專利名稱:液體發(fā)酵法制作防治植物病蟲害的真菌復合肥及其生產(chǎn)工藝的制作方法
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術領域：
。具體是指將有益真菌哈茨木霉或綠色木霉放入含有液態(tài)復合肥培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中進行深層發(fā)酵，以獲取大量的厚垣孢子。再通過濃縮、混合干制等制作工藝，生產(chǎn)出既具防治植物病、蟲害，又促進植物生長等多功能的環(huán)保型復合菌肥。
山東省濟南科貝爾生物工程有限公司王立民等人于1996年11月共同申請了“液體發(fā)酵法制備防治植物病毒的農(nóng)藥及其生產(chǎn)工藝”的發(fā)明專利(專利公開號CN 1136393A)。其生產(chǎn)工藝是通過液體深層發(fā)酵將真菌群體量增大。此發(fā)明對真菌的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有相對的穩(wěn)定性和可行性。但是此發(fā)明并未說明最終產(chǎn)品中活性真菌的菌株形態(tài)以及活性真菌的有效存活期。此外，此農(nóng)藥對植物病毒病的抑制與防治見效較慢，且功能單一。又如由浙江省王井寶等人于2001年2月共同申請的“速效抗病真菌有機肥料及其生產(chǎn)方法”的發(fā)明專利(專利公開號CN1283599A)。該項發(fā)明對土壤改良以及植物土傳病害具有一定的功能。但是該產(chǎn)品的制作工藝煩瑣，且在產(chǎn)品生產(chǎn)過程中產(chǎn)品的質量很難得以保證。
本發(fā)明為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了作物所需的復合肥料，能顯著地促進各類植物的生長，從而起到了保質增產(chǎn)的作用。該復合菌肥不僅能在多種植物，不同的生長期使用，而且施用的方法簡易，可通過裹種、混種、混土、浸根等方法施入土壤中，同時也能對植物的地上部分進行噴施。
本發(fā)明的另一個特點是含有兩種活性有益真菌。哈茨木霉Trichoderma harzianum在中國微生物菌種保藏管理委員會保藏，保藏菌號為CGMMCC N0.0730；綠色木霉Trichoderma viride在中國微生物菌種保藏管理委員會保藏，保藏菌號為CGMMCC N0.0731。有益真菌在產(chǎn)品中的形態(tài)為厚垣孢子，即真菌的休眠孢子。休眠孢子能在惡劣的環(huán)境條件下存活一年半以上，當遇到合適的環(huán)境條件如水、溫度等，就能萌發(fā)生長。本發(fā)明的突破點在于解決了現(xiàn)有發(fā)酵技術中存在的問題，即如何將真菌的菌絲體或分生孢子在液體發(fā)酵過程中轉化為厚垣孢子。厚垣孢子作為本發(fā)明中活性真菌的形態(tài)，能大大的延長產(chǎn)品的保存貨架期。此外，本發(fā)明中的兩種有益真菌均屬植物根際土壤寄生微生物。它們能通過寄生和占位起到抑制或殺死多種植物病原菌、保護各類作物正常生長的作用，同時能有效改善土壤的生態(tài)平衡，提高作物對土壤中有效養(yǎng)分的吸收。
本發(fā)明的另一個特點是產(chǎn)品中的填充物是一種天然的具有一定抑制或殺死植物有害昆蟲的礦物土粉末。從而使本產(chǎn)品除了具有防治植物病害、促進生長等功能外，還具有防治植物有害昆蟲的作用。
本發(fā)明屬于純正的綠色產(chǎn)品。長久以來，無機化學或有機磷農(nóng)藥以及無機化肥被大量用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，對人類賴以生存的水、土壤和空氣造成了極大的，甚至是毀滅性的污染。然而，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用本發(fā)明所生產(chǎn)的產(chǎn)品能夠減少或取代以上所述的對環(huán)境造成污染的各類農(nóng)用產(chǎn)品，從而起到了保護、綠化環(huán)境的作用。
本發(fā)明的目的在于公開一種液體發(fā)酵法生產(chǎn)含有厚垣孢子的復合菌肥。具體生產(chǎn)工藝如下1.一種液體發(fā)酵法制備真菌厚垣孢子復合肥的工藝。
(1)培養(yǎng)皿菌種制備將哈茨木霉和綠色木霉的純菌株在無菌操作條件下分別接種在固體土豆汁培養(yǎng)基的平面上，然后將培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中，在25～28℃條件下培養(yǎng)3～5天。哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，菌種編號CGMCC NO.0730。和綠色木霉(Trichodermaviride)菌種編號CGMCC N0.0731。固體土豆汁培養(yǎng)基配方如下土豆汁 20％蔗糖 0.2％瓊脂 1.5％PH值 自然
(2)搖瓶菌種制備根據(jù)權利要求
(1)所述將培養(yǎng)皿制備的菌種在無菌操作條件下轉移到裝有1L真菌培養(yǎng)液的2L搖瓶中。將搖瓶放在搖床上，在23～27℃，轉速180rpm的條件下培養(yǎng)4～5天。培養(yǎng)結束后可獲得厚垣孢子液，厚垣孢子數(shù)為5×108～3×109/ml。真菌培養(yǎng)液的配方為玉米淀粉(北京淀粉廠) 2.5％/L干酵母(北京燕京啤酒廠) 0.25％/L液態(tài)復合肥(美國Actagro LLC.) 3％/L添加劑(美國Ag Biosience Corp) 0.1％/L(3)一級種子制備根據(jù)權利要求
(2)所述配制相同的真菌培養(yǎng)液。將9立升的培養(yǎng)液放入16立升的一級種子發(fā)酵罐中，并加適量消泡劑(旅順化工廠)然后進行高溫(121℃)高壓(15磅)蒸汽滅菌，滅菌時間為1小時。間隔24小時后再以同樣的條件滅菌一次，待培養(yǎng)液冷卻后將發(fā)酵罐的罐壓調整為0，同時將無菌空氣(0.2～0.4磅)通入權利要求
(2)中所述的真菌培養(yǎng)搖瓶中，將1L厚垣孢子液轉入到一級種子發(fā)酵罐中。在25～28℃，罐壓為0.4～0.6Kg，空氣量為1～1.2∶0.5～0.7/m3，轉速為190～210rpm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)3～4天。培養(yǎng)結束后可獲得厚垣孢子液，厚垣孢子數(shù)為2×108～8×108/ml。
(4)二級種子制備根據(jù)權利要求
(3)中所述配制相同的23真菌培養(yǎng)液。將120L～150L的培養(yǎng)液放入250L的發(fā)酵罐中，并進行權利要求
(3)中所述的滅菌消毒處理，然后通過無菌管道將一級種子發(fā)酵罐中的厚垣孢子液轉入二級種子發(fā)酵罐中，在與權利要求
(3)中發(fā)酵參數(shù)相同的條件下發(fā)酵培養(yǎng)4～5天。培養(yǎng)結束后可獲得厚垣孢子液，厚垣孢子數(shù)與一級種子發(fā)酵液相似。
(5)厚垣孢子生產(chǎn)根據(jù)權利要求
(3)中所述配制相同的真菌培養(yǎng)液。將1.2噸～1.5噸的培養(yǎng)液放入2.5噸的發(fā)酵罐中，并進行權利要求
(3)中所述的滅菌消毒處理，然后通過無菌管道將二級種子發(fā)酵罐中的厚垣孢子液轉入三級發(fā)酵罐中，在與權利要求
(3)中發(fā)酵參數(shù)相同的條件下發(fā)酵培養(yǎng)4～5天。培養(yǎng)結束后可獲得厚垣孢子液，厚垣孢子數(shù)與一級/二級發(fā)酵液相似。
2.濃縮工藝將培養(yǎng)完成的厚垣孢子發(fā)酵液倒入潔凈的塑料桶中。將連續(xù)操作離心機的進口管放入裝有發(fā)酵液的塑料桶中，啟動離心機，轉速為7000～8000rpm，流量為2～3L/分鐘。
3.混合干制工藝根據(jù)權利要求
2中所述，將離心后的兩種有益真菌的濃縮厚垣孢子發(fā)酵液按1∶1的比例進行混合，混合后的厚垣孢子發(fā)酵液再與硅藻土(吉林長白硅藻土總公司)或其它載物進行混合，混合比例為1.1～1.3∶5～6(重量/重量)，混合器的轉速為30轉/分鐘，混合3～5分鐘后將混合物轉入碾磨器中再進行碾磨混合，所出的混合物為最終產(chǎn)品。
綜上所述，本發(fā)明為微生物發(fā)酵工業(yè)提供了一個非常穩(wěn)定的、大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的工藝。本發(fā)明的多功能性與長效性使其具有廣闊的市場前景，并將為社會、經(jīng)濟、環(huán)保和生態(tài)帶來明顯的效益。
表1草莓葉面積增長情況(cm2)
表2草莓株高生長情況(cm)
表3草莓果實增產(chǎn)及防病效果情況
從以上試驗結果可以刊出，本發(fā)明對草莓的葉子、株高和果實都有明顯的促生增產(chǎn)效果，田間施用本發(fā)明菌肥300倍，對草莓葉面積和株高的增加率達到35％以上，對果實的平均增產(chǎn)效果達到25％左右，同時對草莓白粉病的防治效果也達到60％左右。
實施例2本發(fā)明對油菜的促生、增產(chǎn)和防病試驗結果。表1油菜促長、增產(chǎn)試驗結果
表2油菜病害防治試驗結果
從試驗結果可以看出本發(fā)明對油菜的生產(chǎn)有顯著的增產(chǎn)作用，與空白對照相比，150倍增產(chǎn)效果達到38％，300倍增產(chǎn)效果達到26％；與基質對照相比，150倍增產(chǎn)25％，300倍增產(chǎn)13％。同時對油菜菌核病有一定的控制效果。
權利要求
1.一種液體發(fā)酵法制備真菌厚垣孢子復合肥的工藝，其特點在于以哈茨木霉和綠色木霉為菌種，采用如下步驟進行的(1)培養(yǎng)皿菌種制備將哈茨木霉和綠色木霉的純菌株在無菌操作條件下分別接種在固體土豆汁培養(yǎng)基的平面上，然后將培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中，在25～28℃條件下培養(yǎng)3～5天。哈茨木霉(Trichoderma harzianum Th-4)，菌種編號CGMCC N0.0730，和綠色木霉(Trichoderma viride Tv-3)菌種編號CGMCC N0.0731。固體土豆汁培養(yǎng)基配方如下土豆汁 20％蔗糖 0.2％瓊脂 1.5％PH值 自然(2)搖瓶菌種制備根據(jù)權利要求
(1)所述將培養(yǎng)皿制備的菌種在無菌操作條件下轉移到裝有1L真菌培養(yǎng)液的2L搖瓶中。將搖瓶放在搖床上，在23～27℃，轉速180rpm的條件下培養(yǎng)4～5天，培養(yǎng)結束后可獲得厚垣孢子液，厚垣孢子數(shù)為5×108～3×109/ml，真菌培養(yǎng)液的配方為玉米淀粉(北京淀粉廠) 2.5％/L干酵母(北京燕京啤酒廠) 0.25％/L液態(tài)復合肥(美國Actagro LLC.) 3％/L添加劑(美國Ag Biosience Corp) 0.1％/L(3)一級種子制備根據(jù)權利要求
(2)所述配制相同的真菌培養(yǎng)液，將9立升的培養(yǎng)液放入16立升的一級種子發(fā)酵罐中，并加適量消泡劑(旅順化工廠)然后進行高溫(121℃)高壓(15磅)蒸汽滅菌，滅菌時間為1小時，間隔24小時后再以同樣的條件滅菌一次，待培養(yǎng)液冷卻后將發(fā)酵罐的罐壓調整為0，同時將無菌空氣(0.2～0.4磅)通入權利要求
(2)中所述的真菌培養(yǎng)搖瓶中，將1L厚垣孢子液轉入到一級種子發(fā)酵罐中，在25～28℃，罐壓為0.4～0.6Kg，空氣量為1～1.2∶0.5～0.7/m3，轉速為190～210rpm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)3～4天，培養(yǎng)結束后可獲得厚垣孢子液，厚垣孢子數(shù)為2×108～8×108/ml；(4)二級種子制備根據(jù)權利要求
(3)中所述配制相同的真菌培養(yǎng)液，將120L～150L的培養(yǎng)液放入250L的發(fā)酵罐中，并進行權利要求
(3)中所述的滅菌消毒處理，然后通過無菌管道將一級種子發(fā)酵罐中的厚垣孢子液轉入二級種子發(fā)酵罐中，在與權利要求
(3)中發(fā)酵參數(shù)相同的條件下發(fā)酵培養(yǎng)4～5天，培養(yǎng)結束后可獲得厚垣孢子液，厚垣孢子數(shù)與一級種子發(fā)酵液相似；(5)厚垣孢子生產(chǎn)根據(jù)權利要求
(3)中所述配制相同的真菌培養(yǎng)液，將1.2噸～1.5噸的培養(yǎng)液放入2.5噸的發(fā)酵罐中，并進行權利要求
(3)中所述的滅菌消毒處理，然后通過無菌管道將二級種子發(fā)酵罐中的厚垣孢子液轉入三級發(fā)酵罐中，在與權利要求
(3)中發(fā)酵參數(shù)相同的條件下發(fā)酵培養(yǎng)4～5天，培養(yǎng)結束后可獲得厚垣孢子液，厚垣孢子數(shù)與一級/二級發(fā)酵液相似。
2.濃縮工藝將培養(yǎng)完成的厚垣孢子發(fā)酵液倒入潔凈的塑料桶中，將連續(xù)操作離心機的進口管放入裝有發(fā)酵液的塑料桶中，啟動離心機，轉速為8000rpm，流量為2～3L/分鐘。
3.混合干制工藝根據(jù)權利要求
2中所述，將離心后的兩種有益真菌的濃縮厚垣孢子發(fā)酵液按1∶1的比例進行混合，混合后的厚垣孢子發(fā)酵液再與硅藻土(吉林長白硅藻土總公司)或其它載物進行混合，混合比例為1.1～1.3∶5～6(重量/重量)，混合器的轉速為30轉/分鐘，混合3～5分鐘后將混合物轉入碾磨器中再進行碾磨混合，所出的混合物為最終產(chǎn)品。
專利摘要
本發(fā)明屬于微生物技術領域：
，主要內容是以哈茨木霉和綠色木霉為菌種，采取一步液體發(fā)酵法制備成真菌厚垣孢子復合肥的工藝，并將培養(yǎng)完成的厚垣孢子發(fā)酵液經(jīng)過濃縮處理后，把兩種有益真菌的濃縮孢子發(fā)酵液按一定比例與硅藻土或其它載物進行混合，成為最終產(chǎn)品。
文檔編號C12P1/02GKCN1451635SQ02116870
公開日2003年10月29日 申請日期2002年4月18日
發(fā)明者孫連壯, 毛偉力 申請人:孫連壯, 毛偉力導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan