專利名稱:雷公藤藥材苗木組培快繁的方法
雷公藤藥材苗木組培快繁的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物栽培及管理技術(shù)，尤其涉及一種雷公藤藥材苗木組培快繁的 方法。
背景技術(shù)：
雷公藤(Tripterygium Wilfordii Hook f.簡(jiǎn)稱TWHF)是衛(wèi)矛科雷公藤屬木質(zhì)藤 本植物，又稱斷腸草、山砒霜、南蛇藤。雷公藤具有大毒，但它還具有具有解除血液凝聚性、 降低血液粘滯性、改善微循環(huán)和降低外周血液阻力的作用，以及抗炎、抗腫瘤、抗生育等多 種活性，其化學(xué)成分主要是二萜、三萜、倍半萜、生物堿等。因此雷公藤具有重要藥用價(jià)值。
目前，雷公藤多為野生，多分布于中亞熱帶區(qū)域內(nèi)，如我國(guó)的長(zhǎng)江流域以南各省區(qū) 至西南如湖南、湖北、江西、安徽、浙江、福建、廣東、廣西、臺(tái)灣等各省區(qū)。多生長(zhǎng)在海拔 300 500M的向陽(yáng)、多濕、稍肥沃的山谷、丘陵、溪邊灌叢、以及疏林中，喜溫暖濕潤(rùn)氣候。但 由于長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)野生雷公藤大量無(wú)序采挖，以及大面積營(yíng)造人工用材林的影響，破壞了雷 公藤的適生環(huán)境，使其蘊(yùn)藏量和生長(zhǎng)量都急劇下降。目前，可采挖量極為稀少，如福建省泰 寧縣年收購(gòu)量?jī)H1 2噸，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法滿足需求。
野生的雷公藤生長(zhǎng)緩慢、且藥用成分含量低(雷公藤甲素、乙素的會(huì)的含量只有 1/10萬(wàn))，可開(kāi)采的資源也逐漸減少，因此人們開(kāi)始逐步探索人工種植方法，但都僅限于扦 插繁殖。如公開(kāi)號(hào)為CN1994044A，
公開(kāi)日為2007. 07. 11的中國(guó)專利申請(qǐng)所公開(kāi)的一種雷公 藤的種植方法，其是采用扦插育苗再移植的方式進(jìn)行，重點(diǎn)是對(duì)植株進(jìn)行的各種處理。目前 還未出現(xiàn)雷公藤藥材苗木組培快繁的方法，以實(shí)現(xiàn)雷公藤優(yōu)良再生植株的培育，并建立雷 公藤良種組培基地，以為大量繁殖打下基礎(chǔ)，為雷公藤產(chǎn)業(yè)化發(fā)展保證原料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題，在于提供一種雷公藤藥材苗木組培快繁的方法，以實(shí) 現(xiàn)雷公藤優(yōu)良再生植株的培育，并建立雷公藤良種組培基地。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一種雷公藤藥材苗木組培快繁的方法，其包括
(1)制備外植體步驟在雷公藤植株上選擇幼嫩的芽、莖作為外植體，并進(jìn)行消毒 處理；
(2)初代培養(yǎng)步驟采用MS+0. 01mg/l基礎(chǔ)培養(yǎng)基為初代培養(yǎng)基，并進(jìn)行消毒處 理，在無(wú)菌條件下將外植體接種在消毒處理后的初代培養(yǎng)基上，并用瓶子封裝，并每天光照 14 16小時(shí)，溫度保持14 16度，瓶子外部濕度保持70%的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，直到誘導(dǎo) 出幼芽或叢生芽；
(3)增殖培養(yǎng)步驟將初代培養(yǎng)誘導(dǎo)形成的幼芽或叢生芽，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基 l/2ms+6-ba lmg/l+naaO. 2mg/l中進(jìn)行培養(yǎng)，并每天光照14 16小時(shí)，溫度保持14 16 度，瓶子外部濕度保持70%的條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
(4)壯苗培養(yǎng)步驟將增殖的叢生芽接種到壯苗培養(yǎng)基l/2ms+naa0. lmg/1中，并每天光照14 16小時(shí)，溫度保持14 16度，瓶子外部濕度保持70%的條件下進(jìn)行壯苗培 養(yǎng)，使幼苗株高生長(zhǎng)達(dá)2cm 5cm ；
