專利名稱：敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物—敬釗毒素—v在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽活性物質(zhì)在醫(yī)用配制品中的用途，尤其是敬釗纓毛蜘
蛛毒素提取物 一 敬釗毒素一 v在制備鎮(zhèn)痛藥物中的用途。
背景技術(shù)：
ZL200610031864.5號專利申請公開了從敬釗纓毛蜘蛛粗毒中提取分離出新 型神經(jīng)毒素一敬釗毒素一V (簡稱敬釗鎮(zhèn)痛肽)的方法。敬釗鎮(zhèn)痛肽是一種新型 哺乳動物神經(jīng)毒素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為由29個氨基酸殘基以特定的順序組成的多肽， 含有三對鏈內(nèi)二硫鍵，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下式
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物一敬釗毒素一v在制備鎮(zhèn)
痛藥物中的應(yīng)用，這種鎮(zhèn)痛藥物既能夠明顯減輕病人的疼痛，且沒有類似嗎啡 的成癮毒副作用。
本發(fā)明所述的敬釗鎮(zhèn)痛肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖l所示，其中Y為酪氨酸，C為 半胱氨酸，Q為谷氨酸，K為賴氨酸，W為色氨酸，M為甲硫氨酸，T為蘇氨 酸，D為天門冬氨酸，S為絲氨酸，R為精氨酸，A為丙氨酸，E為谷氨酸，G 為甘氨酸，L為亮氨酸，I為異亮氨酸。敬釗鎮(zhèn)痛肽可作為單一有效活性組份用 于制備鎮(zhèn)痛藥物。
鎮(zhèn)痛藥物是一類能夠減輕疾病痛苦的物質(zhì)，不僅能夠選擇性地減輕或緩解 疼痛感覺，也可以緩解因劇烈疼痛而引起的恐懼、緊張及焦慮等不愉快的情緒。 目前的鎮(zhèn)痛藥物可以分為解熱鎮(zhèn)痛藥和麻醉性鎮(zhèn)痛藥物兩類，前者以阿斯匹林 為代表，通過對組織中前列腺素合成過程的抑制作用，減輕神經(jīng)末梢對致痛物質(zhì)的敏感性，主要用于解除炎癥性疼痛和其他鈍疼；后者以嗎啡為代表，其作 用部位主要在丘腦和皮層，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的p-型阿片受體，以緩解銳痛、 鈍痛和內(nèi)臟絞痛，從而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，主要用于各種疾病所引起的疼痛和手術(shù) 后病人的嚴(yán)重疼痛，特別是晚期癌癥疼痛。但是目前這種以嗎啡為代表的麻醉 性鎮(zhèn)痛藥物存在成癮性強，戒斷癥狀嚴(yán)重，病人必須不斷增加劑量才能維持鎮(zhèn) 痛效果，而且最終導(dǎo)致對這類藥物失效，同時對神經(jīng)損傷性疼痛無療效等主要 缺點。
本發(fā)明的敬釗鎮(zhèn)痛肽是通過與特異性分布于外周神經(jīng)元上的河豚毒素不敏
感型鈉離子通道亞型(Navl.8、 Navl.9)以及河豚毒素敏感型鈉離子通道亞型 Navl.7結(jié)合，抑制相關(guān)的電壓門控鈉離子通道電流而阻斷痛覺神經(jīng)信號的傳導(dǎo)， 因此具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，但沒有明顯的毒副作用。


下面將結(jié)合附圖與動物藥理實驗對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。 圖1敬釗鎮(zhèn)痛肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖2敬釗鎮(zhèn)痛5太硬l莫外注射對福爾馬林所致大鼠強直性疼痛的鎮(zhèn)痛作用。 圖3肌肉注射敬釗鎮(zhèn)痛肽對福爾馬林所致大鼠強直性疼痛的鎮(zhèn)痛作用。 圖4肌肉注射敬釗鎮(zhèn)痛肽對手術(shù)后疼痛的鎮(zhèn)痛作用。
具體實施例方式
為了更好的理解和更充分的公開本發(fā)明，下面將通過大鼠硬膜外注射與肌 肉注射兩種用藥途徑，采用大鼠福爾馬林致炎疼痛實驗動物模型與手術(shù)后實驗 動物疼痛模型來說明敬釗鎮(zhèn)痛肽的鎮(zhèn)痛作用。
實驗1:硬膜外注射敬釗鎮(zhèn)痛肽對福爾馬林所致大鼠強直性疼痛的鎮(zhèn)痛作用。
1)實驗用主要原料實驗用敬釗鎮(zhèn)痛肽是從敬釗纓毛蜘蛛粗毒中分離純化 而得到，同時通過HPLC和MALDI-TOF質(zhì)譜儀鑒定，其純度為98%以上；PE-10 型聚乙烯管為美國Befon-Dickson公司生產(chǎn)；SD實驗大鼠由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué) 院動物房提供，體重180-220g之間，肌注生理鹽水與肌注嗎啡均購自湖南師范 大學(xué)校醫(yī)院。2) 給藥途徑硬膜外注射是目前手術(shù)后病人與晚期癌癥病人進(jìn)行鎮(zhèn)痛的常
用給藥方式，該方式具有有效作用集中持久，毒副作用小等優(yōu)點。
具體操作如下手術(shù)前先用鹽酸氯胺酮0.4-0.6ml麻醉大鼠，剪掉兩耳后方
的毛，酒精棉消毒，然后切開大鼠頸后部皮膚，依次分離肌層，暴露出寰枕膜, 用五號針挑開寰枕膜與第一頸椎之間的結(jié)膜，但不挑破寰枕膜，然后將早已準(zhǔn)
備好的PE-10聚乙烯管插入硬膜外腔，插入深度為7.5 cm，直達(dá)腰膨大處，插管 方法與Yaksh等人報道的方法相一致，在管的開口處預(yù)先用封口膜纏一小結(jié)球 以確定插入深度，縫合小球固定在頸背肌。用火星封暴露在外的PE-10管口以 防感染。手術(shù)口涂碘酒消毒。手術(shù)后注射20萬單位青霉素鈉消炎。實驗結(jié)束后， 注入10 |iL滂胺天蘭染料，解剖后觀察插管位置是否正確。術(shù)后動物均單籠飼 養(yǎng)，恢復(fù)一周，選擇狀態(tài)正常大鼠分為6組，每組IO只，分別是生理鹽水對照 組，嗎啡陽性對照組和4個敬釗鎮(zhèn)痛肽溶液劑量組。
3) 大鼠福爾馬林致炎疼痛模型的建立在大鼠爪跖部皮下注射稀釋的福爾 馬林(1%-5%)后，實驗動物會出現(xiàn)舔、咬注射的足爪和抬腿等行為反應(yīng)，并 呈現(xiàn)兩個反應(yīng)時相注射后立即產(chǎn)生的早時相(持續(xù)5-10min)和注射后15-60 min的遲時相，前者是基于化學(xué)刺激直接興奮傷害性感受器，而后者包含組織痛 機理。 ，
4) 藥物劑量設(shè)置:被試藥物敬釗鎮(zhèn)痛肽設(shè)置四個劑量組，分別為10.0 )Ig/kg、
25.0 ng/kg、 50.0 pg/kg和75.0 fig/kg體重，陽性對照藥物鹽酸嗎啡的劑量組為 25.0 pg/kg體重，陰性對照為生理鹽水，其注入硬脊膜外腔容量同以上測試藥物， 均按1.0)iiL/10g體重(鼠)計算，給藥次數(shù)為測定鎮(zhèn)痛前30min給藥。
5) 實驗結(jié)果與分析
參照Lewis和Kellgren等的方法，實驗在大鼠插管手術(shù)后第五天進(jìn)行，此 時動物已處于完全清醒的正常狀態(tài)，對有運動功能障礙者予以剔除。實驗時室 溫25'C，濕度40-60%。實驗時間9 : 00—18 : 00，隔絕噪音。實驗大鼠在試驗 開始前3天被放置在觀察室(一個20x20x30有機玻璃盒，并提供足夠食物及飲 水)中每天至少30min，使其適應(yīng)實驗環(huán)境，消除恐懼及不安。大鼠實驗前至少 在觀察室內(nèi)再適應(yīng)30min，然后經(jīng)留置的導(dǎo)管向硬膜外腔給藥敬釗鎮(zhèn)痛肽、鹽酸 嗎啡或生理鹽水。給藥30 min后在大鼠后腳掌皮下注射5%福爾馬林液50 |iiL， 立即進(jìn)行測試，記錄每個5min內(nèi)足底皮下注射了福爾馬林液的大鼠行為表現(xiàn)的 疼痛評分值(S).福爾馬林的致痛定量是以消耗在不同行為狀態(tài)的總時間來衡量的，不同的行為狀態(tài)是指動物舔、咬、搖被注射的足或減輕在被注射足上所承
受重量的各種行為表現(xiàn)，測定時間持續(xù)60min。疼痛評估曲線見圖2。圖中縱坐 標(biāo)每一個點代表鼠后肢足底皮下注射福爾馬林液后，每5 min內(nèi)大鼠疼痛評分值 (S)。橫坐標(biāo)每個點代表每5min時間間隔。由圖中可見各組實驗大鼠足底皮 下注射福爾馬林后，疼痛反應(yīng)均呈典型二相反應(yīng)。第一相反應(yīng)(急痛)在注射 后立即開始，持續(xù)約5-10min。接著15-20min，鼠很少有提示傷害性作用的行為。 第二相反應(yīng)(慢痛)大約在注射福爾馬林后20-25min開始，持續(xù)到測痛結(jié)束。
與生理鹽水對照，4個不同劑量的敬釗鎮(zhèn)痛肽對福爾馬林所致大鼠強直性疼 痛均有明顯鎮(zhèn)痛效應(yīng)，其鎮(zhèn)痛效應(yīng)隨敬釗鎮(zhèn)痛肽的劑量遞增呈正相關(guān)，用藥后 30 min鎮(zhèn)痛效果最強，鎮(zhèn)痛作用可以持續(xù)近60 min。其中，硬膜外注射75.0 pg/kg 敬釗鎮(zhèn)痛肽的作用效果與注射25.0 pg/kg嗎啡的鎮(zhèn)痛效果無顯著性差異。所有實 驗動物用藥后，均未呈現(xiàn)任何明顯的毒副作用癥狀，并且全部沒有后遺癥。
實驗2:肌肉注射敬釗鎮(zhèn)痛肽對福爾馬林所致大鼠強直性疼痛的鎮(zhèn)痛作用
1) 實驗用主要原料實驗用敬釗鎮(zhèn)痛肽是從敬釗纓毛蜘蛛粗毒中分離純化 而得到，同時通過HPLC和MALDI-TOF質(zhì)譜儀鑒定，其純度為98%以上；SD 實驗大鼠由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物房提供，體重180-220g之間，肌注生理鹽
水與肌注嗎啡均購自湖南師范大學(xué)校醫(yī)院。
2) 肌肉注射給藥途徑首先用75%的酒精對大鼠一側(cè)大腿進(jìn)行消毒處理， 然后從大腿外側(cè)距膝蓋骨2/3處由后向前進(jìn)針，進(jìn)針角度以30度為宜，刺入肌 肉大約0.5cm即可，注意不要刺入太深，以免刺傷骨頭。
3) 大鼠福爾馬林致炎疼痛模^的建立在大鼠爪跖部皮下注射稀釋的福爾 馬林(1°/。-5%)后，實驗動物會出現(xiàn)舔、咬注射的足爪和抬腿等行為反應(yīng)，并 呈現(xiàn)兩個反應(yīng)時相注射后立即產(chǎn)生的早時相(持續(xù)5-10min)和注射后15-60 min的遲時相，前者是基于化學(xué)刺激直接興奮傷害性感受器，而后者包含組織痛 機理。
4) 實驗分組與藥物劑量敬釗鎮(zhèn)痛肽實驗動物數(shù)為10只一組，肌肉注射 敬釗鎮(zhèn)痛肽的劑量為500 pg/kg，空白實驗對照組動物數(shù)為10只，肌肉注射生理 鹽水的劑量為1.0^L/g，陽性實驗對照組動物數(shù)為IO只，肌肉注射嗎啡的劑量 為500.0 |ag/kg。
5) 實驗結(jié)果與分析
給藥30 min后在大鼠后腳掌皮下注射5。/。福爾馬林液50 pL，立即進(jìn)行測 試，記錄每個5min內(nèi)足底皮下注射了福爾馬林液的大鼠行為表現(xiàn)的疼痛評分值(S)福爾馬林的致痛定量是以消耗在不同行為狀態(tài)的總時間來衡量的，不同的 行為狀態(tài)是指動物舔、咬、搖被注射的足或減輕在被注射足上所承受重量的各
種行為表現(xiàn)，測定時間持續(xù)60min。疼痛評估曲線見圖3，圖中縱坐標(biāo)每一個點 代表鼠后肢足底皮下注射福爾馬林液后，每5min內(nèi)大鼠疼痛評分值(S)。橫坐 標(biāo)每個點代表每5 min時間間隔。實驗顯示，與肌肉注射生理鹽水實驗組相比較， 肌肉注射500 pg/kg的敬釗鎮(zhèn)痛肽具有明顯的鎮(zhèn)痛效果，且在實驗過程中，未發(fā) 現(xiàn)有任何明顯的毒副作用，并且全部沒有后遺癥。而肌肉注射嗎啡與生理鹽水 組相比較，鎮(zhèn)痛效果不明顯，證明肌肉注射等劑量嗎啡的鎮(zhèn)痛效果比注射敬釗 鎮(zhèn)痛肽的鎮(zhèn)痛作用要弱得多，這與硬膜外給藥途徑的實驗結(jié)果是非常吻合的。 實驗3:肌肉注射敬釗鎮(zhèn)痛肽對手術(shù)后疼痛的鎮(zhèn)痛作用
1) 實驗用主要原料實驗用敬釗鎮(zhèn)痛肽是從敬釗纓毛蜘蛛粗毒中分離純化
而得到，同時通過HPLC和MALDI-TOF質(zhì)譜儀鑒定，其純度為98%以上；SD 實驗大鼠由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物房提供，體重180-220g之間，肌注生理鹽
水與肌注嗎啡均購自湖南師范大學(xué)校醫(yī)院。
2) 肌肉注射給藥途徑首先用75%的酒精對大鼠一側(cè)大腿進(jìn)行消毒處理， 然后從大腿外側(cè)距膝蓋骨2/3處由后向前進(jìn)針，進(jìn)針角度以30度為宜，刺入肌 肉大約0.5cm即可，注意不要刺入太深，以免剌傷骨頭。
3) 手術(shù)后疼痛實驗動物模型參照Yong-Xiang Wang(pain 84(2000): 151-158) 的方法進(jìn)行。先將大鼠稱重后，用乙醚進(jìn)行快速麻醉。將左足消毒后切開1.0 cm 長的創(chuàng)口，并確保只切開肌肉，而盡量避開大的血管，手術(shù)完畢后縫合2針。 大鼠很快就會蘇醒，待手術(shù)后1.5小時就可以開始進(jìn)行疼痛測定實驗。
4) 機械刺激測痛法參照陳軍(Pain,1999,83:67-76)等的方法將大鼠放 在一鐵絲網(wǎng)架上，用有機玻璃(20x20x25 cm)罩住，讓大鼠活動30分鐘直至 安靜，然后用一套(10根)10種不同內(nèi)徑的Von Frey尼龍絲，它們分別代表 IO種不同的力量，彎曲力量范圍是0.06-34.9g，其中1 10號代表的力量分別為 34.9g、 26.2g、 14.8g、 8.1g、 4.85g、 0.77g、 0.43g、 0.25g、 O.llg、 0.06g。
實驗開始時用Von Frey尼龍絲從鐵絲網(wǎng)下方刺激大鼠手術(shù)后足底的不同位
點，每一根Von Frey尼龍絲刺激10次(每次3—4秒)，能讓大鼠產(chǎn)生50%的
縮腿率的那一根絲被認(rèn)為是它的機械誘發(fā)痛域，痛域大于39.4g的被認(rèn)為是無反應(yīng)。
5) 實驗分組與藥物劑量敬釗鎮(zhèn)痛肽實驗動物數(shù)為10只一組，肌肉注射 敬釗鎮(zhèn)痛肽的劑量為500.0 Mg/kg，空白實驗對照組動物數(shù)為10只，肌肉注射生 理鹽水的劑量為1.0 mL/kg，陽性實驗對照組動物數(shù)為IO只，肌肉注射嗎啡的劑量為500.0嗎/kg。
6)實驗結(jié)果與分析
從圖4的實驗結(jié)果顯示，比較肌肉注射嗎啡的陽性實驗對照組與注射生理 鹽水的陰性實驗對照組，發(fā)現(xiàn)肌肉注射嗎啡能使手術(shù)后0.5-2.5 h痛域值積分顯 著下降，統(tǒng)計學(xué)顯示具有極顯著差異，說明手術(shù)后疼痛的實驗?zāi)Ｐ褪浅晒Φ摹?其中注射敬釗鎮(zhèn)痛肽的實驗動物在給藥后l-4.5h會產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，但與注射嗎 啡的實驗動物組相比較發(fā)現(xiàn)，敬釗鎮(zhèn)痛肽對手術(shù)后疼痛的肌肉注射的鎮(zhèn)痛效果 比嗎啡弱，手術(shù)后0.5-1.5小時之間兩者具有顯著性差異，但從作用時間來看， 敬釗鎮(zhèn)痛肽的作用時間要優(yōu)于嗎啡，持續(xù)時間長，而且在肌肉注射敬釗鎮(zhèn)痛肽 的實驗過程中沒有發(fā)現(xiàn)任何明顯的毒副作用，并且全部沒有后遺癥。
本文中所述的敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物一敬釗毒素一V與敬釗鎮(zhèn)痛肽具有 相同的含義。
權(quán)利要求
1、一種敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物—敬釗毒素—V在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用，所述的敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物—敬釗毒素—V的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為其中Y為酪氨酸，C為半胱氨酸，Q為谷氨酸，K為賴氨酸，W為色氨酸，M為甲硫氨酸，T為蘇氨酸，D為天門冬氨酸，S為絲氨酸，R為精氨酸，A為丙氨酸，E為谷氨酸，G為甘氨酸，L為亮氨酸，I為異亮氨酸，其特征在于敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物—敬釗毒素—V作為單一有效活性組份用于制備鎮(zhèn)痛藥物。
全文摘要
一種敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物—敬釗毒素—V在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用，特別是敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物—敬釗毒素—V作為單一有效活性組份用于制備鎮(zhèn)痛藥物。由于敬釗鎮(zhèn)痛肽是通過與分布于外周神經(jīng)元上的河豚毒素不敏感型鈉離子通道亞型(Nav1.8、Nav1.9)以及河豚毒素敏感型鈉離子通道亞型Nav1.7結(jié)合，抑制相關(guān)的電壓門控鈉離子通道電流而阻斷痛覺神經(jīng)信號的傳導(dǎo)，因此具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，且沒有明顯的毒副作用?？芍苽渲委煱┌Y、愛滋病、術(shù)中與術(shù)后、風(fēng)濕與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、坐骨神經(jīng)與三叉神經(jīng)性疼痛等病人的鎮(zhèn)痛藥。
文檔編號A61P29/00GK101428138SQ20081021806
公開日2009年5月13日 申請日期2008年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月4日
發(fā)明者嚴(yán)陸根, 鵬 劉, 劉中華, 曾雄智, 梁宋平, 冉 王, 曦 陳 申請人:深圳金蜘蛛生物科技有限公司