專利名稱:一種開放式植物組織培養(yǎng)育苗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)林領(lǐng)域的植物組織培養(yǎng)育苗技術(shù)，具體涉及一種開放式植物組織培養(yǎng)工廠化育苗方法。即在培養(yǎng)基中添加采用植物提取物配制而成的抑菌劑的條件下，使植物組織培養(yǎng)育苗過程脫離嚴(yán)格無菌的操作環(huán)境，尤其是不需要高壓滅菌，可在開放的帶菌環(huán)境中進(jìn)行植物組織培養(yǎng)育苗，從根本上簡化了植物組織培養(yǎng)育苗環(huán)節(jié)，提高了育苗工作效率，大大降低了植物組織培養(yǎng)育苗成本。
背景技術(shù)：
植物組織培養(yǎng)是本世紀(jì)初開始，以植物生理學(xué)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一項(xiàng)植物繁殖技術(shù)。植物組織培養(yǎng)又稱植物克隆，指通過無菌操作把植物的任何器官、組織或細(xì)胞接種于人工配制的含有營養(yǎng)物質(zhì)和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等組成的培養(yǎng)基上，在人工控制環(huán)境下進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其生長、分化形成完整植株的過程。植物組織培養(yǎng)為植物的快速繁殖提供了新的手段，接種的一個(gè)小外植體，可以被誘導(dǎo)形成愈傷組織并再生芽和根，繼代多次后，即可建立無性繁殖系，大量生產(chǎn)試管苗。建立植物試管苗繁育體系，有著非常重要的意義，其一， 快速繁殖不受季節(jié)限制，可在短期內(nèi)獲得大量個(gè)體；其二，選擇優(yōu)良單株擴(kuò)繁，可保證品種的純合性，可對高產(chǎn)、高抗、優(yōu)質(zhì)新品種進(jìn)行快速推廣；其三，通過脫毒離體培養(yǎng)，可以培育出不帶任何病原物和病毒的試管苗，減少病害的發(fā)生。因此，利用植物組織培養(yǎng)快繁技術(shù)， 在提高繁殖系數(shù)、有效防止種性退化和生產(chǎn)高質(zhì)量的種苗中起到了決定性作用。經(jīng)過近一個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，植物組織培養(yǎng)技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢，作為現(xiàn)代生物技術(shù)的一個(gè)重要手段現(xiàn)已在工廠化育苗、種苗脫毒復(fù)壯、遺傳育種、種質(zhì)資源的保存與交換等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。目前，已在多種經(jīng)濟(jì)植物中建立了相應(yīng)的良種快速繁育體系。
發(fā)展至今，植物組織培養(yǎng)的理論研究已經(jīng)相當(dāng)精深，但它的技術(shù)環(huán)節(jié)還存在不少問題。目前廣泛使用的植物組織培養(yǎng)育苗是在密閉、無菌環(huán)境下進(jìn)行，包括接種外植體、誘導(dǎo)愈傷組織、愈傷組織分化形成試管苗、試管苗的移栽等幾個(gè)步驟。這種組織培養(yǎng)方式存在四個(gè)缺陷培養(yǎng)基污染難以解決、試管苗成本過高、規(guī)?；a(chǎn)技術(shù)不成熟和試管生產(chǎn)技術(shù)繁瑣。
