本發(fā)明屬于微生物肥料領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種防治番茄青枯病的微生物菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
番茄青枯病是由青枯病菌引起的一種土傳性維管束病害，該病分布范圍比較廣泛，尤其是在熱帶及亞熱帶地區(qū)，常常能給這個(gè)地區(qū)造成極大的損失，嚴(yán)重影響了番茄的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。番茄青枯病菌菌系較為復(fù)雜，寄主廣泛，除對(duì)番茄造成危害外，像煙草、花生、香蕉等數(shù)百種作物也是青枯病的常見(jiàn)寄主作物。番茄青枯病菌傳播介質(zhì)廣，途徑多，易引起重復(fù)侵染，且存活時(shí)間長(zhǎng)，最高可達(dá)3年。
目前，番茄青枯病的防治主要有化學(xué)藥劑、撒施石灰、水早輪作、抗病育種、生物防治等方式?；瘜W(xué)藥劑雖見(jiàn)效快，但青枯菌易產(chǎn)生耐藥性，且大量施用化學(xué)藥劑對(duì)生態(tài)環(huán)境亦造成極大的污染。撒施石灰雖可減輕病害發(fā)生，但易造成土壤板結(jié)。水早輪作要求輪作年限較長(zhǎng)，實(shí)施起來(lái)較困難。抗病育種需要較為理想的抗源材料，但目前抗源材料篩選進(jìn)展緩慢。生物防治主要采用“以菌治菌”理念來(lái)有效控制青枯病害的發(fā)生，具有可利用資源豐富、成本低廉、能夠避免環(huán)境二次污染等優(yōu)點(diǎn)，是目前防治青枯病研究與應(yīng)用的熱點(diǎn)之一。
近幾年來(lái)，雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者及專家在番茄青枯菌生物防治方面取得不少研究成果，但生物防治方法目前大都仍處于試驗(yàn)階段，進(jìn)入實(shí)際生產(chǎn)的很少，且現(xiàn)處于試驗(yàn)階段的菌種多為單一菌株，用于抗青枯病的復(fù)合菌群較少。另外，目前抗青枯病的功能菌種類較少，仍然需要進(jìn)一步篩選并開(kāi)發(fā)出品種多的抗青枯病功能菌株。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明針對(duì)上述的問(wèn)題，提供了一種防治番茄青枯病的微生物菌劑及其制備方法，該菌劑由復(fù)合菌群構(gòu)建，其防病效果達(dá)60％以上，且防治效果顯著優(yōu)于單施農(nóng)藥及單一功能菌，為番茄青枯病的生物防治提供了一種有效途徑。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種防治番茄青枯病的微生物菌劑，按照體積比由以下組分構(gòu)成：枯草芽孢桿菌菌懸液1.5份-3份、側(cè)孢芽孢桿菌菌懸液1份和多粘芽孢桿菌菌懸液1份。
進(jìn)一步地，所述枯草芽孢桿菌菌懸液、側(cè)孢芽孢桿菌菌懸液和多粘芽孢桿菌菌懸液的濃度均大于1×108cfu/ml。
進(jìn)一步地，所述枯草芽孢桿菌菌懸液、側(cè)孢芽孢桿菌菌懸液和多粘芽孢桿菌菌懸液通過(guò)以下方法制備得到：在無(wú)菌條件下，將保存在-4℃環(huán)境下的枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌分別接種至tsa培養(yǎng)基上，28-30℃下培養(yǎng)48h；之后分別挑取各菌單菌落接種至tsa液體培養(yǎng)基中，28-30℃，200-220r/min下振蕩培養(yǎng)24h，即得枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液；鏡檢，確保各菌菌懸液濃度大于1×108cfu/ml。
進(jìn)一步地，tsa培養(yǎng)基為：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂15.0g，ph值7.3；滅菌條件為：壓強(qiáng)0.1-0.15mpa，溫度121℃，時(shí)間30min。
本發(fā)明還提供一種防治番茄青枯病的微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟：
步驟1、制備枯草芽孢桿菌菌懸液、側(cè)孢芽孢桿菌菌懸液和多粘芽孢桿菌菌懸液：在無(wú)菌條件下，將保存在-4℃環(huán)境下的枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌分別接種至tsa培養(yǎng)基上培養(yǎng)；之后分別挑取各菌單菌落接種至tsa液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，即得枯草芽孢桿菌菌懸液、側(cè)孢芽孢桿菌菌懸液和多粘芽孢桿菌菌懸液；
步驟2、稱量：按照體積比稱量以下組分：枯草芽孢桿菌菌懸液1.5份-3份、側(cè)孢芽孢桿菌菌懸液1份和多粘芽孢桿菌菌懸液1份；
步驟3、混合：將稱量好的枯草芽孢桿菌菌懸液、側(cè)孢芽孢桿菌菌懸液和多粘芽孢桿菌菌懸液混合均勻，制備得到防治番茄青枯病的微生物菌劑。
進(jìn)一步地，步驟1中的所述枯草芽孢桿菌菌懸液、側(cè)孢芽孢桿菌菌懸液和多粘芽孢桿菌菌懸液的濃度均大于1×108cfu/ml。
進(jìn)一步地，步驟1中的枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌和多粘芽孢桿菌在tsa培養(yǎng)基上的培養(yǎng)條件是：溫度28-30℃，時(shí)間48h。
進(jìn)一步地，步驟1中的枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌和多粘芽孢桿菌單菌落在tsa液體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)條件是：溫度28-30℃，轉(zhuǎn)速200-220r/min，時(shí)間24h。
進(jìn)一步地，步驟1中的tsa培養(yǎng)基為：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂15.0g，ph值7.3。
進(jìn)一步地，步驟1中的tsa培養(yǎng)基滅菌條件為：壓強(qiáng)0.1-0.15mpa，溫度121℃，時(shí)間30min。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：
1)本發(fā)明采用枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌為菌種，經(jīng)活化、培養(yǎng)、發(fā)酵制備成菌懸液后應(yīng)用于番茄上，為番茄青枯病的生物防治提供了一種有效途徑。
2)本菌劑經(jīng)盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證，其番茄青枯病防治效果達(dá)60％以上，且防治效果高于單施農(nóng)藥及單一功能菌。
3)使用本發(fā)明菌劑后，可間接減少農(nóng)藥使用量，進(jìn)而減少農(nóng)藥大量施用對(duì)環(huán)境造成的污染。
當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。
具體實(shí)施方式
以下將配合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來(lái)解決技術(shù)問(wèn)題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過(guò)程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。
本發(fā)明提供一種防治番茄青枯病的微生物菌劑，按照體積比由以下組分構(gòu)成：枯草芽孢桿菌菌懸液1.5份-3份、側(cè)孢芽孢桿菌菌懸液1份和多粘芽孢桿菌菌懸液1份。
本發(fā)明提供一種防治番茄青枯病的微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟：
1)制備各菌菌懸液
在無(wú)菌條件下，將保存在-4℃環(huán)境下的枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌分別接種至tsa培養(yǎng)基上，28-30℃下培養(yǎng)48h。之后分別挑取各菌單菌落接種至tsa液體培養(yǎng)基中，28-30℃，200-220r/min下振蕩培養(yǎng)24h，即得枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液。鏡檢，確保各菌菌懸液濃度大于1×108cfu/ml。
其中tsa培養(yǎng)基為：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂15.0g，ph值7.3。在0.1-0.15mpa，121℃條件下滅菌30min，備用。
2)配制
將1)中制備得到的枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液，按體積比1.5-3:1:1混合均勻，制備得到防治番茄青枯病的微生物菌劑。
實(shí)施例1
一種防治番茄青枯病的微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟：
1)制備各菌菌懸液
在無(wú)菌條件下，將保存在-4℃環(huán)境下的枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌分別接種至tsa培養(yǎng)基上，29℃下培養(yǎng)48h。之后分別挑取各菌單菌落接種至tsa液體培養(yǎng)基中，29℃，210r/min下振蕩培養(yǎng)24h，即得枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液。鏡檢，確保各菌菌懸液濃度大于1×108cfu/ml。
其中tsa培養(yǎng)基為：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂15.0g，ph值7.3。在0.12mpa，121℃條件下滅菌30min，備用。
2)配制
將1)中制備得到的枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液，按體積比2:1:1混合均勻，制備得到防治番茄青枯病的微生物菌劑。
實(shí)施例2
一種防治番茄青枯病的微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟：
1)制備各菌菌懸液
在無(wú)菌條件下，將保存在-4℃環(huán)境下的枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌分別接種至tsa培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)48h。之后分別挑取各菌單菌落接種至tsa液體培養(yǎng)基中，28℃，220r/min下振蕩培養(yǎng)24h，即得枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液。鏡檢，確保各菌菌懸液濃度大于1×108cfu/ml。
其中tsa培養(yǎng)基為：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂15.0g，ph值7.3。在0.1mpa，121℃條件下滅菌30min，備用。
2)配制
將1)中制備得到的枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液，按體積比1.5:1:1混合均勻，制備得到防治番茄青枯病的微生物菌劑。
實(shí)施例3
一種防治番茄青枯病的微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟：
1)制備各菌菌懸液
在無(wú)菌條件下，將保存在-4℃環(huán)境下的枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌分別接種至tsa培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)48h。之后分別挑取各菌單菌落接種至tsa液體培養(yǎng)基中，30℃，200r/min下振蕩培養(yǎng)24h，即得枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液。鏡檢，確保各菌菌懸液濃度大于1×108cfu/ml。
其中tsa培養(yǎng)基為：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂15.0g，ph值7.3。在0.15mpa，121℃條件下滅菌30min，備用。
2)配制
將1)中制備得到的枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液，按體積比3:1:1混合均勻，制備得到防治番茄青枯病的微生物菌劑。
下面結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)說(shuō)明微生物菌劑對(duì)番茄青枯病防治效果：
(1)青枯病菌接菌方法
首先將供試土壤曝曬2天，消毒后裝盆，每盆缽裝土6kg，后接青枯病菌菌液(菌懸液濃度大于1×108cfu/ml)200ml/盆，攪拌均勻，保濕培養(yǎng)5天，備用。
(2)功能菌接菌方法
選取長(zhǎng)勢(shì)一致的4-6葉番茄幼苗移栽到預(yù)處理過(guò)青枯菌的盆缽中，移栽時(shí)分別用處理3、4、5、6的功能菌液蘸根10min，移栽7天后進(jìn)行功能菌液灌根處理，各功能菌(菌懸液濃度大于1×108cfu/ml)接種量60ml/每盆。
(3)農(nóng)藥處理方法
在預(yù)處理過(guò)青枯菌的盆缽中加入47％加瑞農(nóng)可濕性粉劑1000倍液100ml，拌勻，放置3天，使農(nóng)藥與青枯菌充分作用后，移栽番茄苗。移栽7天后進(jìn)行灌根處理，每盆加入47％加瑞農(nóng)可濕性粉劑1000倍液50ml。
(4)試驗(yàn)設(shè)計(jì)
處理1：對(duì)照(ck)，只接青枯病菌；
處理2：農(nóng)藥+青枯病菌；
處理3：實(shí)施例1制備的微生物菌劑+青枯病菌；
處理4：接枯草芽孢桿菌+青枯病菌；
處理5：接側(cè)孢芽孢桿菌+青枯病菌；
處理6：接多粘芽孢桿菌+青枯病菌。
試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理，每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10盆。試驗(yàn)期間正常水分管理。另外，為滿足番茄生長(zhǎng)需求，在裝土?xí)r每盆追施尿素2.06g，過(guò)磷酸鈣0.94g，硫酸鉀2.72g。移栽14天后，記錄番茄發(fā)病情況，計(jì)算其病情指數(shù)及青枯病抑制率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1、2。
番茄青枯病病情調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)采用5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)法，即0級(jí)：無(wú)??；1級(jí)：植株有1-2片葉凋萎；2級(jí)：植株有3-5片葉凋萎；3級(jí)：植株大部分葉片凋萎；4級(jí)：植株凋萎枯死或即將枯死。
病情指數(shù)＝[σ(病級(jí)株數(shù)×病害級(jí)數(shù))/(該處理盆栽苗總和×發(fā)病最重級(jí)的代表數(shù)值)]×100。
抑制率(％)＝(對(duì)照發(fā)病指數(shù)-處理病情指數(shù))×100/對(duì)照發(fā)病指數(shù)。
表1番茄青枯病發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)
表2盆栽14d對(duì)青枯病菌的抑制效果
以上結(jié)果表明，在同時(shí)接種番茄青枯病菌的基礎(chǔ)上，本發(fā)明微生物菌劑處理番茄后，青枯病病情指數(shù)較低，抑制率達(dá)61.57％，可見(jiàn)其防治效果高于農(nóng)藥處理和單一菌處理，說(shuō)明在一定程度上本發(fā)明的微生物菌劑對(duì)番茄青枯病有一定的防治效果。
上述說(shuō)明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過(guò)上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。