本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種瑤藥翅莖白粉藤的組培快繁方法。

背景技術(shù)：

翅莖白粉藤(cissuxhexangularisthorelexplanch)是葡萄科白粉藤屬的干燥莖，俗稱六方鉆或抽筋藤，為瑤族“虎牛鉆風(fēng)”中的六萬鉆，其富含黃酮類、萜類、芪類、生物堿、香豆素類、甾體類化合物，具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)的功效，在瑤族民間常用于跌打損傷、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、骨折、痛瘡、腫毒、痢疾、蛇咬傷等多種疾病的治療。

白粉藤屬植物全世界有200多種，我國有15種，主要包括毛葉白粉藤、翅莖白粉藤、戟葉白粉藤等，主要分布在南方各省。白粉藤屬植物在心血管、抗腫瘤、治療糖尿病等方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。但目前對(duì)該屬植物研究還不深入，長期處于野生狀態(tài)，尚未被開發(fā)利用，加之煉山造林、生境破壞等原因，其野生資源銳減，因此人工栽培白粉藤植物是十分迫切的！

為了滿足翅莖白粉藤規(guī)模化種植對(duì)種苗的需求，本發(fā)明選擇翅莖白粉藤帶節(jié)藤莖為外植體，經(jīng)誘導(dǎo)、繼代、生根、煉苗以及移栽等步驟，建立了翅莖白粉藤的組培快速繁殖體系。本發(fā)明具有成本低、周期短、操作性簡單等特點(diǎn)，可直接用于翅莖白粉藤種苗的工廠化生產(chǎn)，以利于瑤藥翅莖白粉藤的開發(fā)利用。

至目前為止，國內(nèi)外尚未有瑤藥翅莖白粉藤組織培養(yǎng)技術(shù)的報(bào)道，也未見有瑤藥翅莖白粉藤組培快繁專利的申請(qǐng)。

公開于該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種瑤藥翅莖白粉藤的組培快繁方法，本發(fā)明選擇翅莖白粉藤帶節(jié)藤莖為外植體，經(jīng)誘導(dǎo)、繼代、生根、煉苗以及移栽等步驟，建立了瑤藥翅莖白粉藤的組培快速繁殖體系，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。

本發(fā)明所提供的技術(shù)方案是：

一種瑤藥翅莖白粉藤的組培快繁方法，包括如下步驟：

(1)外植體采集：在野外選取生長健壯、無明顯病害的翅莖白粉藤植株向陽帶節(jié)莖段為外植體，采集后立即進(jìn)行保水保濕處理并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室；

(2)外植體誘導(dǎo)：當(dāng)步驟(1)采集回實(shí)驗(yàn)室外植體置于自來水下沖洗沖洗過夜，在超凈工作臺(tái)中用75％的酒精液浸泡15-20s后立即用無菌水沖洗3-5次；在0.1％的升汞溶液中浸泡10-15min后立即用無菌水沖洗5-7次，用無菌濾紙吸干外植體表面水分后切成1.5-2.0cm的帶節(jié)莖段并接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于25-28℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)30-40天，即可誘導(dǎo)形成不定芽；

(3)繼代培養(yǎng)：將步驟(2)誘導(dǎo)得到的不定芽切成長約1.5-2.0cm的莖段并接種到繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)28-32d，即可實(shí)現(xiàn)不定芽的增殖；

(4)生根培養(yǎng)：將步驟(3)繼代得到的長約1.5-2.0cm的不定芽從基部切下并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30-40d，即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根；

(5)移栽：將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗3-5d，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于混合基質(zhì)中培育成苗，即得翅莖白粉藤種苗。

作為優(yōu)選，步驟(2)中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+1.5-2.0mg/l6-ba+0.1-0.5mg/lnaa+25-30g/l蔗糖+3.5-4.0g/l瓊脂+0.5-1.0g/l活性炭，ph為5.4-5.8。

作為優(yōu)選，步驟(3)中所述的繼代培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+0.3-0.6mg/l6-ba+0.1-0.3mg/lnaa+25-30g/l蔗糖+3.5-4.0g/l瓊脂+0.1-0.5g/l活性炭，ph為5.4-5.8。

作為優(yōu)選，步驟(4)中所述的生根培養(yǎng)基為：1/2ms培養(yǎng)基+0.5-1.0mg/lnaa+0.3-0.6mg/liba+15-20g/l蔗糖+3.0-4.0g/l瓊脂，ph為5.4-5.8。

作為優(yōu)選，上述步驟(3)-(4)中的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25-28℃，光照強(qiáng)度為2500-3000lx，光照時(shí)間為13-14h/d。

作為優(yōu)選，步驟(5)中的混合基質(zhì)是由腐殖土和泥炭土按照體積比1:1混合而成。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明的方法采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立了瑤藥翅莖白粉藤的組培快速繁殖體系，具有成本低、周期短、操作性簡單等特點(diǎn)，可直接用于翅莖白粉藤種苗的工廠化生產(chǎn)，以利于瑤藥翅莖白粉藤的開發(fā)利用。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍做出更為清楚明確的界定。

實(shí)施例1：

一種瑤藥翅莖白粉藤的組培快繁方法，包括如下步驟：

(1)外植體采集：在野外選取生長健壯、無明顯病害的翅莖白粉藤植株向陽帶節(jié)莖段為外植體，采集后立即進(jìn)行保水保濕處理并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。

(2)外植體誘導(dǎo)：當(dāng)步驟(1)采集回實(shí)驗(yàn)室外植體置于自來水下沖洗沖洗過夜。在超凈工作臺(tái)中用75％的酒精液浸泡15秒鐘后立即用無菌水沖洗3次。在0.1％的升汞溶液中浸泡10分鐘后立即用無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸干外植體表面水分后切成1.5cm左右的帶節(jié)莖段并接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于25℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)30天即可誘導(dǎo)形成不定芽，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+1.5mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+25g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂+0.5g/l活性炭，ph為5.4。

(3)繼代培養(yǎng)：將步驟(2)誘導(dǎo)得到的不定芽切成長約1.5cm的莖段并接種到繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)28天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的增殖，增殖系數(shù)達(dá)到2.5倍。所述的繼代培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+0.3mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+25g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂+0.1g/l活性炭，ph為5.4。

(4)生根培養(yǎng)：將步驟(3)繼代得到的長約1.5cm的不定芽從基部切下并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根。所述的生根培養(yǎng)基為：1/2ms培養(yǎng)基+0.5mg/lnaa+0.3mg/liba+15g/l蔗糖+3.0g/l瓊脂，ph為5.4。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗3-5天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、泥炭土混合基質(zhì)中培育成苗即得翅莖白粉藤種苗。

上述步驟(3)-(4)中的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2500lx，光照時(shí)間為13小時(shí)/天。

實(shí)施例2：

一種瑤藥翅莖白粉藤的組培快繁方法，包括如下步驟：

(1)外植體采集：在野外選取生長健壯、無明顯病害的翅莖白粉藤植株向陽帶節(jié)莖段為外植體，采集后立即進(jìn)行保水保濕處理并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。

(2)外植體誘導(dǎo)：當(dāng)步驟(1)采集回實(shí)驗(yàn)室外植體置于自來水下沖洗沖洗過夜。在超凈工作臺(tái)中用75％的酒精液浸泡20秒鐘后立即用無菌水沖洗5次。在0.1％的升汞溶液中浸泡15分鐘后立即用無菌水沖洗7次，用無菌濾紙吸干外植體表面水分后切成2.0cm左右的帶節(jié)莖段并接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于28℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)40天即可誘導(dǎo)形成不定芽，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂+1.0g/l活性炭，ph為5.8。

(3)繼代培養(yǎng)：將步驟(2)誘導(dǎo)得到的不定芽切成長2.0cm的莖段并接種到繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)32天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的增殖，增殖系數(shù)達(dá)到3.0倍。所述的繼代培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+0.6mg/l6-ba+0.3mg/lnaa+30g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂+0.5g/l活性炭，ph為5.8。

(4)生根培養(yǎng)：將步驟(3)繼代得到的長2.0cm的不定芽從基部切下并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)40天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根。所述的生根培養(yǎng)基為：1/2ms培養(yǎng)基+1.0mg/lnaa+0.6mg/liba+20g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂，ph為5.8。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗5天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、泥炭土混合基質(zhì)中培育成苗即得翅莖白粉藤種苗。

上述步驟(3)-(4)中的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為3000lx，光照時(shí)間為14小時(shí)/天。

實(shí)施例3：

一種瑤藥翅莖白粉藤的組培快繁方法，包括如下步驟：

(1)外植體采集：在野外選取生長健壯、無明顯病害的翅莖白粉藤植株向陽帶節(jié)莖段為外植體，采集后立即進(jìn)行保水保濕處理并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。

(2)外植體誘導(dǎo)：當(dāng)步驟(1)采集回實(shí)驗(yàn)室外植體置于自來水下沖洗沖洗過夜。在超凈工作臺(tái)中用75％的酒精液浸泡18秒鐘后立即用無菌水沖洗4次。在0.1％的升汞溶液中浸泡12分鐘后立即用無菌水沖洗6次，用無菌濾紙吸干外植體表面水分后切成1.6cm左右的帶節(jié)莖段并接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于26℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)35天即可誘導(dǎo)形成不定芽，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+1.8mg/l6-ba+0.3mg/lnaa+28g/l蔗糖+3.8g/l瓊脂+0.7g/l活性炭，ph為5.6。

(3)繼代培養(yǎng)：將步驟(2)誘導(dǎo)得到的不定芽切成長1.8cm的莖段并接種到繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的增殖，增殖系數(shù)達(dá)到2.6倍。所述的繼代培養(yǎng)基為：ms培養(yǎng)基+0.5mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+28g/l蔗糖+3.6g/l瓊脂+0.2g/l活性炭，ph為5.5。

(4)生根培養(yǎng)：將步驟(3)繼代得到的長約1.8cm的不定芽從基部切下并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)34天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根。所述的生根培養(yǎng)基為：1/2ms培養(yǎng)基+0.9mg/lnaa+0.4mg/liba+17g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂，ph為5.6。

(5)移栽：將步驟(4)根系生長良好的試管苗在溫室的自然光下煉苗4天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的腐殖土、泥炭土混合基質(zhì)中培育成苗即得翅莖白粉藤種苗。

上述步驟(3)-(4)中的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為26℃，光照強(qiáng)度為2800lx，光照時(shí)間為13小時(shí)/天。

將上述實(shí)施例1-3得到的瑤藥翅莖白粉藤的組培快繁方法中不定芽誘導(dǎo)、愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽的增殖、愈傷組織分化、生根情況進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表1。

表1本發(fā)明的瑤藥翅莖白粉藤的組織培養(yǎng)方法對(duì)不定芽誘導(dǎo)、愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽的增殖、愈傷組織分化、生根情況的測(cè)定

由表1可知，本發(fā)明的瑤藥翅莖白粉藤的組培快繁方法得到的不定芽長勢(shì)良好，不定芽多；其誘導(dǎo)率和生根率均為100％?？梢?，本發(fā)明的方法具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，值得進(jìn)一步推廣和應(yīng)用。

前述對(duì)本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對(duì)示例性實(shí)施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。