V1和MR1與F1b和F1a兩種毒素進(jìn)行比較，結(jié)果顯示與F1b有很明顯的同源性，而對(duì)于F1a，盡管仍然有實(shí)質(zhì)性的同源性但較小些(參見(jiàn)
圖16)。半胱氨酸殘基的位置非常一致，在7種毒素中有6種完全相同;F1a與之稍有不同在于它有兩個(gè)另外的半胱氨酸殘基，還有兩個(gè)殘基在位置上也稍有不同。在整個(gè)同源系列中可構(gòu)成一個(gè)活性部位的保守區(qū)并不明顯，這表明該活性部位可以很好地從構(gòu)象上構(gòu)建，或者是通過(guò)其它的機(jī)制賦予其生物活性。
圖17顯示7種毒素與一組興奮性、昆蟲活性蜘蛛毒素及從在已發(fā)表之文獻(xiàn)中描述的蝎毒素的序列比較。根據(jù)比較的術(shù)學(xué)計(jì)算評(píng)分(LUSTAL已排出了順序)，這些序列具有與其它毒素的氨基末端區(qū)一一對(duì)應(yīng)排列的澳大利亞毒素的氨基末端的一半。然而，很明顯，在兩組毒素之間只有非常有限的相似性。澳大利亞毒素顯然是不同的。
同樣，一組已公開(kāi)的昆蟲活性抑制性毒素表現(xiàn)出與
圖18所示的澳大利亞毒素只有微不足道的相符性，這再次表明不同組毒素間的明確區(qū)別。
毒素In2的順序和重折疊為制備生物活性肽(即能干擾正常神經(jīng)活性的肽)，選擇用于合成的毒素In2的順序。用化學(xué)合成法產(chǎn)生具有生物活性和等效分子是任何生物技術(shù)應(yīng)用和商品化過(guò)程中的重要步驟。為了克服在提供這些天然毒素中的局限性，我們合成了并繼而重新折疊了毒素In2，以使之處于有活性狀態(tài)。
合成過(guò)程在Milligen9050肽合成儀上利用FMOC化學(xué)方法進(jìn)行的。以從C末端開(kāi)始逐步進(jìn)行的方式向天冬氨酸Pepsin KA樹(shù)脂(Milligen1.6g;0.09mmol/g)中加入4倍過(guò)量的FMOC五氟苯基氨基酸酯。保護(hù)基團(tuán)是4-甲氧基-2，3，6-三甲苯磺?；?用于Arg)、乙酰氨甲基(用于Cys)、叔丁基酯(用于Glu)、叔丁氧羰基(用于Lys)和叔丁基(用于Ser，Thr和Tyr)。氨基酸的雙偶聯(lián)發(fā)生于Thr-3、Ile-8、Thr-7、Gln-9、Cys-11和Arg-35處。
合成完成后，去掉保護(hù)基團(tuán)，并且用三氟乙酸/酚(95∶5v/v)在6小時(shí)期間從樹(shù)脂上裂解下肽鏈。過(guò)濾所得的混合物，再將濾液蒸發(fā)至干。加入無(wú)水二乙醚生成白色沉淀。然后將該混合物過(guò)濾，并用乙醚洗滌沉淀物，然后干燥。
保護(hù)半胱氨酸基團(tuán)(ACM)的去除將粗沉淀物溶解于最小量的30%乙酸中。加入12當(dāng)量乙酸汞(Ⅱ)，并攪拌混合物1小時(shí)。加入2-巰基乙醇200μl，再攪拌1小時(shí)。通過(guò)硅藻土過(guò)濾反應(yīng)混合物以去除硫化汞，并用30%乙酸沖洗。將濾液加入到4C-18 Sep-Paks(Waters Associates)中并用溶于水中的0.1%TFA沖洗以使肽脫鹽。用乙腈∶水(1∶1)混合液洗脫該肽。
In2合成(酰胺樹(shù)脂)除了下列條件外，In2的合成按上述過(guò)程進(jìn)行使用0.6gnova syn的PR500樹(shù)脂(0.44mmol/g);除進(jìn)行上述合成中的雙偶聯(lián)外，還完成雙偶聯(lián)☆-Asn-28、Glu-32、(Novabiochem)Gln-33、Asp-38。
再折疊方法使用谷胱甘肽(Calbiochem)氧化還原緩沖系統(tǒng)完成合成之毒素In2的再折疊并形成正確二硫鍵。該緩沖液含有(每20毫升，pH8.2)242mg Tris5.8mg EDTA2g 鹽酸胍3.6mg 氧化的谷胱苷肽18.4mg 還原的谷胱苷肽2mg 合成的肽將該反應(yīng)混合物于室溫下攪拌過(guò)夜，并使用Deltapak3.9mm×150mm柱和0.1%TFA/乙腈洗脫梯度(
圖10)以RP-HPLC進(jìn)行分級(jí)分離。收集各部分，對(duì)其進(jìn)行與天然肽相似的生物測(cè)定。通過(guò)這一方法獲得了酰胺和游離酸羧基末端兩種形式的合成In2。
具有游離酸C末端或者是酰胺C末端的合成In2被成功地進(jìn)行了重折疊，并顯示出在與進(jìn)行棉鈴蟲天然毒素的生物測(cè)定中相似濃度下具有活性。兩種形式的毒素都有活性的事實(shí)表明C末端可以位于緊密卷曲的天然形式分子的內(nèi)側(cè)，所以不太可能成為直接提供肽的毒性的區(qū)域。
羧基末端的特性以前分離的昆蟲活性毒素和昆蟲神經(jīng)肽6，13已具有酰胺化的羧基末端。
為了證實(shí)這些肽的C末端是否以游離酸或酰胺化的形式存在，在對(duì)這些肽中的一種進(jìn)行酸和酰胺兩種形式的化學(xué)合成基礎(chǔ)上采用了一種比較方法。
合成了含羧基末端區(qū)的毒素In2的內(nèi)蛋白酶Glu-C片段，它具有游離酸末端或者是酰胺末端，按上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性肽合成和去保護(hù)。
然后利用碘乙酸以與用于天然肽相似的方法使去保護(hù)的合成肽烷基化。以這種方式，合成了酰胺或酸形式的毒素In2殘基29-37的精確等同物。
In2 A-COOH NH2-Asn-Gly-Asn-Gln-Val-Lys-Arg-Cys-Asp-COOHIn2 A-CONH2NH2-Asn-Gly-Asn-Gln-Val-Lys-Arg-Cys-Asp-CONH2天然In2 A NH2-Asn-Gly-Asn-Gln-Val-Lys-Arg-Cys-Asp-？然后使用反相HPLC柱(
圖11)(Waters Deltapak3.9mm×150mm×5μm)和陽(yáng)離子交換柱(Polycat A，4.6mm×250mm×5μm，PolyLC，Activon，Melbourne，Australia)(
圖12)比較了這三種肽的HPLC洗脫特性。
圖11 顯示與合成的In2A-COOH共洗脫的天然In2，它反映天然肽以游離酸形式存在。為了進(jìn)一步證實(shí)，該陽(yáng)離子交換HPLC也顯示(
圖12)了天然In2A與In2A-COOH共洗脫。
隨后證明了In2的羧基末端是游離酸形式的。根據(jù)推理，同源系列的其它成員也可能具有游離酸羧基末端。
V1毒素的有效劑量給第六齡棉鈴蟲幼蟲(每劑量10只)注射5μl V1毒素。記錄24小時(shí)后的死亡或蠕動(dòng)數(shù)。用死亡或蠕動(dòng)百分率而不是死亡百分率作圖，因?yàn)?4小時(shí)內(nèi)死亡百分率的可變性太大。因此，提供了ED50而不是LD50。
劑量(ug) 死亡或蠕動(dòng)百分率 死亡百分率0 0 01 0 02 20 03 20 104 20 106 40 07.5 70 010 100 015 70 1020 90 1040 100 6060 90 10按照Finney D.J.(1971)14的方法進(jìn)行V1毒素對(duì)棉鈴蟲之有效劑量(50%)的概率單位評(píng)估。結(jié)果如圖7所示。所測(cè)定的ED50為7μg/幼蟲。
對(duì)20只棉鈴蟲第六齡幼蟲進(jìn)行稱重，平均體重為502.4mg，范圍是389-607mg。因此，ED50的估計(jì)值也可表示為14μg/g。
綠頭蒼蠅成蟲(Lucilia cuprina)的體量估計(jì)約為0.06g，因此，是棉鈴蟲幼蟲體量的8倍。
既然10μg V1毒素在4小時(shí)內(nèi)對(duì)綠頭蒼蠅成蟲有效(參見(jiàn)上文)，且7μg毒素在24小時(shí)內(nèi)使棉鈴蟲幼蟲發(fā)生蠕動(dòng)，因而很顯然，該毒素對(duì)兩種昆蟲的效力是可比的。
用粗漏斗網(wǎng)蜘蛛毒液和純化的毒素進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)已表明，這些毒素能在不到24小時(shí)內(nèi)引起不受控制的運(yùn)動(dòng)，在有些情況下只需7小時(shí)即可發(fā)生。既然當(dāng)采用高毒素劑量時(shí)在10分鐘內(nèi)對(duì)綠頭蒼蠅產(chǎn)生了相似的作用，可以預(yù)計(jì)如果劑量增加，這些毒素對(duì)棉鈴蟲幼蟲的作用速度也會(huì)大大加快。雖然這些毒素的作用速度似乎不可能達(dá)到現(xiàn)有毒素(如擬除蟲菊酯)的作用速度，但一種能在數(shù)小時(shí)內(nèi)阻止靶昆蟲進(jìn)食的殺蟲劑將會(huì)找到其商業(yè)出路。
毒素V1對(duì)新生小鼠的毒性為了確定毒素V1的相對(duì)毒性(與哺乳動(dòng)物性H.versutus毒素Vesutoxin相比)，進(jìn)行了涉及新生小鼠的生物測(cè)定。對(duì)總共8只新生(鼠齡小于24小時(shí))Swiss Outbred小鼠稱重，確定每只小鼠的平均體重為1.75g。將這些小鼠分成各4只的對(duì)照組和試驗(yàn)組。所遵循的生物測(cè)定方法是以Sheumack等人(1984)15和Sutherland(1980)16所述的方法為基礎(chǔ)的。試驗(yàn)組的小鼠每只單一劑量接受溶于20μl 1%乙酸中的4.4μg毒素V1，用微升注射器(Scientific Glass Engineering)經(jīng)皮下注射至小鼠背部。對(duì)照組的小鼠每只接受20μl 1%乙酸的類似注射。然后在前6小時(shí)內(nèi)按小時(shí)觀察小鼠，然后每24小時(shí)觀察小鼠。
兩組中所有存活的小鼠在注射后24小時(shí)的時(shí)間中顯然未受到影響。已經(jīng)計(jì)算出給小鼠使用2.5mg/kg的毒素劑量(質(zhì)量)是Sheumack等人(1984)15在相似實(shí)驗(yàn)條件下確定的Vesutoxin之LD50劑量的5倍。當(dāng)與哺乳動(dòng)物毒素Vesutoxin相比時(shí)，這一結(jié)果使得昆蟲活性毒素V1在哺乳動(dòng)物中顯得相對(duì)無(wú)活性。
對(duì)純化的和合成的漏斗網(wǎng)蜘蛛毒素的試驗(yàn)對(duì)得自雄性A.robustus毒液的逆相HPLC分級(jí)分離的活性部分進(jìn)行測(cè)序的初步嘗試表明毒素是不純的。因此，取3mg樣品進(jìn)一步純化，然后試驗(yàn)3個(gè)可能的活性部分，結(jié)果如下R1a部分8只棉鈴蟲幼蟲均在24小時(shí)內(nèi)全部存活，但其中有7只幼蟲在48小時(shí)后死亡，沒(méi)有無(wú)目的蠕動(dòng)的確切證據(jù)。
Rlb部分7只幼蟲24小時(shí)內(nèi)全部存活，但48小時(shí)后全部死亡，同樣無(wú)明確蠕動(dòng)證據(jù)。
Rlc部分7只幼蟲中有6只在24小時(shí)內(nèi)表現(xiàn)明顯的蠕動(dòng)，48小時(shí)內(nèi)7只幼蟲全部死亡。
因?yàn)榭梢缘玫较喈?dāng)大量的雌性A.infensus毒液，所以首先對(duì)得自該毒液的活性部分進(jìn)行氨基酸順序測(cè)定和隨后的合成。制備了據(jù)信相當(dāng)于50μg毒素的合成材料的初制品，并以通用方法試驗(yàn)了其對(duì)棉鈴蟲幼蟲的作用。從該合成中得到了三個(gè)部分，所得的測(cè)定結(jié)果如下峰F(按照洗脫天然In2的方法洗脫)在72小時(shí)內(nèi)，被注射的5只幼蟲中有3只表現(xiàn)出由天然毒素所致的特征性無(wú)目的蠕動(dòng)。
峰G(在峰F之后立即洗脫的可能不純的部分)在72小時(shí)內(nèi)，對(duì)5只被注射的幼蟲無(wú)一表現(xiàn)出有害作用。
峰H(考慮為被還原的合成起始物)在72小時(shí)內(nèi)，對(duì)5只被注射的幼蟲無(wú)一表現(xiàn)出有害作用。
鹽水對(duì)照5只幼蟲給予5μl昆蟲鹽水注射，在注射后的72小時(shí)內(nèi)沒(méi)有遭受明顯的不利影響。
因?yàn)樵谑状魏铣稍囼?yàn)中得到可用于測(cè)定的物質(zhì)的量太小，所以用稍增大了用量的起始物重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。對(duì)明顯等同于峰F、G和H的部分的測(cè)定結(jié)果為部分57只被注射的幼蟲中有6只在24小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)了無(wú)目的蠕動(dòng)。
部分6在24小時(shí)后所有7只幼蟲均保持良好健康狀況。
部分77只幼蟲中有6只在24小時(shí)內(nèi)存活，第7只未表現(xiàn)出蠕動(dòng)即死亡。
鹽水對(duì)照所有7只幼蟲在至少24小時(shí)期間內(nèi)保持良好健康狀態(tài)。
在第三個(gè)In2重折疊實(shí)驗(yàn)中，相當(dāng)于約1.7mg粗A.infensus毒液的物質(zhì)被轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝问?B695-7)或酰胺形式(B694-7)。記錄的測(cè)定數(shù)據(jù)為酸形式所有6只幼蟲在72小時(shí)內(nèi)都未受到該制劑的影響。
酰胺形式所有10只幼蟲在24小時(shí)內(nèi)全部出現(xiàn)了無(wú)目的蠕動(dòng)。
鹽水對(duì)照所有8只幼蟲在72小時(shí)后均保持良好健康狀況。
因?yàn)樵?jīng)預(yù)料，如果酸形式的In2經(jīng)過(guò)正確地重折疊，它將成為殺蟲劑，因此作出了生產(chǎn)時(shí)的另一個(gè)嘗試，該次測(cè)定結(jié)果是B746-1(相當(dāng)于約3mg原始毒液)在24小時(shí)內(nèi)觀察到無(wú)目的蠕動(dòng)，在3天內(nèi)，9只幼蟲中的7只或者持續(xù)蠕動(dòng)，或者已經(jīng)死亡。
B746-2(也相當(dāng)于約3mg毒液)3天內(nèi)所有被注射的9<p>
另外5只樣本被注入昆蟲鹽水，在隨后的24小時(shí)內(nèi)未遭受到任何不利的影響。
桔青銅蝽(Bronze Orange Bug)-Musgraveia sulciventris將4μl毒液注射到5只麻醉的中期若蟲樣本側(cè)腹部。10分鐘后所有昆蟲變得無(wú)活力，并且看上去已死亡，在24小時(shí)內(nèi)沒(méi)有恢復(fù)。
用昆蟲鹽水替代毒液注射的另外4只昆蟲無(wú)任何不利影響產(chǎn)生。
雙翅目綠頭蒼蠅只有這種昆蟲的成蟲易于得到。A.infensus毒液對(duì)綠頭蒼蠅能產(chǎn)生劇烈的影響以致當(dāng)用沾染該毒液并充以1.0μl昆蟲鹽水的微注射器對(duì)9只樣本進(jìn)行注射時(shí)，幾乎立即產(chǎn)生麻痹。6小時(shí)后觀察到某種程序的恢復(fù)，但很顯然，綠頭蒼蠅對(duì)該毒液非常敏感。
在5只注射昆蟲鹽水作為對(duì)照的樣本中，無(wú)任何即發(fā)影響，并且全部存活至少6小時(shí)。不幸的是，注射創(chuàng)傷使得對(duì)該試驗(yàn)的解釋比在另外情況下應(yīng)有的解釋更為困難。
總之，用A.infensus毒液對(duì)所有5種昆蟲進(jìn)行的初步試驗(yàn)表明，該毒液除了對(duì)棉鈴蟲外還對(duì)更多種昆蟲具有殺蟲作用。
純化的V1毒素對(duì)除棉鈴蟲外的昆蟲的作用為了確定該毒素對(duì)除棉鈴蟲外的昆蟲的活性，如前所述，將共10mg粗毒液分級(jí)分離，并分成5份。該5份樣本用于抗其它昆蟲的生物測(cè)定。
鞘翅目黃粉甲蟲-黃粉甲用純化的V1毒素對(duì)黃粉甲的終期幼蟲進(jìn)行試驗(yàn)。分別用含0.2、0.02、0.002或0mgV1毒素的3μl昆蟲鹽水對(duì)每組為8只幼蟲的各組幼蟲注射。在頭24小時(shí)內(nèi)所有幼蟲表現(xiàn)為未受影響，但在48小時(shí)時(shí)，最高劑量組的所有8只幼蟲和次高劑量組的6只幼蟲表現(xiàn)出了該毒素引起的特征性蠕動(dòng)。低劑量組和對(duì)照組幼蟲48小時(shí)內(nèi)均未受到影響。
綠頭蒼蠅-Lucilia cuprina綠頭蒼蠅Lucilia cuprina的成蟲得自昆土蘭大學(xué)的昆蟲學(xué)系。8只一組的成蟲用溶于昆蟲鹽水中的1.0μl V1毒素注射(胸背部)，各組每只昆蟲的毒素劑量分別為100μg、10μg、1μg、0.1μg和0μg。最高劑量組所有8只成蟲在10分鐘內(nèi)出現(xiàn)了失控的運(yùn)動(dòng)，并在4小時(shí)內(nèi)死亡。10μg劑量組在4小時(shí)內(nèi)有一只成蟲死亡，其余7只于24小時(shí)死亡。兩個(gè)低劑量組和對(duì)照組全部存活了24小時(shí)而無(wú)明顯影響。
桔青銅蝽-Musgraveia sulciventris也試驗(yàn)了V1毒素對(duì)桔青銅蝽M.sulciventris的作用。雖然該昆蟲來(lái)源有限，但仍用相當(dāng)于0.2mg純毒素的5μl V1毒素的昆蟲鹽水溶液注射8只成蟲樣本。24小時(shí)內(nèi)有3只表現(xiàn)出失控運(yùn)動(dòng)，并且在48小時(shí)內(nèi)所有8只成蟲均死亡。給6只晚齡若蟲注射3μl(因?yàn)樗鼈儽瘸上x小)毒素(1/10劑量相當(dāng)于0.012mg V1毒素)，但全部存活了2天，同8只注入5μl昆蟲鹽水的對(duì)照成蟲一樣。
蠊-美洲大蠊此次用純化的V1毒素(注射5μl相當(dāng)于0.2mg毒液)注射作為一組的8只 蠊。6小時(shí)內(nèi)8只樣本中有6只出現(xiàn)了明顯的毒性作用，2只嚴(yán)重中毒。最明顯的作用是腿和口器的失控運(yùn)動(dòng)。但隨后的3天內(nèi)這些
蠊逐步完全恢復(fù)。
同樣，注射昆蟲鹽水的8只對(duì)照
蠊全部未受影響。
澳大利亞疫蝗-澳洲疫蝗(Chortoicetes terminifera)用純化的V1毒素以相當(dāng)于每只昆蟲樣本0.2mg的劑量注射作為一組的8只蝗蟲。在6小時(shí)內(nèi)所有8只蝗蟲均死亡或表現(xiàn)為自發(fā)抽搐，并且在18小時(shí)內(nèi)沒(méi)有恢復(fù)。
用0.02mg劑量的V1毒素注射作為第二組的8只蝗蟲。其中，有3只在24小時(shí)內(nèi)死亡，另外4只表現(xiàn)出自發(fā)抽搐，到第36小時(shí)有7只死亡。
用昆蟲鹽水注射總共9只蝗蟲作為對(duì)照組。所有這些昆蟲都至少存活24小時(shí)而無(wú)有害影響。
總之，這些生物測(cè)定注射試驗(yàn)表明這些毒素是有效的，并可以用于控制棉鈴蟲以外的昆蟲。
毒液喂飼試驗(yàn)將1ml常規(guī)棉鈴蟲飼料與收集到的100μl雌性A.infensus毒液混合。調(diào)配完成后，將該有毒飼料分成10等份，置于10個(gè)10ml塑料試管中，每管加入一只第三齡棉鈴蟲幼蟲。發(fā)現(xiàn)24小時(shí)后所有幼蟲食光各自的有毒飼料，于是再恢復(fù)提供正常飼料。無(wú)一幼蟲受到不利影響，全部在通常時(shí)間正?；?。
表 1 毒素產(chǎn)率及生物測(cè)定結(jié)果
a.產(chǎn)率和劑量是從根據(jù)氨基酸分析和氣相測(cè)序結(jié)果間接估計(jì)的(未考慮分離中的丟失)。
b.如在“毒液和其部分的生物測(cè)定”部分中所定義的。每一對(duì)數(shù)字中的左邊數(shù)字是受影響數(shù)，右邊的數(shù)字是被試總數(shù)。
c.實(shí)際注射的劑量。括號(hào)內(nèi)給出了重量(μg)。它們等同于特定的摩爾量。
表 2氨基酸分析數(shù)據(jù)
表 2(續(xù))氨基酸分析數(shù)據(jù)
a 未測(cè)。
Cal根據(jù)氨基酸分析計(jì)算的比率。
Seg根據(jù)氨基酸順序測(cè)定的比率。
表 3 等離子體解吸質(zhì)譜分析結(jié)果<
<p>表 4內(nèi)蛋白酶Glu-C消化之毒素Ⅵ片段的氨基酸分析和氣相測(cè)序數(shù)據(jù)
氣相測(cè)序片段ANH2-Asn-Gly-Asn-Thr-Val-Lys-Arg-CMCys-Asp-COOH片段CNH2-Ser-Pro-Thr-CMCys-Ile-Pro-Ser-Gly-Gln-Pro-CMCys-Pro-Tyr-Asn-Glu-COOHCalc.計(jì)算的比率。
Exp.實(shí)驗(yàn)的比率。
N.D.未測(cè)。
表 5Atrax formidabilis毒素的一級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)
1、氨基酸順序中的空隙表示測(cè)序循環(huán)中沒(méi)能定出的氨基酸，這些氨基酸可能是半胱氨酸殘基。
2、根據(jù)氨基酸順序確定的實(shí)驗(yàn)比率。
表 6雌性原毒液(A.infensus)的作用(4μl/幼蟲)
表 8A.robustus毒液部分對(duì)棉鈴蟲的試驗(yàn)
表 9雌性A.versuta和A.infensus毒液部分對(duì)棉鈴蟲的試驗(yàn)
(Vers)H.versuta(inf)A.infensus
表 10A.formidabilis生物檢測(cè)結(jié)果
表 11A.formidabilis毒素氨基酸分析結(jié)果
N.D.＝未測(cè)工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了能用于生產(chǎn)殺蟲劑以保護(hù)具有商業(yè)重要性作物的毒素。
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權(quán)利要求
1.一種相對(duì)分子量約4000a.m.u.的多肽毒素，該多肽由36-37個(gè)氨基酸殘基組成，并能夠形成使毒素對(duì)昆蟲幼蟲和/或昆蟲成蟲具有毒素性的3個(gè)鏈間二硫鍵。
