專利名稱：烷氧亞甲基表鬼臼毒葡糖苷的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一類新穎的抗腫瘤化合物，它們在抑制腫瘤生長方面的用途以及含有這些化合物的藥物組合物。特別是這類新穎化合物是4′-去甲基表鬼臼毒葡糖苷的衍生物。
表鬼臼毒吡喃葡萄苷(Etoposide)和表鬼臼毒噻吩糖苷(temiposide)是4′-去甲基表鬼臼毒葡糖苷的兩個衍生物。表鬼臼毒吡喃葡萄糖苷和表鬼臼毒噻吩糖苷在治療各種癌癥的臨床效果方面已被證實，并且前者目前在美國被批準用于治療小細胞肺癌和睪丸癌。
表鬼臼毒吡喃葡萄糖苷和表鬼臼毒噻吩糖苷令人滿意的治療和藥理學效果，促進並激發(fā)了在同類化合物中尋找其它活性類似物的積極性，本發(fā)明者在這一領域研究中所作出的努力，導致這一類新穎類似物的產(chǎn)生，在此將其公開揭示并提出權利要求。在動物試驗模型中，這些新的衍生物顯示出良好的抗實驗性白血病活性。
本發(fā)明提供了具有通式Ⅰ的化合物
其中，R1和R2之一為C1-5烷氧基，且另一個為氫，C1-5烷基，或C1-5烷氧基;R3為氫或-P(O)(O-M)2其中M為氫或一個堿金屬陽離子。
本發(fā)明還提供了包含有通式Ⅰ化合物的藥物組合物以及藥學上可接受的載體。
本發(fā)明的另一個方面是提供了一種在哺乳動物為宿主的動物身體上，抑制腫瘤生長的方法，其包括給予上述宿主抗腫瘤有效劑量的通式Ⅰ化合物。
本發(fā)明的優(yōu)選實例提供了通式Ⅰ化合物，其中R1和R2之一為氫，且另一個為C1-5烷氧基。更可取的是烷氧基團含有1～3個碳原子。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選實例提供了通式Ⅰ化合物，其中R1和R2為相同的C1-5烷氧基，更可取的是烷氧基團含有1～3個碳原子。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選實例提供了通式Ⅰ化合物，其中R3為氫。
這里所用的術語“烷基”和“烷氧基”既代表直鏈碳鏈又代表支鏈碳鏈;術語“堿金屬陽離子”包括鋰，鉀，鈉等等。
起始物4′-去甲基-4-O-β-D-吡喃葡糖基表鬼臼毒(下簡稱DGPE)是本領域技術中熟知的，有關它的制備在美國專利3，524，844中有描述。相同的化合物也可由表鬼臼毒吡喃葡萄糖苷經(jīng)酸水解很容易地制得。其它的起始原料，即原羧酸酯和原碳酸酯既可從市場上購買，也可用本領域中熟知的方法來制備。
通式Ⅰ化合物(其中R3為氫)可由DGPE與原羧酸酯或原碳酸酯反應來制備，上述原羧酸酯或原碳酸酯具有通式Ⅱ
其中R1和R2的定義同通式Ⅰ中的定義，Y為C1-5烷基基團。較合適的原羧酸酯有原甲酸三甲酯，原乙酸三甲酯，原丁酸三甲酯及原丙酸三乙酯;合適的原碳酸酯有原碳酸四甲酯和原碳酸四乙酯。該縮合反應是在惰性有機溶劑中進行的，如乙腈，二氯甲烷，丙酮等，反應溫度約為0-40℃，較好的為室溫。通常情況下，縮合在約1-24小時后完成。原羧酸酯或原碳酸酯的用量至少應與DGPE起始物等摩爾量，最好是超過DGPE的量。反應是在酸催化的條件下進行的，合適的酸催化劑有磺酸，如甲苯磺酸或樟腦磺酸。
使用具通式Ⅱ的試劑(其中R1和R2不相同)所進行的反應，通常給出一個含有兩種所期產(chǎn)品的混合物其一是R1處于直立位置，且R2處于平伏位置，另一個是R2處于直立位置，且R1處于平伏位置。于是，使用原甲酸三甲酯的反應，給出一個甲氧基處于直立位置(7″-β-甲氧基)的產(chǎn)物及一個甲氧基處于平伏位置(7″-α甲氧基)的產(chǎn)物。用常規(guī)的分離方法即可使這兩個異構產(chǎn)物分離，例如使該混合物進行柱層析(如C18反相柱)。
所得到的通式Ⅰ化合物可進一步衍生化形成相應的4′-磷酸酯(通式Ⅰ化合物，其中R3為-P(O)(O-M)2)。該反應可用熟知的方法，將羥基轉(zhuǎn)化為其相應的磷酸酯來實現(xiàn)。上述方法包括使通式Ⅰ化合物(其中R3為氫)與一個磷?；噭┤缛妊趿走M行反應，然后進行水解，得磷酸酯產(chǎn)物;或使前者(通式Ⅰ化合物)與二苯基氯磷酸酯進行反應，然后經(jīng)催化氫化得磷酸酯化合物。
生物活性對本發(fā)明中代表性的化合物進行了對鼠性可移植P388白血病的抗腫瘤活性的評價實驗。在雌性CDF1小鼠腹膜內(nèi)接種約106P388白血病細胞(0天)，于第1天以單劑量形式腹膜內(nèi)給予受試化合物，并對動物觀察50天。給藥動物相對于未給藥對照動物的平均存活時間(MST)的百分增加值是以%T/C來測定和報告的。具有%T/C值為125或更大值的化合物被認為是有明顯的抗腫瘤活性，表Ⅰ給出了體內(nèi)試驗結(jié)果的評價。
對本發(fā)明中的代表性化合物還進行了體外對四種腫瘤細胞系的細胞毒性測定。這些細胞系在一個含有5%CO2，溫度為37℃并有潤濕空氣的孵化器中生長和保存存在于含有卡那霉素(60ug/ml)的改良伊格爾氏培養(yǎng)基(Nissui)中的B16-F10鼠性黑素瘤，補充以非熱活性小牛胎血清(FCS，10%)和非必需氨基酸(0.6%);
存在于改良伊格爾氏培養(yǎng)基(MEM)中的Mosev人類結(jié)腸瘤，補充以FCS(10%);
存在于RPMI1640培養(yǎng)基(Nissui)中的K562人類骨髓白血病和K562/ADM，其為耐阿霉素亞系，它是由Takashi Tsuruo博士(東京大學)提供的，補充以FCS(10%)，青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100ug/ml)。
在使用B16-F10及Moser細胞系的實驗中，對呈指數(shù)增長的細胞進行收獲計數(shù)，并將它們懸浮于培養(yǎng)基中，濃度分別為每毫升1.5×104及3×104個細胞。在將細胞懸浮液(180ul)植入96孔的微量滴度平皿24小時后，向其中加入受試物質(zhì)(20ul)，然后將平皿培養(yǎng)72小時。抗腫瘤細胞的細胞毒性，在用中性紅溶液對可生存的細胞進行著色后，作比色法測定，波長為540nm。對于K562和K562/ADM細胞系來說，將900ul細胞懸浮液(每毫升8×104個細胞)與受試化合物(100ul)在一個24孔的組織培養(yǎng)皿中，于37℃，且有5%CO2存在的條件下進行培養(yǎng)48小時。用細胞計數(shù)器計算細胞的數(shù)目，從而對細胞毒性進行測定。體外細胞毒性的結(jié)果列于表2
實驗結(jié)果表明，本發(fā)明中的化合物作為抗腫瘤化合物是很有用的。因此，本發(fā)明提供了一種抑制哺乳動物腫瘤生長的方法，其包括給予腫瘤宿主抑制腫瘤有效劑量的通式Ⅰ抗腫瘤化合物?；诖四康?，該類藥物可用常規(guī)的給藥途徑進行給藥，其包括(但并不限于此)靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，瘤內(nèi)，動脈內(nèi)，淋巴內(nèi)和口服給藥;優(yōu)選的途徑是口服給藥。
本發(fā)明進一步提供了由式Ⅰ化合物與藥學上可接受的載體所組成的藥物組合物。該抗腫瘤組合物可制成任何一種藥物劑型，以適應所需的給藥途徑。該類組合物的實例包括口服的固體組合物，如片劑，膠囊劑，丸劑、粉劑及顆粒劑;口服的液體組合物，如溶液劑，懸浮劑，糖漿或酏劑以及非腸道服用的制劑，如無菌溶液，懸浮液及乳劑。也可將其制成無菌固體組合物形式，可以在使用前將其溶于無菌水，生理鹽水或其他無菌注射用的溶劑中。
就給定的哺乳類宿主而言，最佳劑量和給藥方案可很容易地由技術工藝熟練者確定。當然，根據(jù)特定的組合物配方，所用的特定化合物，應用的方式及特定部位，宿主以及所治的疾病，可以改變實際應用的劑量，這些是很容易理解的。許多能影響藥物作用的因素應予以考慮，即年令，體重，性別，飲食，服藥時間，給藥途徑，排泄速率，病人的情況，藥物組合物的情況，反應的敏感性以及病情的嚴重程度。
僅以下列例子說明本發(fā)明，然而并非對本發(fā)明的范圍加以任何限制，本發(fā)明的范圍由本說明書所附的權利要求單獨地加以規(guī)定。
從表鬼臼毒吡喃葡萄糖苷制備4′-去甲基-4-O-β-D-吡喃葡萄基表鬼臼毒將表鬼臼毒吡喃葡萄糖苷(5.88g，10mmol)，30%乙酸水溶液(100ml，乙酸∶水＝3∶7)及乙腈(50ml)的混合物回流9小時，減壓濃縮。所得殘余物經(jīng)硅膠柱層析(10%MeoH-CH2Cl2)得到2.60克(51%)的標題化合物，呈無色結(jié)晶狀。MP229°-233℃(文獻225°-227℃，Helv Chim Acta，1969，52∶948)。
實例1制備4′-去甲基-4-O-(4.6-O-β-甲氧基亞甲基-β-D-吡喃葡糖基)表鬼臼毒(1a)及4′-去甲基-4-O-(4.6-O-α-甲氧基亞甲基-β-D-吡喃葡糖基)表鬼臼毒(1b)向4′-去甲基-4-O-β-D吡喃葡糖基表鬼臼毒(600mg，1.1mmol)及原甲酸三甲酯(1.5ml)，二氯甲烷(60ml)的混合液中加入樟腦磺酸(85mg，0.37mmol)。反應混合液在室溫下攪拌20小時，用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，用硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，給出860mg粗制油液，經(jīng)C18-反相柱層析(35%MeoH-H2O)，給出292mg(45%)1a，呈無色結(jié)晶狀(甲醇重結(jié)晶)及60mg(9%)的1b，呈無色結(jié)晶狀(甲醇重結(jié)晶)。
1aMP 195°-198℃，HPLC測定，估計純度為95%.(LiChrosorb RP-18，70% MeOH-H2O)。
IRνmax(KBr)cm-13400，1760，1610.
UVλmax(MeOH)nm(ε)240(sh，13，300)，284(4，200).
1H NMR(CDCl3)δ5.42(1H，s，7″-H)，4.68(1H，d，J＝7.3Hz，1″-H)，4.00(1H，t，J＝10.3 Hz，6″-Hax)，3.88(1H，dd，J＝5.1 and 9.7 Hz，6″-Heq)，3.85(1H，t，J＝9.5 Hz，4″-H)，3.71(1H，dt，J＝2.2 and 9.2 Hz，3″-H)，3.4-3.5(2H，m，2″ and 5″-H)，3.38(3H，s，7″-OCH3)，2.64(1H，d，J＝2.2 Hz，3″-OH)，2.45(1H，d，J＝2.9Hz，2″-OH).
元素分析計算值(C29H32O14.H2O)C55.95，H5.50實驗值 C56.11，H5.331bMP 203°-205℃，HPLC測定，估計純度為85%IRνmax(Nujol)cm-13350，1760，1603.
UVλmax(MeOH)nm(ε)240(13，200)，284(4，300).
1H NMR(CDCl3)δ5.30(1H，s，7″-H)，4.68(1H，d，J＝7.3 Hz，1″-H)，4.23(1H，dd，J＝4.6 and 10.4 Hz，6″-Heq)，3.82(1H，dt，J＝2.2 and 8.8 Hz，3″-H)，3.71(1H，t，J＝10.5 Hz，6″-Hax)，3.54(3H，s，7″-OCH3)，3.46(1H，t，J＝8.8 Hz，4″-H)，3.4-3.5(2H，m，2″ and 5″-H)，2.72(1H，d，J＝2.6 Hz，3″-OH)，2.40(1H，d，J＝2.9Hz，2″-OH).
元率分析計算值(C29H32O14.H2O)C55.95 H5.50實驗值 C56.07 H5.32實例2
制備4′-去甲基-4-O-(4，6-O-β-乙氧基亞甲基-β-D-吡喃葡糖苷)表鬼臼毒(2a)及4′-去甲基-4-O-(4，6-O-α-乙氧基亞甲基-β-D-吡喃葡糖基)表鬼臼毒(2b)采用4′-去甲基-4-O-β-吡喃葡糖基表鬼臼毒(1.012g，1.8mmol)，原甲酸三乙酯(6ml)及樟腦磺酸(60mg，0.26mmol)，重復實例1的方法，給出450mg(40%)的2a，用甲醇重結(jié)晶，呈無色結(jié)晶狀及221mg(19%)的2b，用甲醇全結(jié)晶，呈無色結(jié)晶狀。
2aMP 177°-178℃，HPLC測定，估計純度為90%IRνmax(Nujol)cm-13380，1760，1610.
UVλmax(MeOH)nm(ε)240(13，600)，285(4，200).
1H NMR(CDCl3)δ5.52(1H，s，7″-H)，4.68(1H，d，J＝7.7 Hz，1″-H)，4.03(1H，t，J＝10.3 Hz，6″-Hax)，3.87(1H，t，J＝9.5Hz，4″-H)，3.86(1H，dd，J＝5.1 and 9.7 Hz，6″-Heq)，3.71(1H，dt，J＝2.2 and 9.2Hz，3″-H)，3.61(2H，q，J＝7.0Hz，7″-OCH2CH3)，3.4-3.5(2H，m，2″ and 5″-H)，2.62(1H，d，J＝2.2 Hz，3″-OH)，2.43(1H，d，J＝2.6 Hz，2″-OH)，1.28(3H，t，J＝7.0Hz，7″-OCH2CH3).
元素分析計算值(C30H34O14.H2O)C56.60，H5.70實驗值 C56.30，H5.512bMP 168°-171℃，HPLC測定，估計純度為90%。
IRνmax(Nujol)cm-13400，1770，1610.
1H NMR(CDCl3)δ5.35(1H，s，7″-H)，4.68(1H，d，J＝7.7 Hz，1″-H)，4.22(1H，dd，J＝4.7 and 10.6 Hz，6″-Heq)，3.82(2H，q，J＝7.3Hz，7″-OCH2CH3)，3.70(1H，t，J＝10.3 Hz，6″-Hax)，3.45(1H，t，J＝9.1 Hz，4″-H)，3.4-3.5(2H，m，2″ and 5″-H)，2.73(1H，d，J＝2.2 Hz，3″-OH)，2.41(1H，d，J＝2.2 Hz，2″-OH)，1.28(3H，t，J＝7.3 Hz，7″-OCH2CH3).
元素分析計算值(C30H34O14.H2O)C56.60，H5.70實驗值 C56.31，H5.43實例3制備4′-去甲基-4-O-(4，6-O-二甲氧基亞甲基-β-D-吡喃葡糖基)表鬼臼毒(3)向4′-去甲基-4-O-β-D-吡喃葡糖基表鬼臼毒(344mg，0.61mmol)，原碳酸四甲酯(0.5ml)于四氫呋喃(3ml)-二氯甲烷(30ml)的混合液中加入樟腦磺酸(31mg，0.13mmol)。該混合液在室溫下攪拌2小時，用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑，得粗制半固體，經(jīng)硅膠柱層析(5%MeOH-CH2Cl2)給出310mg(80%)的3，呈無色粉末狀。
3MP 170°-173℃，HPLC測定，估計純度為95%
IRνmax(KBr)cm-13500，1775，1610.
UVλmax(MeOH)nm(ε)240(12，600)，284(4，100).
1H NMR(CDCl3)δ4.69(1H，d，J＝7.7Hz，1″-H)，4.04(1H，dd，J＝5.3 and 10.1 Hz，6″-Heq)，3.95(1H，t，J＝10.3Hz，6″-Hax)，3.7-3.8(2H，m，3″ and 4″-H)，3.46(3H，s，7″-OCH3eq)，3.36(3H，s，7″-OCH3aq)，3.4-3.5(2H，m，2″ and 5″-H)，2.63(1H，d，J＝2.1 Hz，3″-OH)，2.39(1H，d，J＝2.6 Hz，2″-OH).
元素分析計算值(C30H34O15.H2O)C55.21，H5.56實驗值 C55.63，H5.43實例4制備4′-去甲基-4-O-(4，6-二乙氧基亞甲基-β-D-吡喃葡糖基)表鬼臼毒(4)采用4′-去甲基-4-O-β-D-吡喃葡糖基表鬼臼毒(101mg，0.18mmol)原碳酸四乙酯(0.2ml)及樟腦磺酸(25mg，0.11mmol)，重復實例3的方法，給出81mg(68%)的4，為無色無定形固體。
4MP 152°-156℃，HPLC測定，估計純度為90%。
IRνmax(KBr)cm-13450，1776，1610.
UVλmax(MeOH)nm(ε)240(12，700)，285(4，300).
1H NMR(CDCl3)δ4.67(1H，d，J＝7.7 Hz，1″-H)，4.02(1H，dd，J＝5.9 and 10.4 Hz，6″-Heq)，3.97(1H，t，J＝10.3 Hz，6″-Hax)，3.76(2H，q，J＝7.3 Hz，7″-OCH2CH3eq)，3.74(1H，t，J＝9.5 Hz，4″-H)，3.65(2H，q，J＝7.3 Hz，7″-OCH2CH3ax)，3.4-3.5(2H，m，2″ and 5″-H)，2.64(1H，d，J＝1.8 Hz，3″-OH)，2.41(1H，d，J＝2.6 Hz，2″-OH)，1.27 and 1.24(6H，each t，J＝7.0 Hz，7″-OCH2CH3x 2).
元素分析計算值(C32H38O15.1/2H2O)C57.22H5.85實驗值 C57.19H5.97實例5-10除用下列原酸酯代替原甲酸三甲酯之外，重復實例1的步驟，得到相應的式Ⅰ化合物式Ⅰ產(chǎn)物
權利要求
1.具有下式的化合物
其中R1和R2之一為C1-5烷氧基，且另一個從由氫，C1-5烷基及C1-5烷氧基組成的基團中選擇，R3為氫或-P(O)(OM)2，其M為氫或堿金屬陽離子。
2.權利要求1中的化合物，其中R1和R2之一為C1-5烷氧基，且另一個為H。
3.權利要求1中的化合物，其中R1和R2分別為C1-5烷氧基。
4.權利要求1中的化合物，其中R3為H，R1和R2之一從由甲氧基及乙氧基組成的基團中選擇。
5.權利要求1中的化合物，其中R3為H，且R1和R2相同，從由甲氧基及乙氧基組成的基團中選擇。
6.由權利要求1的抗腫瘤有效量的化合物所組成的藥物組合物以及藥學上可接受的載體。
7.在哺乳動物體內(nèi)抑制腫瘤的方法，該方法包括給帶有腫瘤的宿主服用抗腫瘤有效劑量的權利要求1化合物。
全文摘要
本發(fā)明公開揭示了新穎的4′-去甲基表鬼臼毒葡糖苷的環(huán)狀原酸酯及原碳酸酯。該類化合物具有抗實驗性鼠性P388白血病的活性。
文檔編號A01N43/54GK1054770SQ90109189
公開日1991年9月25日 申請日期1990年11月17日 優(yōu)先權日1989年11月20日
發(fā)明者大沼毅, 內(nèi)藤隆之, 龜井英夫 申請人:布里斯托爾-米爾斯斯奎布公司