(5)生根培養(yǎng)步驟從壯苗培養(yǎng)的幼苗中切取生長(zhǎng)健壯、葉色正常、葉片舒展、適 于生根的無(wú)根苗，接種在生根培養(yǎng)基l/ans+abt-l#0. 5mg/l+iba0. 2mg/l中并每天光照 14 16小時(shí)，溫度保持14 16度，瓶子外部濕度保持70%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，直到幼苗 基部長(zhǎng)出數(shù)根新根；
(6)組培苗煉苗移栽步驟組培苗煉苗3 7天后移入含蛭石、泥炭、珍珠巖等基 質(zhì)或混合基質(zhì)的穴盤(pán)中。
其中所述步驟(1)的外植體的消毒處理具體包括下述步驟
11)將采回的雷公藤枝條自莖尖開(kāi)始按1.8 2. 2cm剪取芽條放在洗衣粉與 0. 的多菌靈溶液的混合液的流水中沖洗1. 5小時(shí)；
12)然后在無(wú)菌室內(nèi)，用70%的乙醇表面消毒30秒，再用無(wú)菌水沖洗三遍，然后用 0. 升汞溶液消毒5 15分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗六遍，保證無(wú)氯化汞殘留。
所述步驟O)的初代培養(yǎng)基是采用熱壓滅菌方法進(jìn)行消毒處理，具體包括下述步 驟；
211)熱壓鍋放水至平把架；
212)把裝在瓶中的初代培養(yǎng)基放入熱壓鍋；
213)蓋上熱壓鍋蓋，上緊螺帽，關(guān)上氣閥和安全閥；
214)把熱壓鍋放在3000W電爐座上，然后接通電源；
215)在壓力計(jì)升至0. 5Kg時(shí)，打開(kāi)氣閥，排除冷空氣，反復(fù)兩次至完全把冷空氣排 除；
216)排除冷空氣后，關(guān)閉氣閥，待壓力升到IKg位置時(shí)，開(kāi)始計(jì)算滅菌時(shí)間，一般 在IKg壓力和121°C下滅菌20 25分鐘，此過(guò)程要保持穩(wěn)定壓力；
217)滅菌結(jié)束后，除去電源，打開(kāi)氣閥逐漸放氣，待熱壓鍋內(nèi)的空氣完全排除后， 打開(kāi)熱壓鍋蓋，稍待冷后再把初代培養(yǎng)基取出備用，如果培養(yǎng)基需要貯存較長(zhǎng)時(shí)間，需在 4°C低溫下保存。
所述步驟O)的外植體的接種具體包括
221)接種前半小時(shí)，先用75%酒精或新潔爾滅噴灑無(wú)菌室，地板用濕拖把拖刷， 超凈工作臺(tái)在接種前用95%酒精揩抹工作臺(tái)面和有關(guān)用具，打開(kāi)鼓風(fēng)機(jī)鼓風(fēng)，打開(kāi)紫外燈 進(jìn)行室內(nèi)消毒半小時(shí)以上；
222)工作人員需在準(zhǔn)備室內(nèi)改穿經(jīng)過(guò)滅菌的白色工作服及拖鞋，戴上白布帽和口 罩，才能進(jìn)入無(wú)菌室；
223)進(jìn)入無(wú)菌室前工作人員雙手須用肥皂洗凈，進(jìn)行操作前用75% C2H5OH擦抹雙 手；
224)接種時(shí)用酒精擦在初代培養(yǎng)基瓶的蓋子與瓶口接觸部位環(huán)繞一周，然后擰開(kāi) 蓋子，迅速將外植體放入，將蓋子放在酒精燈上烤烤，然后迅速旋緊蓋子，每接一瓶，用具都 應(yīng)用95 %或無(wú)水酒精棉球擦并在火焰上燒灼，或是放在高溫滅菌器內(nèi)消毒，避免交叉污染， 操作結(jié)束后整理并清潔好用具。
所述步驟(3)的增殖培養(yǎng)周期在30 60天之間；增殖培養(yǎng)代數(shù)控制在16 M代以內(nèi)，繁殖系數(shù)控制在2. 5 4. 0。
所述步驟(5)的生根培養(yǎng)周期為20 30天。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)在篩選優(yōu)良無(wú)性系并確定科學(xué)的誘導(dǎo)技術(shù)的理論基礎(chǔ)上， 對(duì)優(yōu)選出雷公藤種源，進(jìn)行初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、組培苗煉苗移栽等步 驟實(shí)現(xiàn)雷公藤優(yōu)良再生植株的培育，并建立雷公藤良種組培基地，為雷公藤的大量繁殖打 下基礎(chǔ)，為雷公藤產(chǎn)業(yè)化發(fā)展保證原料。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明所提供的一種雷公藤藥材苗木組培快繁的方法，包括
(1)制備外植體步驟在雷公藤植株上選擇幼嫩的芽、莖作為外植體，并進(jìn)行消毒 處理；消毒處理時(shí)具體包括下述步驟
11)將采回的雷公藤枝條自莖尖開(kāi)始按1.8 2. 2cm剪取芽條放在洗衣粉與 0. 的多菌靈溶液的混合液的流水中沖洗1. 5小時(shí)；
12)然后在無(wú)菌室內(nèi)，用70%的乙醇表面消毒30秒，再用無(wú)菌水沖洗三遍，然后用 0. 升汞溶液消毒5 15分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗六遍，保證無(wú)氯化汞殘留。
(2)初代培養(yǎng)步驟采用MS+0. 01mg/l基礎(chǔ)培養(yǎng)基為初代培養(yǎng)基，并進(jìn)行消毒處 理，在無(wú)菌條件下將外植體接種在消毒處理后的初代培養(yǎng)基上，并用瓶子封裝，并在光照為 14 16小時(shí)，溫度保持14 16度，瓶子外部濕度保持70%的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，直到誘導(dǎo) 出幼芽或叢生芽；
其中，初代培養(yǎng)基是采用熱壓滅菌方法進(jìn)行消毒處理，具體包括；
211)熱壓鍋放水至平把架；
212)把裝在瓶中的初代培養(yǎng)基放入熱壓鍋；
213)蓋上熱壓鍋蓋，上緊螺帽，關(guān)上氣閥和安全閥；
214)把熱壓鍋放在3000W電爐座上，然后接通電源；
215)在壓力計(jì)升至0. 5Kg時(shí)，打開(kāi)氣閥，排除冷空氣，反復(fù)兩次至完全把冷空氣排 除；
216)排除冷空氣后，關(guān)閉氣閥，待壓力升到IKg位置時(shí)，開(kāi)始計(jì)算滅菌時(shí)間，一般 在IKg壓力和121°C下滅菌20 25分鐘，此過(guò)程要保持穩(wěn)定壓力；
217)滅菌結(jié)束后，除去電源，打開(kāi)氣閥逐漸放氣，待熱壓鍋內(nèi)的空氣完全排除后， 打開(kāi)熱壓鍋蓋，稍待冷后再把初代培養(yǎng)基取出備用，如果培養(yǎng)基需要貯存較長(zhǎng)時(shí)間，需在 4°C低溫下保存。
其中，外植體的接種具體包括
221)接種前半小時(shí)，先用75%酒精或新潔爾滅噴灑無(wú)菌室，地板用濕拖把拖刷， 超凈工作臺(tái)在接種前用95%酒精揩抹工作臺(tái)面和有關(guān)用具，打開(kāi)鼓風(fēng)機(jī)鼓風(fēng)，打開(kāi)紫外燈 進(jìn)行室內(nèi)消毒半小時(shí)以上；
222)工作人員需在準(zhǔn)備室內(nèi)改穿經(jīng)過(guò)滅菌的白色工作服及拖鞋，戴上白布帽和口 罩，才能進(jìn)入無(wú)菌室；
223)進(jìn)入無(wú)菌室前工作人員雙手須用肥皂洗凈，進(jìn)行操作前用75% C2H5OH擦抹雙 手；
6[0049]224)接種時(shí)用酒精擦在初代培養(yǎng)基瓶的蓋子與瓶口接觸部位環(huán)繞一周，然后擰開(kāi) 蓋子，迅速將外植體放入，將蓋子放在酒精燈上烤烤，然后迅速旋緊蓋子，每接一瓶，用具都 應(yīng)用95 %或無(wú)水酒精棉球擦并在火焰上燒灼，或是放在高溫滅菌器內(nèi)消毒，避免交叉污染， 操作結(jié)束后整理并清潔好用具。
(3)增殖培養(yǎng)步驟將初代培養(yǎng)誘導(dǎo)形成的幼芽或叢生芽，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基 l/2ms+6-ba lmg/l+naaO. 2mg/l中進(jìn)行培養(yǎng)，并在光照為14 16小時(shí)，溫度保持14 16 度，瓶子外部濕度保持70%的條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)周期在30 60天之間；增 殖培養(yǎng)代數(shù)控制在16 M代以內(nèi)，繁殖系數(shù)控制在2. 5 4. 0。