由于富含營養(yǎng)的培養(yǎng)基既適合植物組織生長發(fā)育，更適合雜菌的滋生。因此，不論是在植物組織培養(yǎng)的試驗(yàn)研究中還是在工廠化生產(chǎn)中，污染是普遍存在的問題，它嚴(yán)重地影響了植物苗木的規(guī)?；a(chǎn)、植物試管基因庫的構(gòu)建、生產(chǎn)成本和寶貴材料保全等方面。 因此，控制污染成了組織培養(yǎng)中的首要技術(shù)。而影響污染的因素多種多樣，如外植體的種類、取材的時(shí)間、預(yù)處理方法、消毒劑的種類、消毒方法、培養(yǎng)基和器皿滅茵、操作人員和工作環(huán)境的要求等都與污染密切相關(guān)，因此，使得污染問題難以防治，成為限制組織培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化的重要原因之一。
此外，傳統(tǒng)的植物組織培養(yǎng)方式均是在嚴(yán)格無菌的封閉條件下進(jìn)行的，無菌操作是常規(guī)植物組織培養(yǎng)的一項(xiàng)嚴(yán)格要求，如要對培養(yǎng)基、培養(yǎng)器皿高溫滅菌，任何用于操作和處理植物組織的器皿都要消毒，其操作過程都必須在無菌環(huán)境如超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行。如果能夠建立起不滅菌的組織培養(yǎng)技術(shù)，還能夠?qū)⑽廴韭式档偷娇山邮芊秶鷥?nèi)，組織培養(yǎng)技術(shù)將得到巨大的飛躍。因此，尋找一種無需滅菌程序的開放式組織培養(yǎng)技術(shù)非常重要。植物開放式組織培養(yǎng)，即在抑菌劑的作用下，使植物組織培養(yǎng)脫離嚴(yán)格無菌的操作環(huán)境，不需高壓滅菌和超凈工作臺，在開放的有菌環(huán)境中進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，從根本上簡化組織培養(yǎng)環(huán)節(jié)， 降低成本。
眾所周知，傳統(tǒng)組織培養(yǎng)過程中的污染，主要表現(xiàn)為培養(yǎng)基的污染，營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基為細(xì)菌、真菌提供了適宜的滋生場所。因此，只要將培養(yǎng)基改造成既可保證植物組織正常生長，又具有抑菌功能的培養(yǎng)基，菌類一旦失去滋生場所，就不會對組織培養(yǎng)過程產(chǎn)生危害。改造培養(yǎng)基的關(guān)鍵在于找到一種能夠添加到培養(yǎng)基的廣譜抑菌劑。目前，廣譜抑菌劑的篩選一直是困擾植物組織培養(yǎng)專家的難題，有學(xué)者對抑菌劑及組織培養(yǎng)關(guān)系進(jìn)行過研究。 單文修等采用在培養(yǎng)基中添加大量化學(xué)殺菌消毒劑苯甲酸類、山梨酸類、酚類、含氯化合物類、季胺鹽類、脲類、胍類或天然消毒抑菌劑，建立了一種非無菌條件下的植物組織培養(yǎng)方法(申請?zhí)?004100M035. 5公開號CN1^8507A)。他們對常用抗生素、抗菌素、防腐劑做了大量單一或組合添加到培養(yǎng)基中的試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)證明，常用抗生素、抗菌素、防腐劑對植物組織培養(yǎng)中的污染具有的一定的防治作用，但是針對不同的植物品種要想找到一種合適的處理組合是比較困難的，往往當(dāng)培養(yǎng)基抗菌時(shí)，植物組織的生長也受到抑制；而植物組織能正常生長時(shí)，卻無法獲得滿意的抗菌效果。這也是國內(nèi)外專家學(xué)者普遍遇到的障礙。其原因之一是還沒有一種抗生素對所有的細(xì)菌都有效，而且藥效期短；二是有些抗菌素、防腐劑在有效濃度下，其殺菌、抗菌離子對植物組織直接產(chǎn)生傷害。
為此，我們從多種植物中提取具有抑菌活性物質(zhì)，建立了具有良好抑菌效果的植物提取物資源庫，研制了適合于開放式組織培養(yǎng)的抑菌劑，使植物組織培養(yǎng)育苗過程可在開放的帶菌環(huán)境中進(jìn)行，從根本上簡化了育苗環(huán)節(jié)，提高了工作效率，大大降低了植物組織培養(yǎng)育苗成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立一種低成本、高效益的開放式植物組織培養(yǎng)育苗方法，在添加植物提取物配制而成的抑菌劑的條件下，使植物組織培養(yǎng)育苗過程脫離嚴(yán)格無菌的操作環(huán)境，尤其是不需要高壓滅菌，可在開放的帶菌環(huán)境中進(jìn)行植物組織培養(yǎng)育苗，簡化了植物組織培養(yǎng)育苗環(huán)節(jié)，提高了工作效率，降低了植物組織培養(yǎng)育苗成本。
本發(fā)明提供的開放式植物組織培養(yǎng)育苗方法，其特征在于，該方法在有菌的室溫自然環(huán)境條件下進(jìn)行在培養(yǎng)基中添加植物提取物抑菌劑，以IL培養(yǎng)基計(jì)算，植物提取物抑菌劑的添加量為4 15g，制備抑菌培養(yǎng)基，再利用該抑菌培養(yǎng)基進(jìn)行接種培養(yǎng)。
上述植物提取物抑菌劑可以采用下述兩類，其一包括大蒜提取物、黃連提取物和忍冬葉提取物，其質(zhì)量百分比為20 100% 0 40% 0 50%;其二包括甘草根提取物、桂花提取物和石蒜提取物，其質(zhì)量比為10 100% 0 80% 0 50%。
使用本發(fā)明所提供的抑菌培養(yǎng)基，可用于植物的種子、根、莖、葉和愈傷組織等接種和培養(yǎng)，以及試管苗的移栽，可以有效地減少植物組織培養(yǎng)過程中微生物的污染，保證植物組織、器官、細(xì)胞和試管苗的正常發(fā)育生長。
本發(fā)明所述的接種是指在有菌的自然環(huán)境條件下，將上述植物組織或試管苗接種在抑菌培養(yǎng)基中，除了無需進(jìn)行無菌處理程序外，具體接種操作手續(xù)與常規(guī)組織培養(yǎng)的接種手續(xù)相同。
由于使用了抑菌培養(yǎng)基，因而本發(fā)明所述的開放式植物組織培養(yǎng)方法中的接種及培養(yǎng)過程無需再進(jìn)行嚴(yán)格的無菌處理(無需高壓滅菌、無菌接種和無菌培養(yǎng))，改變了常規(guī)植物組織培養(yǎng)全過程中必須進(jìn)行無菌處理的傳統(tǒng)觀念，可以省略了高壓滅菌鍋、超凈工作臺、紫外燈等設(shè)備及嚴(yán)格無菌的環(huán)境設(shè)施，并可以將易損的玻璃器皿更換為價(jià)格低廉、操作簡便的塑料杯，省略了繁瑣的消毒手續(xù)，大大降低了生產(chǎn)成本。
本發(fā)明與傳統(tǒng)無菌組織培養(yǎng)相比，具有簡化環(huán)節(jié)，節(jié)省成本等特點(diǎn)，具體如下
1.培養(yǎng)容器的選擇在傳統(tǒng)組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)容器需選擇耐高溫高壓的玻璃瓶和聚丙烯封口膜。而在開放式組織培養(yǎng)中，在培養(yǎng)基中添加抑菌劑，讓抑菌培養(yǎng)基代替高壓滅菌，并可用廉價(jià)的一次性塑料杯作為培養(yǎng)容器，用保鮮膜封口，這大大降低了成本。
2.接種器具的滅菌傳統(tǒng)組織培養(yǎng)中，接種用的剪子、鑷子、刀片等均采用高壓滅菌或酒精燈灼燒滅菌，而在開放組織培養(yǎng)中，接種器具用75%酒精擦洗后，即可有效的防止由于接種器具引發(fā)的污染。
3.接種方法在接種室內(nèi)，用75%的酒精將接種臺面和手擦干凈，揭開封口膜一角，用接種器具把植物接種到培養(yǎng)基上，再將杯口封嚴(yán)即可。
4.技術(shù)環(huán)節(jié)與成本分析開放式組織培養(yǎng)省去了高壓滅菌和超凈工作臺接種，簡化了組織培養(yǎng)環(huán)節(jié)。由于制備抑菌劑的材料資源豐富，生產(chǎn)工藝簡單，消毒液也能重復(fù)利用，因此開放式組織培養(yǎng)與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)相比，大大節(jié)省成本。
具體實(shí)施方式
下面通過借助以下實(shí)施例將更加詳細(xì)說明本發(fā)明，且以下實(shí)施例僅是說明性的， 本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。
開放式植物組織培養(yǎng)育苗可以按照以下步驟進(jìn)行
(1)抑菌培養(yǎng)基的配制
植物組織培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基種類很多，如MS、N6、White等，本專利中植物組織培養(yǎng)以MS培養(yǎng)基為例進(jìn)行說明。配制IL MS培養(yǎng)基，然后按照每升培養(yǎng)基添加4 15g抑菌劑標(biāo)準(zhǔn)，將抑菌劑添加至基本培養(yǎng)基中，用0. lmol/L NaOH或0. lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH至 6. 0，配制成抑菌培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基中加入瓊脂)。采用透明的塑料杯分裝，將分裝好培養(yǎng)基的容器蓋上棉塞或用保鮮膜封口，培養(yǎng)基冷卻后即可接種。
(2)接種
接種過程在開放環(huán)境中進(jìn)行。除了培養(yǎng)基不需滅菌、不需嚴(yán)格無菌的接種環(huán)境外，其它接種步驟與傳統(tǒng)的接種程序一樣，即先用消毒劑對外植體進(jìn)行消毒，獲得無菌外
植體，然后在接種臺面上，將消毒后的外植體接種至添加有抑菌劑的培養(yǎng)基中，用保鮮膜封□。
(3)初代培養(yǎng)
將接種材料置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)(培種室無需滅菌消毒)，以獲得愈傷組織，一個(gè)周期后，按照上述操作進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
(4)愈傷組織的分化[0028]將愈傷組織接種于抑菌分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，生根長芽，形成試管苗。
(5)試管苗的移栽
因?yàn)樵嚬苊绲恼麄€(gè)培養(yǎng)過程為開放式培養(yǎng)，因此試管苗的移栽不需要煉苗。將試管苗取出后，用清水將其根部沖洗干凈，再用抑菌劑浸泡試管苗根部，30分鐘后用清水沖洗干凈后移栽。
實(shí)施例一魔芋開放式組織培養(yǎng)
魔芋開放式組織培養(yǎng)按照以下步驟進(jìn)行
(1)抑菌劑的制備
①大蒜提取物的制備
剝皮后的新鮮白皮大蒜1kg，洗凈后加入水300ml，用打漿機(jī)攪打20分鐘得到蒜泥，倒入密封罐中，滴加0. 02mol/L的鹽酸并不斷攪拌至蒜泥pH = 6，在溫度40°C下密封靜置，讓蒜泥中的內(nèi)源蒜酶解蒜氨酸4小時(shí)以產(chǎn)生大蒜素。酶解完成后，將蒜漿轉(zhuǎn)移到攪拌罐中，加入4L 95 %食用乙醇，充分?jǐn)嚢韬螅蹇蜻^濾得到大蒜素提取液，轉(zhuǎn)移到真空減壓濃縮罐中，60°C下減壓蒸餾至干，得到黃色大蒜提取物，經(jīng)高效液相色譜法檢測大蒜素含量等于 6. 98%。
②黃連提取物的制備
稱取干燥的黃連根莖1kg，粉碎機(jī)粉碎后過80目篩網(wǎng)，黃連粉末置于提取罐中加入3L 95%工業(yè)乙醇，95°C浸提5小時(shí)，通過板框過濾得到黃連提取液，轉(zhuǎn)移到真空減壓濃縮罐中，55°C下減壓蒸餾至干，得到黃連提取物，經(jīng)高效液相色譜法檢測黃連素含量等于 20%。
③忍冬葉提取物的制備
稱取干燥的忍冬葉1kg，粉碎機(jī)粉碎后過60目篩網(wǎng)，忍冬葉粉末置于提取罐中加入2L 80%工業(yè)乙醇，調(diào)節(jié)pH值5. 0，95°C浸提3小時(shí)，通過板框過濾得到忍冬葉提取液，轉(zhuǎn)移到真空減壓濃縮罐中，減壓蒸餾至干，得到忍冬葉提取物。經(jīng)高效液相色譜法檢測綠原酸含量等于10%。
將三種提取物按照附表1所述的5種比例分別混合，制備成5種抑菌劑。
(2)抑菌培養(yǎng)基的配制
配制5份IL MS培養(yǎng)基，于其中加入瓊脂，完全溶解后，添加激素6-BA 2mg/ L+NAA 0. lmg/L+IBA 0. ang/L，然后分別加入(1)中所述的5種抑菌劑，添加量為10g/L，配制成5種固體抑菌培養(yǎng)基。采用透明的塑料杯分裝，將分裝好培養(yǎng)基的容器用保鮮膜封口， 培養(yǎng)基冷卻后即可接種。
(3)接種魔芋球莖
接種經(jīng)常規(guī)消毒后的魔芋球莖，進(jìn)行培養(yǎng)。對照1為O)中所述的不添加抑菌劑的固體培養(yǎng)基；對照2為(2)中所述的不添加抑菌劑的固體培養(yǎng)基，而且培養(yǎng)基需要滅菌。 每組接種20瓶，每瓶接種5塊外植體，共100塊外植體。抑菌培養(yǎng)基對魔芋愈傷組織誘導(dǎo)及芽形成的影響見附表1。
實(shí)施例二開放式條件下光果甘草、脹果甘草和烏拉爾甘草種子萌發(fā)
開放式條件下光果甘草、脹果甘草和烏拉爾甘草種子萌發(fā)按照以下步驟進(jìn)行
(1)抑菌劑的制備[0048]按照實(shí)施例一中所述的制備方法制備大蒜提取物、黃連提取物和忍冬葉提取物， 并將三種提取物按照附表2所述的5種比例分別混合，制備成5種抑菌劑。
(2)抑菌培養(yǎng)基的配制
配制5份IL MS培養(yǎng)基，于其中加入瓊脂，即為種子萌發(fā)培養(yǎng)基。分別加入(1) 中所述的5種抑菌劑，添加量為4g/L，配制成5種固體抑菌培養(yǎng)基。采用透明的塑料杯分裝，將分裝好培養(yǎng)基的容器用保鮮膜封口，培養(yǎng)基冷卻后即可接種。
(3)甘草種子接種
用濃硫酸分別浸泡光果甘草、脹果甘草和烏拉爾甘草種子Ih后，用清水沖洗干凈，經(jīng)常規(guī)消毒后，分別接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種10粒種子，共200粒種子。對照1為( 中所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基不添加抑菌劑；對照 2為(2)中所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基不添加抑菌劑，但培養(yǎng)基需要滅菌。抑菌培養(yǎng)基對三種甘草種子萌發(fā)的影響見附表2。
實(shí)施例三甘草開放式組織培養(yǎng)育苗
甘草開放式組織培養(yǎng)育苗按照以下步驟進(jìn)行
(1)抑菌劑的制備
①甘草根提取物的制備
準(zhǔn)確稱取干燥的甘草根莖1kg，粉碎機(jī)粉碎后過80目篩網(wǎng)，甘草粉末置于提取罐中加入3L 50 %工業(yè)乙醇，超聲提取1小時(shí)，通過板框過濾得到甘草黃酮提取液，轉(zhuǎn)移到真空減壓濃縮罐中，55°C下減壓蒸餾至干，得到甘草根提取物，其中甘草黃酮的純度等于 70%。
②桂花提取物的制備
準(zhǔn)確稱取干燥的桂花1kg，加入500ml 90%乙醇，解吸15分鐘。再加入4L 80%的乙醇回流提取15分鐘，提取2次，過濾，濾液轉(zhuǎn)移到真空減壓濃縮罐中，55°C下減壓蒸餾至干，得到桂花提取物，其中桂花黃酮的純度等于40%。
③石蒜提取物的制備
準(zhǔn)確稱取干燥的石蒜1kg，粉碎機(jī)粉碎后過80目篩網(wǎng)，石蒜粉末置于提取罐中加入IOL甲醇，75°C回流提取3小時(shí)，通過板框過濾得到石蒜提取液，轉(zhuǎn)移到真空減壓濃縮罐中，55°C下減壓蒸餾至干，得到石蒜提取物，經(jīng)高效液相色譜法檢測石蒜生物堿的純度等于
2 % ο
將三種提取物按照附表3所述的5種比例分別混合，制備成5種抑菌劑。
(2)抑菌培養(yǎng)基的配制
配制5份1 L MS培養(yǎng)基，于其中加入瓊脂，完全溶解后，添加激素6-BA 2mg/ L+KT 0. 5mg/L+IBA 0. 5mg/L后，然后分別加入(1)中所述的5種抑菌劑，添加量為4g/L，配制成5種抑菌培養(yǎng)基。采用透明的塑料杯分裝，將分裝好培養(yǎng)基的容器蓋上棉塞，培養(yǎng)基冷卻后即可接種。
(3)接種脹果甘草下胚軸
接種經(jīng)常規(guī)消毒后的脹果甘草、光果甘草下胚軸，進(jìn)行培養(yǎng)。對照1為O)中所述的不添加抑菌劑的固體培養(yǎng)基；對照2為( 中所述的不添加抑菌劑的固體培養(yǎng)基，而且培養(yǎng)基需要滅菌。每組接種20瓶，每瓶接種6個(gè)莖段，共120個(gè)莖段。抑菌培養(yǎng)基對脹果甘草、光果甘草愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率的影響見附表3。
實(shí)施例四開放式條件下刺山柑種子萌發(fā)及誘導(dǎo)下胚軸分化
開放式條件下刺山柑種子萌發(fā)及誘導(dǎo)下胚軸分化按照以下步驟進(jìn)行
(1)抑菌劑的制備
按照實(shí)施例一中所述的制備方法制備大蒜提取物、黃連提取物和忍冬葉提取物， 并將三種提取物按照附表4所述的5種比例分別混合，制備成5種抑菌劑。
(2)抑菌培養(yǎng)基的配制
配制MS培養(yǎng)基，于其中加入瓊脂，完全溶解后，添加激素。種子萌發(fā)培養(yǎng)基中添加激素為6-BA 1. Omg/L,誘導(dǎo)下胚軸分化培養(yǎng)基中添加激素為6-BA 0. lmg/L+NAA 0.01mg/L。分別加入(1)中所述的5種抑菌劑，添加量為15g/L，配制成抑菌培養(yǎng)基。采用透明的塑料杯分裝，將分裝好培養(yǎng)基的容器用保鮮膜封口，培養(yǎng)基冷卻后即可接種。
(3)刺山柑種子接種
用濃硫酸浸泡刺山柑種子Ih后，用清水沖洗干凈，經(jīng)常規(guī)消毒后，接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種15粒種子，共150粒種子。當(dāng)種子萌發(fā)后，切取下胚軸，置于分化培養(yǎng)基中，每組接種20瓶，每瓶接種6個(gè)莖段，共120個(gè)莖段。對照1為 (2)中所述的不添加抑菌劑的培養(yǎng)基；對照2為( 中所述的不添加抑菌劑的培養(yǎng)基，但是培養(yǎng)基需要滅菌。抑菌培養(yǎng)基對刺山柑種子萌發(fā)和下胚軸分化的影響見附表4。
實(shí)施例五開放式條件下魔芋試管苗的形成和移栽
開放式條件下魔芋試管苗的形成和移栽按照以下步驟進(jìn)行
(1)抑菌劑的制備
按照實(shí)施例三中所述的制備方法制備甘草根提取物、桂花提取物和石蒜提取物， 并將三種提取物按照附表5所述的5種比例分別混合，制備成5種抑菌劑。
(2)抑菌培養(yǎng)基的配制
配制IL MS培養(yǎng)基，于其中加入瓊脂，完全溶解后，添加激素6-BA1.5mg/ L+NAA 0.3mg/L后，分別加入(1)中所述的5種抑菌劑，添加量為15g/L，配制成抑菌培養(yǎng)基。采用透明的塑料杯分裝，將分裝好培養(yǎng)基的容器用保鮮膜封口，培養(yǎng)基冷卻后即可接種。
(3)接種魔芋不定芽
接種經(jīng)常規(guī)消毒后的魔芋不定芽，進(jìn)行培養(yǎng)，使之分化形成試管苗。對照1為(2) 中所述的不添加抑菌劑的培養(yǎng)基；對照2為( 中所述的不添加抑菌劑的培養(yǎng)基，而且培養(yǎng)基需要滅菌，每組接種20瓶，每瓶接種5個(gè)不定芽，共100個(gè)不定芽。
(4)液體抑菌劑的制備
分別取(1)中所述的5種抑菌劑，每種稱取5g溶于IL水中，攪拌均勻后制得5種液體抑菌劑，分別用于試管苗根部的浸泡。
(5)試管苗的移栽
待不定芽形成粗壯的試管苗后，將試管苗取出，用清水將其根部沖洗干凈，再將其根部分別置于(4)中制備的5種液體抑菌劑中，浸泡30分鐘后，用清水沖洗干凈，移栽。抑菌培養(yǎng)基對魔芋試管苗的形成和移栽的影響見附表5。
實(shí)施例六開放式條件下紅豆杉外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織[0088]開放式條件下紅豆杉外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織按照以下步驟進(jìn)行
(1)抑菌劑的制備
按照實(shí)施例三中所述的制備方法制備甘草根提取物、桂花提取物和石蒜提取物， 并將三種提取物按照附表6所述的5種比例分別混合，制備成5種抑菌劑。
(2)抑菌培養(yǎng)基的配制
配制5份IL MS培養(yǎng)基，于其中加入1 %瓊脂，完全溶解后，添加激素二氯苯氧乙酸O.aiig/L和α-萘乙酸0.5mg/L，然后分別加入(1)中所述的5種抑菌劑，添加量為Sg/ L，配制成5種抑菌培養(yǎng)基。采用透明的塑料杯分裝，將分裝好培養(yǎng)基的容器蓋上棉塞，培養(yǎng)基冷卻后即可接種。
(3)接種紅豆杉外植體
接種經(jīng)常規(guī)消毒后的中國紅豆杉、東北紅豆杉和曼地亞紅豆杉嫩莖，進(jìn)行培養(yǎng)。對照1為O)中所述的不添加抑菌劑的固體培養(yǎng)基；對照2為( 中所述的不添加抑菌劑的固體培養(yǎng)基，而且培養(yǎng)基需要滅菌。每組接種20瓶，每瓶接種6個(gè)莖段，共120個(gè)莖段。抑菌培養(yǎng)基對中國紅豆杉、東北紅豆杉和曼地亞紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)率的影響見附表6。
附表1開放式條件下魔芋愈傷組織誘導(dǎo)和芽的形成
權(quán)利要求
1.一種開放式植物組織培養(yǎng)育苗方法，其特征在于，該方法在有菌的室溫自然環(huán)境條件下進(jìn)行在培養(yǎng)基中添加植物提取物抑菌劑，以1 L培養(yǎng)基計(jì)算，植物提取物抑菌劑的添加量為4 15 g，制備抑菌培養(yǎng)基，再利用該抑菌培養(yǎng)基進(jìn)行接種培養(yǎng)；所述植物提取物抑菌劑的第一種配方包括大蒜提取物、黃連提取物和忍冬葉提取物， 其質(zhì)量百分比為20 100% 0 40% 0 50% ；所述植物提取物抑菌劑的第二種配方包括甘草根提取物、桂花提取物和石蒜提取物， 其質(zhì)量百分比為10 100% 0 80% 0 50%。
2.如權(quán)利要求
1所述的開放式植物組織培養(yǎng)育苗方法，其特征在于，在所述植物提取物抑菌劑的第一種配方中，大蒜提取物中的大蒜素的重量百分比大于或等于6. 0%，黃連提取物中黃連素的重量百分比大于或等于20. 0%，忍冬葉提取物中綠原酸的重量百分比大于或等于10. 0%。
3.如權(quán)利要求
1所述的開放式植物組織培養(yǎng)育苗方法，其特征在于，在所述植物提取物抑菌劑的第二種配方中，甘草根提取物中的甘草黃酮純度大于或等于70%，桂花提取物中的桂花黃酮純度大于或等于40%，石蒜提取物中的石蒜生物堿純度大于或等于m。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種開放式植物組織培養(yǎng)育苗方法，屬于農(nóng)林領(lǐng)域的植物組織培養(yǎng)育苗技術(shù)。該方法在有菌的室溫自然環(huán)境條件下進(jìn)行在培養(yǎng)基中添加植物提取物抑菌劑，以1L培養(yǎng)基計(jì)算，抑菌劑的添加量為4～15g，制備抑菌培養(yǎng)基，再利用該抑菌培養(yǎng)基進(jìn)行接種培養(yǎng)。抑菌劑有兩類，其一包括大蒜提取物、黃連提取物和忍冬葉提取物，其質(zhì)量百分比為20～100％∶0～40％∶0～50％；其二包括甘草根提取物、桂花提取物和石蒜提取物，其質(zhì)量比為10～100％∶0～80％∶0～50％。本發(fā)明方法可使植物組織培養(yǎng)育苗過程脫離嚴(yán)格無菌的操作環(huán)境，在開放的有菌環(huán)境中進(jìn)行植物組織培養(yǎng)育苗，這從根本上簡化了植物組織培養(yǎng)育苗環(huán)節(jié)，提高了工作效率，大大降低了育苗成本。
文檔編號A01H4/00GKCN101455180 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200910060484
公開日2012年1月25日 申請日期2009年1月9日
發(fā)明者何峰, 余龍江, 季家興, 楊英, 金文聞 申請人:華中科技大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非專利引用 (4),