本發(fā)明屬于植物栽培技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種植物花期的調(diào)控方法，更具體而言，涉及一種通過嫁接介導(dǎo)的rnai技術(shù)促進(jìn)菊花提前開花的方法。
背景技術(shù)：
菊花因秋天開花特性，生產(chǎn)上培育期比較長，一定程度上影響了菊花的應(yīng)用。例如，大多數(shù)菊花品種花期在國慶節(jié)之后，就影響了其在國慶旅游旺季的應(yīng)用。因而促進(jìn)菊花提前開花，對于減少栽培成本具有特別重要的意義。
對菊花花期調(diào)控研究表明，通過短日照、甲基化抑制劑（5-azac、姜黃素、地西他濱等）處理等方法可使菊花的多個品種花期提前，其中短日照處理后初花時間可提前11~19天，而甲基化抑制劑可使花期提前7~10天。但總體而言，現(xiàn)有花期調(diào)控方法較為耗時耗力，且易受環(huán)境因素影響而發(fā)生逆轉(zhuǎn)，不能穩(wěn)定的遺傳，因此每年都要進(jìn)行處理，難以得到有效推廣應(yīng)用。
分子生物技術(shù)的發(fā)展，為菊花新品種培育提供了新方法、新途徑，也使可提前開花菊花性狀的穩(wěn)定遺傳具有了可能性?，F(xiàn)有技術(shù)中，專利《一種利用rnai載體調(diào)節(jié)菊花開花時間的方法》（申請?zhí)枺?01710049401x）中，從分子水平入手，利用rnai技術(shù)干擾了dna甲基化基因的表達(dá)，使dna甲基化水平降低從而影響了開花時間，進(jìn)而使得可提前開花性狀能夠得到穩(wěn)定遺傳。但是該專利技術(shù)在應(yīng)用中也存在一定缺陷，主要是：rnai轉(zhuǎn)基因植株可能會通過傳粉途徑與周圍自然生長條件下的菊花發(fā)生天然雜交，進(jìn)而存在著基因漂移的風(fēng)險，此外該方法調(diào)控菊花花期，每調(diào)控一個品種，都必須要進(jìn)行一次轉(zhuǎn)基因過程，費時費力。
總之，開發(fā)新的花期調(diào)控方法及調(diào)控技術(shù)，對于花卉栽培技術(shù)發(fā)展及推廣花卉應(yīng)用具有十分重要的科研意義和應(yīng)用意義，尚需進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本申請目的在于提供一種嫁接介導(dǎo)的rnai技術(shù)促進(jìn)菊花提前開花的方法，該方法以現(xiàn)有的rnai干涉促進(jìn)菊花提前開花技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合嫁接技術(shù)應(yīng)用，在保證轉(zhuǎn)基因材料安全性的前提下，通過將不同菊花品種嫁接至轉(zhuǎn)基因材料上，調(diào)控不同品種菊花的花期，促使菊花提前開花，為菊花栽培技術(shù)的發(fā)展提供新的技術(shù)思路和參考。
本申請所采取的技術(shù)方案詳述如下。
一種嫁接介導(dǎo)的rnai技術(shù)促進(jìn)菊花提前開花的方法，包括如下操作步驟：
（1）制備砧木，所述砧木為采用rnai技術(shù)沉默甲基化基因后的轉(zhuǎn)基因菊花材料，具體例如為采用rnai技術(shù)沉默甲基轉(zhuǎn)移酶met1基因后的菊花植株，具體操作例如《一種利用rnai載體調(diào)節(jié)菊花開花時間的方法》（申請?zhí)枺?01710049401x），即rnai干擾met1基因后的轉(zhuǎn)基因“紫精靈”；
所述轉(zhuǎn)基因材料，在生長至株高為20~25cm左右時，摘除頂端芽，打破頂端優(yōu)勢，使其生長側(cè)枝；待其生長出2~3個側(cè)枝后，摘除多余側(cè)芽后即可備用作為砧木，以方便進(jìn)一步進(jìn)行嫁接處理，待側(cè)枝長至10~15cm時即可作為砧木進(jìn)行嫁接；
（2）選擇接穗，選擇生長健康、長勢一致的目標(biāo)品種的菊花幼枝，去除基部葉片與腋芽后作接穗；
所述菊花幼枝長度為4~5cm左右；
所述目標(biāo)品種例如為：早花品種“國慶紅”、晚花品種“洹水金秋”等；
（3）嫁接操作，將步驟（2）中接穗嫁接至步驟（1）中的砧木，具體例如采用劈接法進(jìn)行操作，具體操作方法為：
將步驟（2）中接穗的基部削成長2~3厘米的平滑楔狀；
割斷步驟（1）中砧木主枝頂端，縱切砧木主枝中心使其形成長2~3厘米縫隙；
然后將削好的楔形接穗放入砧木間縫中，對齊貼緊；
用保鮮膜自下而上綁緊扎實；
嫁接完成后，正常田間管理即可。
嫁接方法是作物栽培育種中一種十分常用的方法，但在花期調(diào)控中的應(yīng)用十分有限，而且由于菊花草本特性，應(yīng)用相對較少。新的rnai沉默技術(shù)調(diào)控菊花花期的成果，使得菊花提前開花性狀的穩(wěn)定遺傳有了實現(xiàn)的可能。在此基礎(chǔ)上，利用嫁接技術(shù)，發(fā)明人以轉(zhuǎn)基因菊花材料作為砧木，以非轉(zhuǎn)基因菊花品種為接穗，而rnai沉默信號在嫁接部位進(jìn)行傳遞，使其在接穗中發(fā)揮作用干擾接穗中met1基因的表達(dá)從而影響dna甲基化水平，進(jìn)而影響接穗品種菊花的開花時間。
本申請中，由于轉(zhuǎn)基因菊花材料僅作為砧木，不用于開花，因而可以較好避免基因漂移的生物安全風(fēng)險，另外，通過嫁接技術(shù)的應(yīng)用，只需一個轉(zhuǎn)基因菊花品種材料即可實現(xiàn)不同菊花品種的提前開放，避免了每個品種的轉(zhuǎn)基因操作，適用性較好。
總體而言，本申請所提供的促進(jìn)菊花提前開放方法，在確保植株正常生長和菊花品質(zhì)穩(wěn)定的基礎(chǔ)上較好實現(xiàn)了提前開花的目的，對于培育優(yōu)良品種的早花系具有較好的應(yīng)用價值；同時該方法相較于其他花期調(diào)控方法而已，人力、物力投入較少，適于批量化、規(guī)模化生產(chǎn)，生產(chǎn)效益較為客觀，因而具有較好的推廣應(yīng)用價值。
具體實施方式
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地詳細(xì)介紹，在介紹具體實施例前，就下述實施例中涉及部分物料情況簡要介紹如下。
生物材料：
轉(zhuǎn)基因“紫精靈”菊花材料，具體參見《一種利用rnai載體調(diào)節(jié)菊花開花時間的方法》（申請?zhí)枺?01710049401x）中操作，由于該材料為發(fā)明人所制備，因而保留有相關(guān)材料；
早花品種“國慶紅”、晚花品種“洹水金秋”，均為常見菊花品種。
實施例
本申請所提供的嫁接介導(dǎo)的rnai技術(shù)促進(jìn)菊花提前開花的方法，具體操作過程簡要介紹如下。
（1）制備砧木，以rnai干擾met1基因后的轉(zhuǎn)基因“紫精靈”菊花材料為例，由于原始材料相對有限，因而首先進(jìn)行適當(dāng)擴(kuò)增繁殖備用，擴(kuò)增繁殖時采用組培方式進(jìn)行，所用培養(yǎng)基為：ms+1.0mg/l6-ba+0.15mg/lnaa（ph=5.8），然后用ms培養(yǎng)基作為生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根，配方為ms+3%蔗糖。培養(yǎng)條件為：溫度（25±1）℃，光照強(qiáng)度為2000lux，每天光照時間為12。