2.如本文所定義的毒素In1、In2、In3、MR1、V1、Fla和F1b。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的毒素，所說(shuō)毒素是一種合成毒素。
4.呈羧基酰胺化形式的權(quán)利要求1或2的毒素。
5.如前文所限定的權(quán)利要求1或2的多肽毒素的變異體。
6.表達(dá)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)所述之毒素或權(quán)利要求5所述之變異體的昆蟲病毒。
7.能向害蟲釋放根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的毒素或權(quán)利要求5所述的變異體的殺蟲劑組合物，其含有權(quán)利要求6所述的昆蟲病毒和農(nóng)業(yè)上可接受的載體或稀釋劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的殺蟲劑組合物，其中病毒能夠表達(dá)作為晚期蛋白的毒素。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的殺蟲劑組合物，其中病毒是桿狀病毒。
10.一種控制害蟲損壞作物的方法，包括用權(quán)利要求7所述的殺蟲劑組合物處理作物或害蟲和/或其幼蟲。
11.一種控制害蟲損壞作物的方法，該方法包括提供一個(gè)表達(dá)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的毒素或權(quán)利要求5所述的變異體的植物品種，或在作物附近提供這樣的植物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所說(shuō)的植物品種選自棉花、煙草、馬鈴薯、綠豆、甜玉米、苜蓿、大豆、高梁、豌豆、亞麻子、紅花、油菜子、向日葵和白羽扇豆。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的方法，其中的害蟲是棉鈴蟲(Heliothis)。
14.編碼權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)所述之毒素或權(quán)利要求5所述變異體的多核苷酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的多核苷酸，所說(shuō)核苷酸是合成的。
16.根據(jù)權(quán)利要求7所述的殺蟲劑組合物，其包括一種昆蟲引誘劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及來(lái)自澳大利亞漏斗網(wǎng)蜘蛛的殺蟲劑毒素及其在控制害蟲中的應(yīng)用。舉證說(shuō)明了七種新毒素。本發(fā)明還涉及編碼毒素的多核苷酸、表達(dá)毒素的昆蟲病毒和植物。這些毒素分子的變異體也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
文檔編號(hào)A01N33/04GK1079749SQ9310250
公開(kāi)日1993年12月22日 申請(qǐng)日期1993年1月30日 優(yōu)先權(quán)日1992年1月31日
發(fā)明者M·E·H·豪登, P·K·阿特金遜, M·I·泰勒, E·J·馮納斯 申請(qǐng)人:南昆士蘭州大學(xué), 南昆士蘭大學(xué), 農(nóng)村工業(yè)研究及發(fā)展公司, 迪金研究有限公司