(4)壯苗培養(yǎng)步驟將增殖的叢生芽接種到壯苗培養(yǎng)基l/2ms+naa0. lmg/1中，并 在光照為14 16小時(shí)，溫度保持14 16度，瓶子外部濕度保持70%的條件下進(jìn)行壯苗培 養(yǎng)，使幼苗株高生長(zhǎng)達(dá)2cm 5cm ；
(5)生根培養(yǎng)步驟從壯苗培養(yǎng)的幼苗中切取生長(zhǎng)健壯、葉色正常、葉片舒展、適 于生根的無(wú)根苗，接種在生根培養(yǎng)基l/ans+abt-l#0. 5mg/l+iba0. 2mg/l中并在光照為 14 16小時(shí)，溫度保持14 16度，瓶子外部濕度保持70%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，生根培養(yǎng) 周期為20 30天，直到幼苗基部長(zhǎng)出數(shù)根新根。
(6)組培苗煉苗移栽步驟組培苗煉苗3 7天后移入含蛭石、泥炭、珍珠巖等基 質(zhì)或混合基質(zhì)的穴盤(pán)中。
下面舉三個(gè)實(shí)施例按上述步驟進(jìn)行，具體步驟省略，該三個(gè)實(shí)施例具體參數(shù)如下 表表不
實(shí)施例一
培養(yǎng)數(shù)量100瓶；增殖培養(yǎng)周期在30天之間；增殖培養(yǎng)代數(shù)控制在16 M代以 內(nèi)，繁殖系數(shù)控制在2. 5 4. 0 ；生根培養(yǎng)周期為20天；組培苗煉苗3天后移入含蛭石、泥 炭、珍珠巖等基質(zhì)或混合基質(zhì)的穴盤(pán)中；
權(quán)利要求
1.一種雷公藤藥材苗木組培快繁的方法，其特征在于包括(1)制備外植體步驟在雷公藤植株上選擇幼嫩的芽、莖作為外植體，并進(jìn)行消毒處理；(2)初代培養(yǎng)步驟采用MS+0.01mg/l基礎(chǔ)培養(yǎng)基為初代培養(yǎng)基，并進(jìn)行消毒處理，在 無(wú)菌條件下將外植體接種在消毒處理后的初代培養(yǎng)基上，并用瓶子封裝，并每天光照14 16小時(shí)，溫度保持14 16度，瓶子外部濕度保持70%的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，直到誘導(dǎo)出幼芽 或叢生芽；(3)增殖培養(yǎng)步驟將初代培養(yǎng)誘導(dǎo)形成的幼芽或叢生芽，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基 l/2ms+6-ba lmg/l+naaO. 2mg/l中進(jìn)行培養(yǎng)，并每天光照14 16小時(shí)，溫度保持14 16 度，瓶子外部濕度保持70%的條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)；(4)壯苗培養(yǎng)步驟將增殖的叢生芽接種到壯苗培養(yǎng)基l/2ms+naa0.lmg/1中，并每天 光照14 16小時(shí)，溫度保持14 16度，瓶子外部濕度保持70%的條件下進(jìn)行壯苗培養(yǎng)， 使幼苗株高生長(zhǎng)達(dá)2cm 5cm ；(5)生根培養(yǎng)步驟從壯苗培養(yǎng)的幼苗中切取生長(zhǎng)健壯、葉色正常、葉片舒展、適于生 根的無(wú)根苗，接種在生根培養(yǎng)基l/ans+abt-l#0. 5mg/l+iba0. 2mg/l中并每天光照14 16 小時(shí)，溫度保持14 16度，瓶子外部濕度保持70%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，直到幼苗基部長(zhǎng)出 數(shù)根新根；(6)組培苗煉苗移栽步驟組培苗煉苗3 7天后移入含蛭石、泥炭、或珍珠巖的基質(zhì)， 或混合基質(zhì)的穴盤(pán)中。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的雷公藤藥材苗木組培快繁的方法，其特征在于所述步驟(1) 中，所述外植體的消毒處理具體包括下述步驟11)將采回的雷公藤枝條自莖尖開(kāi)始按1.8 2. 2cm剪取芽條放在洗衣粉與0. 的 多菌靈溶液的混合液的流水中沖洗1. 5小時(shí)；12)然后在無(wú)菌室內(nèi)，用70%的乙醇表面消毒30秒，再用無(wú)菌水沖洗三遍，然后用 0. 