菊花幼苗生根后，繼續(xù)培養(yǎng)1~2個月后進(jìn)行常規(guī)煉苗，煉苗時，將生根幼苗移栽至穴盤中進(jìn)行煉苗，穴盤中培養(yǎng)基質(zhì)為：珍珠鹽：草木炭=2：1（質(zhì)量比）；自然環(huán)境中遮光培養(yǎng)；
待菊花幼苗長出新根后，移栽至試驗田內(nèi)，進(jìn)行常規(guī)田間管理作為砧木備用；
以河南地區(qū)為例，轉(zhuǎn)基因材料在大約6月初時，即可生長至20~25cm左右，此時摘除頂端芽，打破頂端優(yōu)勢，使其生長側(cè)枝；待其生長出2~3個側(cè)枝后，摘除多余側(cè)芽后即可備用作為砧木，以方便進(jìn)一步進(jìn)行嫁接處理，待側(cè)枝長至10~15cm時即可作為砧木進(jìn)行嫁接。
（2）選擇接穗，選擇生長健康、長勢一致的目標(biāo)品種的菊花幼枝，去除基部葉片與腋芽后作接穗；
所述菊花幼枝長度為4~5cm；
所述目標(biāo)品種具體以早花品種“國慶紅”和晚花品種“洹水金秋”為例。
（3）嫁接操作，將步驟（2）中接穗嫁接至步驟（1）中的砧木，具體例如采用劈接法進(jìn)行操作，具體操作方法為：
將步驟（2）中接穗的基部削成長2~3厘米的平滑楔狀；
割斷步驟（1）中砧木主枝頂端，縱切砧木主枝中心使其形成長2~3厘米縫隙；
然后將削好的楔形接穗放入砧木間縫中，對齊貼緊；
用保鮮膜自下而上綁緊扎實；
以河南地區(qū)為例，嫁接時間為七月中旬左右進(jìn)行，嫁接操作時以下午16:00~18:00操作為宜；
菊花接穗品種洹水金秋分別嫁接到12株轉(zhuǎn)基因和12株非轉(zhuǎn)基因菊花品種紫精靈上，每株含有2~3個接穗；菊花接穗品種國慶紅作同樣處理；
嫁接完成后，正常田間管理即可。
嫁接完成后，記錄試驗過程中的現(xiàn)蕾日期（現(xiàn)蕾日期以出現(xiàn)肉眼可見的花苞為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計）、開花日期（開花日期以花瓣全部展開為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計）、現(xiàn)蕾時間（現(xiàn)蕾時間以現(xiàn)蕾日期-移栽日期為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計）、開花時間（開花時間以開花日期-移栽日期為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計）。
最終統(tǒng)計結(jié)果如下表所示：
注：對照組為嫁接到非轉(zhuǎn)基因紫精靈上的菊花品種，處理組為嫁接到轉(zhuǎn)基因紫精靈上的菊花品種。
從上述結(jié)果可以看出：接穗晚花品種“洹水金秋”對照組與處理組花蕾出現(xiàn)時間和初花時間分為121d和154d、109d和145d；而在嫁接于rna干涉轉(zhuǎn)基因植株后，現(xiàn)蕾時間和開花時間與對照組相比都顯著縮短，分別提前12d和9d，花蕾發(fā)育時間處理組與對照間沒有差異；
接穗早花品種“國慶紅”處理組與對照之間幾乎同時現(xiàn)蕾，處理組顯著性的縮短了花蕾發(fā)育時間，從而使菊花提前12d開花。
分析可以看出，以可以提前開花的轉(zhuǎn)基因材料作為砧木，嫁接常規(guī)菊花品種后，針對不同菊花品種（早花品種、晚花品種）時，現(xiàn)蕾時間提前效果不太一致，但就開花時間而言，均能較好實現(xiàn)提前開放效果，證明了本技術(shù)的可行性，而利用該技術(shù)，對于調(diào)節(jié)菊花花期具有十分重要的應(yīng)用意義。