升汞溶液消毒5 15分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗六遍，保證無(wú)氯化汞殘留。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的雷公藤藥材苗木組培快繁的方法，其特征在于所述步驟(2) 中，所述初代培養(yǎng)基是采用熱壓滅菌方法進(jìn)行消毒處理，具體包括下述步驟；211)熱壓鍋放水至平把架；212)把裝在瓶中的初代培養(yǎng)基放入熱壓鍋；213)蓋上熱壓鍋蓋，上緊螺帽，關(guān)上氣閥和安全閥；214)把熱壓鍋放在3000W電爐座上，然后接通電源；215)在壓力計(jì)升至0.5Kg時(shí)，打開(kāi)氣閥，排除冷空氣，反復(fù)兩次至完全把冷空氣排除；216)排除冷空氣后，關(guān)閉氣閥，待壓力升到IKg位置時(shí)，開(kāi)始計(jì)算滅菌時(shí)間，一般在IKg 壓力和121°C下滅菌20 25分鐘，此過(guò)程要保持穩(wěn)定壓力；217)滅菌結(jié)束后，除去電源，打開(kāi)氣閥逐漸放氣，待熱壓鍋內(nèi)的空氣完全排除后，打開(kāi) 熱壓鍋蓋，稍待冷后再把初代培養(yǎng)基取出備用，如果培養(yǎng)基需要貯存較長(zhǎng)時(shí)間，需在4°C低 溫下保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的雷公藤藥材苗木組培快繁的方法，其特征在于所述步驟(2) 中，外植體的接種具體包括221)接種前半小時(shí)，先用75%酒精或新潔爾滅噴灑無(wú)菌室，地板用濕拖把拖刷，超凈 工作臺(tái)在接種前用95%酒精揩抹工作臺(tái)面和有關(guān)用具，打開(kāi)鼓風(fēng)機(jī)鼓風(fēng)，打開(kāi)紫外燈進(jìn)行 室內(nèi)消毒半小時(shí)以上；222)工作人員需在準(zhǔn)備室內(nèi)改穿經(jīng)過(guò)滅菌的白色工作服及拖鞋，戴上白布帽和口罩， 才能進(jìn)入無(wú)菌室；223)進(jìn)入無(wú)菌室前工作人員雙手須用肥皂洗凈，進(jìn)行操作前用75%C2H5OH擦抹雙手；224)接種時(shí)用酒精擦在初代培養(yǎng)基瓶的蓋子與瓶口接觸部位環(huán)繞一周，然后擰開(kāi)蓋 子，迅速將外植體放入，將蓋子放在酒精燈上烤烤，然后迅速旋緊蓋子，每接一瓶，用具都應(yīng) 用95 %或無(wú)水酒精棉球擦并在火焰上燒灼，或是放在高溫滅菌器內(nèi)消毒，避免交叉污染，操 作結(jié)束后整理并清潔好用具。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的雷公藤藥材苗木組培快繁的方法，其特征在于所述步驟(3) 中，增殖培養(yǎng)周期在30 60天之間；增殖培養(yǎng)代數(shù)控制在16 M代以內(nèi)，繁殖系數(shù)控制 在 2. 5 4. 0。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的雷公藤藥材苗木組培快繁的方法，其特征在于所述步驟(5) 中，生根培養(yǎng)周期為20 30天。
專利摘要
本發(fā)明提供一種雷公藤藥材苗木組培快繁的方法，包括制備外植體步驟、初代培養(yǎng)步驟、增殖培養(yǎng)步驟、壯苗培養(yǎng)步驟、生根培養(yǎng)步驟以及組培苗煉苗移栽步驟。本發(fā)明在篩選優(yōu)良無(wú)性系并確定科學(xué)的誘導(dǎo)技術(shù)的理論基礎(chǔ)上，對(duì)優(yōu)選出雷公藤種源，應(yīng)用無(wú)性系變異、誘變、染色體加倍、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、子代馴化篩選等手段，實(shí)現(xiàn)雷公藤優(yōu)良再生植株的培育，并建立雷公藤良種組培基地。
文檔編號(hào)A01H4/00GKCN102090334SQ201010567327
公開(kāi)日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2010年12月1日
發(fā)明者魏佰興 申請(qǐng)人:福建省漢堂生物制藥股份有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan