一種脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物源農(nóng)藥制備領(lǐng)域，提供一種脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑及其制備方法和應(yīng)用。該復(fù)合生防制劑由脂肽、剝片高嶺土和水組成，其中，脂肽和剝片高嶺土的質(zhì)量百分比分別為0.1％、2％。該脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑的制備過程包括：(1)脂肽粉末制備(2)剝片高嶺土制備(3)脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑獲得。本發(fā)明提供的脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑中，剝片高嶺土與脂肽的結(jié)合提高了脂肽的穩(wěn)定性，延長了脂肽的作用時間，有效地提高防治番茄青枯病的防治效果，促進(jìn)了番茄植株生長。解決了現(xiàn)有技術(shù)中脂肽生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低、穩(wěn)定性差、發(fā)揮效果時間短，其有效開發(fā)利用受限制等問題，提高了由生物復(fù)合材料制成的番茄青枯病防治劑效果。
CGMCC No.4160
2010.09.14
【專利說明】一種脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物源農(nóng)藥制備領(lǐng)域，涉及一種脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑及其制 備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 番爺青枯病是由爺科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum)引起的一種全世界廣 泛分布的細(xì)菌性土傳病害。發(fā)病初期，植株下部葉片的葉柄出現(xiàn)下垂，而后葉片漸次枯萎， 同時莖部出現(xiàn)不定根，植株快速萎蔫并逐漸枯死。輕則減產(chǎn)20%?40%，嚴(yán)重時達(dá)60%以 上甚至絕收。茄科雷爾氏菌存在較大的遺傳變異，目前尚無有效的化學(xué)防治方法。常用的 防治措施如抗性育種、田間清除、作物輪作、綜合管理等由于青枯病病害系統(tǒng)的復(fù)雜性而成 效甚微。
[0003] 芽孢桿菌（Bacillus spp.)具有復(fù)雜的生理學(xué)性質(zhì)多樣性和底物多樣性，能夠產(chǎn) 生高耐性芽孢和各種抑菌物質(zhì)如多肽類和脂肽類及細(xì)菌素類抗生素。脂肽類表面活性劑作 為一種生物表面活性劑（biosurfactant)，能夠改變細(xì)胞膜通透性，具有廣譜的抗真菌和抑 制部分細(xì)菌的活性，研究表明，某些脂肽類物質(zhì)對立枯絲核菌和青枯菌表現(xiàn)出很好的拮抗 活性，可以利用其防治青枯病，但是其化學(xué)不穩(wěn)定性，物理和酶不穩(wěn)定性，限制了脂肽類表 面活性劑相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用。同時，較高的生產(chǎn)成本和較低的產(chǎn)量也限制了脂肽的工 業(yè)化生產(chǎn)。
[0004] 近年來，生物材料與有機(jī)膜、有機(jī)顆粒、無機(jī)粘土材料之間相互作用制備復(fù)合材 料，在學(xué)術(shù)界已經(jīng)引起了相當(dāng)大的興趣，特別是無機(jī)納米亞微米級材料結(jié)構(gòu)豐富新穎、熱穩(wěn) 定性優(yōu)良、表面活性可調(diào)節(jié)、價格低廉，生物材料和無機(jī)納米材料的有效復(fù)合，能夠很好維 持生物大分子的結(jié)構(gòu)，并且有可能會賦予生物物質(zhì)新的優(yōu)異特性。高嶺土屬于1 : 1型的 硅鋁酸鹽粘土礦物，其晶架結(jié)構(gòu)都有一層硅氧片和一層水鋁片重疊而成，高嶺土可用作化 月巴、農(nóng)藥、殺蟲劑的載體，因?yàn)槠漕w粒表面具有微細(xì)孔隙，有一定的吸附性。但是，普通高嶺 土的比表面積不夠大，雖具有粘土礦物特有吸附性、分散性、流變性、多孔性和表面酸性，但 沒有納米亞微米級材料的表面效應(yīng)，活性中心不夠多，相應(yīng)的吸附性、分散性、流變性會差 很多，因此，與生物材料不能有效復(fù)合，形成的復(fù)合材料效果會大打折扣。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中脂肽生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低、穩(wěn)定性差、發(fā)揮效果時 間短，其有效開發(fā)利用受到限制的問題，同時，也是為了解決生物復(fù)合材料復(fù)合程度不高， 由生物復(fù)合材料制成的番茄青枯病防治劑效果不好的問題，提供一種通過農(nóng)業(yè)廢棄物固體 變溫發(fā)酵生產(chǎn)脂肽，以剝片高嶺土為無機(jī)載體，開發(fā)研制出一種防治番茄青枯病的新型生 防制劑的制備方法及該種生防制劑。
[0006] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 1.本發(fā)明提供一種脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑，該生防制劑由脂肽、剝片高嶺土 和水組成。
[0008] 2.上述1提供的脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑，該生防制劑中脂肽的質(zhì)量百分比為 〇. 1 %、剝片高嶺土的質(zhì)量百分比為2%，其余為水。
[0009] 3.上述2提供的脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑，其中，脂肽由農(nóng)業(yè)廢棄物固體變溫發(fā) 酵所得，對番茄青枯病病原菌具有抑制作用。
[0010] 4.上述3提供的脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑，其中，所述農(nóng)業(yè)廢棄物為黃豆粉和秸 桿。
[0011] 5.本發(fā)明還提供上述1-4任一項(xiàng)提供脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑的制備方法，該 制備方法包括如下步驟：（1)脂肽粉末制備：發(fā)酵種子液制備；發(fā)酵基質(zhì)準(zhǔn)備；接種發(fā)酵種 子液；發(fā)酵；從發(fā)酵后基質(zhì)中獲得脂肽粉末；（2)剝片高嶺土制備：高嶺土與水、尿素混合， 加熱同時快速攪拌，得處理好的高嶺土 -尿素插層復(fù)合物；將高嶺土-尿素插層復(fù)合物加入 稀硫酸溶液中，混合均勻后進(jìn)行超聲處理，離心分離后用無水乙醇清洗，干燥，研磨得剝片 商嶺土；（3)脂膚-商嶺土復(fù)合生防制劑獲得：將上述獲得的脂膚粉末和剝片商嶺土進(jìn)行混 合均勻，搖床振蕩，得到脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑。
[0012] 6.上述5提供的脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑的制備方法，具體包括如下步驟 (1)脂肽粉末制備：將冷凍保藏的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌株 XZ-173(保藏號CGMCC NO. 4160)劃線于LB平板上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)活化，挑取單菌落接種 于LB液體培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得發(fā)酵種子液；稱取4. 5?6kg黃豆粉，3?4. 5kg結(jié)桿， 0. 15?0. 2kg淀粉和0. 15?0. 2kg酵母提取物，放入發(fā)酵罐中，加入1?2L無機(jī)鹽溶液， 調(diào)節(jié)
[0013] 基質(zhì)pH為7?8,保證含水率為40%?60%，充分混勻基質(zhì)，滅菌待用；待發(fā)酵罐 內(nèi)溫度冷卻并保持穩(wěn)定后，在無菌條件下按5%?25% (v/w)的量接入種子液，攪拌均勻， 調(diào)節(jié)罐內(nèi)相對濕度大于80%，通氣量0. 1?0. 5vvm和罐壓0. 01?0. 05Mpa，前24h溫度設(shè) 為25?40°C進(jìn)行發(fā)酵，24h后將溫度設(shè)為28?40°C發(fā)酵16?24h ;稱取發(fā)酵后的基質(zhì)與 水混合，室溫振蕩1?2h，離心去除不溶物質(zhì)，調(diào)節(jié)上清液pH為1?3,出現(xiàn)白色絮狀沉淀， 低溫靜置過夜，然后離心收集沉淀，沉淀用有機(jī)溶劑進(jìn)行抽提，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，殘 留物用水溶解并調(diào)PH為中性，冷凍干燥得脂肽粉末；
[0014] (2)剝片高嶺土制備：將過200目篩的高嶺土分別加入其重量4%?15%的水 和其重量4%?15%的尿素，然后在90?KKTC下加熱同時快速攪拌1?24h，獲得高嶺 土 -尿素插層復(fù)合物；取處理好的高嶺土 -尿素插層復(fù)合物按〇. 25%?4% (w/v)的量加 到稀硫酸溶液中，混合均勻后用超聲波清洗器進(jìn)行超聲處理，處理過程溫度為60?80°C， 持續(xù)時間為10?30min，離心后沉淀用無水乙醇清洗數(shù)遍，干燥后研磨即得剝片高嶺土；
[0015] (3)脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑獲得：向水中依次加入脂肽和剝片高嶺土，攪拌搖 勻后在搖床上以20?40°C，150?250rpm振蕩10?30h，即得到脂肽-高嶺土復(fù)合生防制 劑。
[0016] 解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌株 XZ-173,在 2010 年 9 月 14 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC 4160,地址： 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。
[0017] 7.進(jìn)一步地，上述6提供的脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑的制備方法，該制備 方法具體包括如下步驟⑴脂肽粉末制備：將冷凍保藏的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌株XZ-173劃線于LB平板上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)活化，挑取單菌落接種于 LB液體培養(yǎng)基，在30°C，170rpm的條件下培養(yǎng)24h，獲得發(fā)酵種子液；稱取5. 67kg黃豆粉， 3. 67kg秸桿，0. 17kg淀粉和0. 18kg酵母提取物，放入50L發(fā)酵罐中，加入IL無機(jī)鹽溶液， 調(diào)節(jié)基質(zhì)pH為7. 5,保證含水率為55%，將轉(zhuǎn)速設(shè)為50?70rpm攪拌60?80min充分混 勻基質(zhì)，滅菌；其中，無機(jī)鹽溶液包括（g/L) =KH2PO4 1. 0, MgSO4 · 7H20 0. 5, KCl 0. 5, L-苯 丙氨酸2父10-3，]?1^045\1(^，(^04 0.16\1(^^6504 0.15\1(^;待發(fā)酵罐內(nèi)溫度冷卻并 保持穩(wěn)定后，在無菌條件下按10% (v/V)的量接入種子液，攪拌均勻，調(diào)節(jié)罐內(nèi)相對濕度大 于80%，通氣量0. 1?0. 5vvm和罐壓0. 01?0. 05Mpa，前24h溫度設(shè)為30°C進(jìn)行發(fā)酵，24h 后將溫度設(shè)為37°C發(fā)酵20h ;稱取一定量發(fā)酵后的基質(zhì)與水按I : 10 (w/v)的比例混合，室 溫振蕩Ih，離心去除不溶物質(zhì)，在上清液中添加 HCl至pH為2. 0,出現(xiàn)白色絮狀沉淀，4°C靜 置過夜，再以IOOOOrpm離心20min收集沉淀，沉淀用二氯甲烷進(jìn)行抽提，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī) 溶劑，殘留物用水溶解并調(diào)PH為中性，冷凍干燥得脂肽粉末；
[0018] (2)剝片高嶺土制備：將過200目篩的高嶺土分別加入其重量10%的水和其重量 10%的尿素，然后在95°c下加熱同時快速攪拌lh，獲得高嶺土-尿素插層復(fù)合物；取處理好 的高嶺土-尿素插層復(fù)合物Ig加入100ml lmol/L的硫酸溶液中，混合均勻后用超聲波清 洗器進(jìn)行超聲處理，處理過程溫度為80°C，持續(xù)時間為15min，離心后沉淀用無水乙醇清洗 2?3遍，60°C干燥后，研磨即得剝片高嶺土；
[0019] (3)脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑獲得：向水中依次加入脂肽和剝片高嶺土，攪拌搖 勻后在搖床上以30°C，170rpm振蕩24h，即得到脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑。
[0020] 8.本發(fā)明還提供上述1-4任一項(xiàng)提供的脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑在防治番茄青 枯病上的應(yīng)用。
[0021] 9.本發(fā)明還提供一種防治番茄青枯病的防治劑，包括上述1-4任一項(xiàng)提供的脂 肽-高嶺土復(fù)合生防制劑。
[0022] 10.本發(fā)明還提供由上述5-7任一項(xiàng)所述方法制備的脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑 在防治番茄青枯病上的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明的有益效果：
[0024] 1.本發(fā)明制備脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑的原料之一，即剝片高嶺土是將高嶺土 經(jīng)過插層剝離后形成的，其比表面積增大，既具有粘土礦物特有吸附性、分散性、流變性、 多孔性和表面酸性，又具有納米亞微米級材料的表面效應(yīng)，出現(xiàn)許多活性中心。經(jīng)過紅外光 譜檢測，剝片高嶺土與脂肽有效結(jié)合在一起，很好地維持了脂肽結(jié)構(gòu)，并且更好地發(fā)揮了脂 肽的生物特性。經(jīng)過試驗(yàn)，本發(fā)明提供的脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑對番茄青枯病的防治 效果均明顯高于單獨(dú)使用脂肽溶液或者高嶺土-脂肽復(fù)合液，說明脂肽-高嶺土復(fù)合生防 制劑中剝片高嶺土與脂肽的結(jié)合能夠更好地提高脂肽的穩(wěn)定性，延長脂肽的作用時間，該 脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑能有效地提高番茄青枯病的防治效果。
[0025] 2.本發(fā)明制備的脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑經(jīng)過試驗(yàn)，可以促進(jìn)番茄植株地上部 和地下部的生長，與未經(jīng)處理的對照組CK相比具有顯著差異，說明該脂肽-高嶺土復(fù)合生 防制劑在防治番茄青枯病的同時能夠促進(jìn)番茄植株生長。
[0026] 3.本發(fā)明制備脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑原料之一脂肽類物質(zhì)是利用固體發(fā)酵 農(nóng)業(yè)廢棄物來生產(chǎn)的，本發(fā)明采用黃豆粉和秸桿混合物作為主要固體發(fā)酵基質(zhì)，有效提高 了脂肽類物質(zhì)的產(chǎn)量，節(jié)約了生產(chǎn)成本，降低了環(huán)境壓力并提高了資源的利用率。
[0027] 4.本發(fā)明生產(chǎn)的脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑具有環(huán)境污染小，低毒、安全，生產(chǎn)成 本低，防治效果好的優(yōu)點(diǎn)，適合番茄種植區(qū)域大面積使用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1高嶺土掃描電鏡（SEM)圖
[0029] 圖2剝片高嶺土掃描電鏡（SEM)圖
[0030] 圖3樣品紅外光譜（FT-IR)圖，圖中a代表脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑離心干燥 后的粉末，b代表剝片1?嶺土粉末
[0031] 圖4脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑對番茄青枯病病原菌的抑菌效果圖
[0032] 圖5溫室防治試驗(yàn)各處理病情指數(shù)（DI)變化圖
[0033] 圖6溫室防治試驗(yàn)各處理植株株高，不同小寫字母表示顯著差異（p < 0. 05)
[0034] 圖7溫室防治試驗(yàn)各處理地上部鮮重，不同小寫字母表示顯著差異（p < 0. 05)
[0035] 圖8溫室防治試驗(yàn)各處理地下部鮮重，不同小寫字母表示顯著差異（p < 0. 05)
[0036] 解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌株 XZ-173,在 2010 年 9 月 14 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC 4160,地址： 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。

【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照本領(lǐng)域的公知手段。
[0038] 黃豆粉和秸桿，先在60°C烘箱中烘12h去除大部分水分，磨樣、粉碎，過20目篩，過 篩后的樣品再放入烘相中60°C烘48h至恒重，保存待用。
[0039] 實(shí)施例1
[0040] 脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑的制備方法：（1)脂肽粉末制備：將冷凍保藏的解淀 粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌株 XZ_173(保藏號 CGMCCN0. 4160)劃線于 LB平板上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)活化，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，在30°C，170rpm的條件 下培養(yǎng)24h，獲得發(fā)酵種子液；稱取4. 5kg黃豆粉，3kg結(jié)桿，0. 15kg淀粉和0. 15kg酵母提 取物，放入50L發(fā)酵罐中，加入IL無機(jī)鹽溶液，調(diào)節(jié)基質(zhì)pH為7,保證含水率為40%，將轉(zhuǎn) 速設(shè)為50rpm攪拌60min充分混勻基質(zhì)，滅菌；其中，無機(jī)鹽溶液包括（g/L) =KH2PO4 1. 0， MgSO4 · 7H20 0· 5, KCl 0· 5, L-苯丙氨酸 2X 1(Γ3, MnSO4 5X 1(Γ3, CuSO4 0· 16X 1(Γ3, FeSO4 0.15Χ KT3;待發(fā)酵罐內(nèi)溫度冷卻并保持穩(wěn)定后，在無菌條件下按5% (v/w)的量接入種子 液，攪拌均勻，調(diào)節(jié)罐內(nèi)相對濕度大于80%，通氣量0. Ivvm和罐壓0. OIMpa，前24h溫度設(shè) 為25°C進(jìn)行發(fā)酵，24h后將溫度設(shè)為28°C發(fā)酵16h;稱取發(fā)酵后的基質(zhì)與水按I : 10(w/v) 的比例混合，室溫振蕩lh，離心去除不溶物質(zhì)，在上清液中添加 HCl至pH為1，出現(xiàn)白色絮 狀沉淀，低溫靜置過夜，再以IOOOOrpm離心20min收集沉淀，沉淀用二氯甲燒進(jìn)行抽提，旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，殘留物用水溶解并調(diào)PH為中性，冷凍干燥得脂肽粉末；
[0041] (2)剝片高嶺土制備：將過200目篩的高嶺土分別加入其重量4%的水和其重量 4%的尿素，然后在90°C下加熱同時快速攪拌lh，獲得高嶺土-尿素插層復(fù)合物；取處理好 的高嶺土-尿素插層復(fù)合物按0.25% (w/v)的量加到稀硫酸溶液中，混合均勻后用超聲波 清洗器進(jìn)行超聲處理，處理過程溫度為60°C，持續(xù)時間為lOmin，離心后沉淀用無水乙醇清 洗數(shù)遍，60°C干燥后，研磨即得剝片高嶺土；
[0042] (3)脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑獲得：向水中依次加入脂肽和剝片高嶺土，攪拌搖 勻后在搖床上以20°C，150rpm振蕩10h，即得到脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑。
[0043] 實(shí)施例2
[0044] 脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑的制備方法：（1)脂肽粉末制備：將冷凍保藏的解淀粉 芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌株XZ-173劃線于LB平板上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)活 化，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，在30°C，170rpm的條
[0045] 件下培養(yǎng)24h，獲得發(fā)酵種子液；稱取6kg黃豆粉，4. 5kg結(jié)桿，0. 2kg淀粉和0. 2kg 酵母提取物，放入50L發(fā)酵罐中，加入2L無機(jī)鹽溶液，調(diào)節(jié)基質(zhì)pH為8,含水率為60 %，將 轉(zhuǎn)速設(shè)為70rpm攪拌80min充分混勻基質(zhì)，滅菌；其中，無機(jī)鹽溶液包括（g/L) =KH2PO4 1.0， MgSO4 · 7H20 0· 5, KCl 0· 5, L-苯丙氨酸 2X 1(Γ3, MnSO4 5X 1(Γ3, CuSO4O. 16X 1(Γ3, FeSO4 0. 15ΧΚΓ3 ;待發(fā)酵罐內(nèi)溫度冷卻并保持穩(wěn)定后，在無菌條件下按25% (v/w)的量接入種子 液，攪拌均勻，調(diào)節(jié)罐內(nèi)相對濕度大于80%，通氣量0. 5vvm和罐壓0. 05Mpa，溫度設(shè)為40°C 發(fā)酵48h;稱取發(fā)酵后的基質(zhì)與水按I : 10(w/v)的比例混合，室溫振蕩2h，離心去除不溶 物質(zhì)，在上清液中添加 HCl至pH為3,出現(xiàn)白色絮狀沉淀，低溫靜置過夜，再以IOOOOrpm離 心20min收集沉淀，沉淀用二氯甲烷進(jìn)行抽提，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，殘留物用水溶解并 調(diào)PH為中性，冷凍干燥得脂肽粉末；
[0046] (2)剝片高嶺土制備：將過200目篩的高嶺土分別加入其重量15%的水和其重量 15%的尿素，然后在KKTC下加熱同時快速攪拌24h，獲得高嶺土-尿素插層復(fù)合物；取處理 好的高嶺土-尿素插層復(fù)合物按4% (w/v)的量加到稀硫酸溶液中，混合均勻后用超聲波清 洗器進(jìn)行超聲處理，處理過程溫度為80°C，持續(xù)時間為30min，離心后沉淀用無水乙醇清洗 數(shù)遍，60°C干燥后，研磨即得剝片高嶺土；
[0047] (3)脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑獲得：向水中依次加入脂肽和剝片高嶺土，攪拌搖 勻后在搖床上以40°C，250rpm振蕩30h，即得到脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑。
[0048] 實(shí)施例3
[0049] 脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑的制備方法：（1)脂肽粉末制備：將冷凍保藏的解淀粉 芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌株XZ-173劃線于LB平板上，置于培養(yǎng)箱內(nèi) 活化，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，在30°C，170rpm的條件下培養(yǎng)24h，作為發(fā)酵種子 液；稱取5. 67kg黃豆粉，3. 67kg秸桿，0. 17kg淀粉和0. 18kg酵母提取物，放入50L發(fā)酵罐 中，加入IL無機(jī)鹽溶液，調(diào)節(jié)基質(zhì)pH為7. 5,含水率為55 %，將轉(zhuǎn)速設(shè)為70rpm攪拌60min 充分混勻基質(zhì)，滅菌；其中，無機(jī)鹽溶液包括（g/L) =KH2PO4 1. 0, MgSO4 · 7H20 0. 5, KCl 0. 5， L-苯丙氨酸 2 X 1(T3, MnSO4 5 X 1(T3, CuSO4 0.16 X 1(T3, FeSO4 0.15 X KT3;待發(fā)酵罐內(nèi)溫度 冷卻并保持穩(wěn)定后，在無菌條件下按10% (v/V)的量接入種子液，攪拌均勻，調(diào)節(jié)罐內(nèi)相對 濕度大于80%，通氣量0. 3vvm和罐壓0. 03Mpa，前24h溫度設(shè)為30°C進(jìn)行發(fā)酵，24h后將溫 度設(shè)為37°C發(fā)酵20h;稱取發(fā)酵后的基質(zhì)與水按I : 10(w/v)的比例混合，室溫振蕩lh，離 心去除不溶物質(zhì)，在上清液中添加 HCl至pH為2. 0,出現(xiàn)白色絮狀沉淀，4°C靜置過夜，再以 IOOOOrpm離心20min收集沉淀，沉淀用二氯甲燒進(jìn)行抽提，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，殘留物 用水溶解并調(diào)PH為中性，冷凍干燥得脂肽粉末；
[0050] (2)剝片高嶺土制備：將過200目篩的高嶺土分別加入其重量10%的水和其重量 10%的尿素，然后在95°C下加熱同時快速攪拌lh，獲得高嶺土-尿素插層復(fù)合物；取處理好 的高嶺土-尿素插層復(fù)合物Ig加入100ml lmol/L的硫酸溶液中，混合均勻后用超聲波清 洗器進(jìn)行超聲處理，處理過程溫度為80°C，持續(xù)時間為15min，離心后沉淀用無水乙醇清洗 3遍，60°C干燥后，研磨即得剝片高嶺土；
[0051] (3)脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑獲得：向水中依次加入脂肽和剝片高嶺土，攪拌搖 勻后在搖床上以30°C，170rpm振蕩24h，即得到脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑。
[0052] 實(shí)施例4
[0053] 采用超純水、高嶺土（化學(xué)純）、尿素（分析純）按照實(shí)施例3的制備方法得到脂 肽、剝片高嶺土和脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑。
[0054] 1、結(jié)構(gòu)表征
[0055] I. 1掃描電子顯微鏡（SEM)分析
[0056] 高嶺土、剝片高嶺土取少量待測粉末樣品噴金處理后使用日本日立公司S-4800 場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察樣品的形貌尺寸。如圖1、圖2所示，高嶺土顆粒堆垛現(xiàn)象嚴(yán)重， 片層較厚，經(jīng)過插層剝離之后形成的剝片高嶺土，顆粒堆垛現(xiàn)象沒那么嚴(yán)重，小顆粒增多， 片層變薄，而且剝片高嶺土的片層結(jié)構(gòu)依然完好。
[0057] 1. 2紅外光譜（FT-IR)分析
[0058] 脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑離心分離后，用超純水洗滌沉淀數(shù)次，直至洗出的溶 液中用HPLC未檢測到脂肽，然后在60°C下干燥，研磨后將粉末及剝片高嶺土粉末用KBr 壓片，采用Thermo Fisher ISlO紅外光譜儀分析主要官能團(tuán)的變化，波數(shù)范圍500? 4000CHT1。如圖3所示，曲線（a)和（b)比較可知，脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑經(jīng)過處理之 后得到的粉末在1455cm \ 1540cm \ 1678cm、1740cm \3567cm 1處出現(xiàn)了一些新的小峰，分 別為脂肪酸鏈中C-H、N-H、酰胺結(jié)構(gòu)中C = 0、羧酸中C = 0、氫鍵連接的O-H的特征吸收， 表明脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑處理后得到的粉末為脂肽與剝片高嶺土復(fù)合物，進(jìn)一步表 明脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑中脂肽與剝片高嶺土結(jié)合在一起。
[0059] 2、脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑對番茄青枯病病原菌的抑制活性檢測
[0060] 2. 1番茄青枯病病原菌菌液制備
[0061] 在TTC平板上挑取病原菌菌株，接入液體NA培養(yǎng)基中，30°C，170rpm搖床培養(yǎng)至對 數(shù)期，用無菌水將菌懸液稀釋至IO 6?l〇7cfu/ml，即制得試驗(yàn)用病原菌菌懸液。
[0062] 2. 2抑制活性檢測
[0063] 將剝片高嶺土 121°C，20min滅菌，脂肽溶液過0. 22μπι濾膜除菌后，加入無菌水在 無菌條件下制備脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑。將病原菌菌懸液200 μ 1均勻涂布于NA培養(yǎng) 基平板上，然后吸取1〇〇μ 1生防制劑注入平板上牛津杯中，30°C培養(yǎng)24h，觀察抑菌狀況并 測量抑菌圈大小，重復(fù)3次，測定抑菌圈大小均在16. 37±0. 72 (mm)范圍內(nèi)。如圖4所示， 該脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑對番茄青枯病病原菌具有較強(qiáng)的抑制效果，抑菌圈明顯，初 步說明該脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑可以用來防治番茄青枯病。
[0064] 實(shí)施例5
[0065] 按照實(shí)施例3的制備方法得到脂肽、剝片高嶺土和脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑。
[0066] 1、高嶺土-脂肽復(fù)合液的制備
[0067] 向水中依次加入脂肽和高嶺土，攪拌搖勻后在搖床上以30°C，170rpm振蕩24h，即 得到高嶺土-脂肽復(fù)合液。該復(fù)合液中脂肽的質(zhì)量百分比為0. 1%、高嶺土的質(zhì)量百分比為 2%，其余為水。
[0068] 2、脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑對番茄青枯病的溫室防治試驗(yàn)
[0069] 防治試驗(yàn)在江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室溫室大棚內(nèi)進(jìn) 行，實(shí)驗(yàn)設(shè)7個處理，方案如下：（1)CK，番茄幼苗不做任何處理，作為對照；（2)A1，取Img/ mL的脂肽溶液均勻噴施于每株番茄幼苗的葉面和莖基部，整個處理共噴施300mL ; (3)A2， 取IOmL lmg/mL的脂肽溶液灌入每株番茄幼苗根部；(4)BI，取高嶺土 -脂肽復(fù)合液均勻噴 施于每株番茄幼苗的葉面和莖基部，整個處理共噴施300mL ; (5)B2,取IOmL高嶺土-脂肽 復(fù)合液灌入每株番茄幼苗根部；￠) Cl，取脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑均勻噴施于每株番茄 幼苗的葉面和莖基部，整個處理共噴施300mL ; (7) C2,取IOmL脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑 灌入每株番茄幼苗根部。每個處理30盆，每盆裝2kg 土，施入等量氮、磷、鉀化肥（包括：尿 素、過磷酸鈣、氯化鉀），每盆移栽1株番茄幼苗，
[0070] 移栽7天后在土中灌入番茄青枯病病原菌菌懸液，使病原菌濃度達(dá)到106cfu/g 土 以上，灌菌24h后對番茄幼苗按上述7個處理方案進(jìn)行處理1次。
[0071] 在處理后第10天、20天、30天、40天按病情分級標(biāo)準(zhǔn)，記錄發(fā)病情況，統(tǒng)計各處理 病情指數(shù)（DI)和防治效果，并統(tǒng)計處理40天后各處理植株株高和地上部地下部鮮重。
[0072] 病情分級標(biāo)準(zhǔn)及病情指數(shù)計算方法如下：
[0073] 0級：植株正常；
[0074] 1級：植株25%以下的葉片表現(xiàn)為萎蔫癥狀；
[0075] 2級：植株26%?50%的葉片表現(xiàn)為萎蔫癥狀；
[0076] 3級：植株51 %?75%的葉片表現(xiàn)為萎蔫癥狀；
[0077] 4級：植株76%以上葉片表現(xiàn)為萎蔫癥狀或植株死亡。
[0078] 病情指數(shù)（DI) = [ Σ (各病級植株數(shù)X各級代表數(shù)值）V (調(diào)查總株數(shù)X最高 級別數(shù)值）X 100%
[0079] 防治效果=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)X 100%
[0080] 3、結(jié)果與分析：
[0081] 如表1和圖5所示，隨著番茄植株的生長，與CK相比，其他各處理的病情指數(shù)都有 所降低，說明脂肽是防治番茄青枯病的良好物質(zhì)。處理后第40天采取噴施和灌施脂肽-高 嶺土復(fù)合生防制劑的病情指數(shù)很低，相對防治效果分別為87. 76 %和82. 32%，相較于其他 處理的防治效果具有顯著差異，說明脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑中剝片高嶺土與脂肽的結(jié) 合能夠更好地提高脂肽的穩(wěn)定性，延長脂肽的作用時間，該脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑能 有效地防治番茄青枯病。
[0082] 如圖6、7和8所示，處理40天后，采取噴施和灌施脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑的植 株株高，地上部和地下部鮮重均比其他處理高，且與CK相比具有顯著差異，說明該脂肽-高 嶺土復(fù)合生防制劑在防治番茄青枯病的同時能夠促進(jìn)番茄植株生長。
[0083] 表1不同處理對番茄青枯病的溫室防治效果

【權(quán)利要求】
1. 一種脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑，其特征在于：該生防制劑由脂肽、剝片高嶺土和水 組成。
2. 權(quán)利要求1所述的脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑，其特征在于：該生防制劑中脂肽的 質(zhì)量百分比為〇. 1%、剝片高嶺土的質(zhì)量百分比為2%，其余為水。
3. 權(quán)利要求2所述的脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑，其特征在于：脂肽由農(nóng)業(yè)廢棄物固 體變溫發(fā)酵所得，對番茄青枯病病原菌具有抑制作用。
4. 權(quán)利要求3所述的脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑，其特征在于：所述農(nóng)業(yè)廢棄物為黃 豆粉和秸桿。
5. 權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑的制備方法，其特征在于：該 制備方法包括如下步驟：（1)脂肽粉末制備：發(fā)酵種子液制備；發(fā)酵基質(zhì)準(zhǔn)備；接種發(fā)酵種 子液；發(fā)酵；從發(fā)酵后基質(zhì)中獲得脂肽粉末；（2)剝片高嶺土制備：高嶺土與水、尿素混合， 加熱同時快速攪拌，得處理好的高嶺土-尿素插層復(fù)合物；將高嶺土-尿素插層復(fù)合物加入 稀硫酸溶液中，混合均勻后進(jìn)行超聲處理，離心分離后用無水乙醇清洗，干燥，研磨得剝片 商嶺土；（3)脂膚-商嶺土復(fù)合生防制劑獲得：將上述獲得的脂膚粉末和剝片商嶺土進(jìn)行混 合均勻，搖床振蕩，得到脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑。
6. 權(quán)利要求5所述的脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑的制備方法，其特征在于：該制備 方法具體包括如下步驟（1)脂肽粉末制備：將冷凍保藏的解淀粉芽孢桿菌XZ-173,保藏號 CGMCC NO. 4160,菌株劃線于LB平板上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)活化，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng) 基，擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得發(fā)酵種子液；稱取4. 5?6kg黃豆粉，3?4. 5kg結(jié)桿，0. 15?0. 2kg淀粉 和0. 15?0. 2kg酵母提取物，放入發(fā)酵罐中，加入1?2L無機(jī)鹽溶液，調(diào)節(jié)基質(zhì)pH為7? 8,保證含水率為40 %?60%，充分混勻基質(zhì)，滅菌待用；待發(fā)酵罐內(nèi)溫度冷卻并保持穩(wěn)定 后，在無菌條件下按體積/質(zhì)量（v/V)為5%?25%的量接入種子液，攪拌均勻，調(diào)節(jié)罐內(nèi) 相對濕度大于80%，通氣量0. 1?0. 5vvm和罐壓0. 01?0. 05Mpa，前24h溫度設(shè)為25? 40°C進(jìn)行發(fā)酵，24h后將溫度設(shè)為28?40°C發(fā)酵16?24h ;稱取發(fā)酵后的基質(zhì)與水混合， 室溫振蕩1?2h，離心去除不溶物質(zhì)，調(diào)節(jié)上清液pH為1?3,出現(xiàn)白色絮狀沉淀，低溫靜 置過夜，然后離心收集沉淀，沉淀用有機(jī)溶劑進(jìn)行抽提，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，殘留物用 水溶解并調(diào)PH為中性，冷凍干燥得脂肽粉末； (2) 剝片高嶺土制備：將過篩的高嶺土分別加入其重量4%?15%的水和其重量4%? 15%的尿素，然后在90?100°C下加熱同時快速攪拌1?24h，獲得高嶺土-尿素插層復(fù)合 物；取處理好的高嶺土-尿素插層復(fù)合物按質(zhì)量/體積（w/v)0. 25%?4%的量加到稀硫酸 溶液中，混合均勻后用超聲波清洗器進(jìn)行超聲處理，處理過程溫度為60?80°C，持續(xù)時間 為10?30min，離心后沉淀用無水乙醇清洗數(shù)遍，干燥后研磨即得剝片高嶺土； (3) 脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑獲得：向水中依次加入脂肽和剝片高嶺土，攪拌搖勻后 在搖床上以20?40°C，150?250rpm振蕩10?30h，即得到脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑。
7. 權(quán)利要求6所述的脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑的制備方法，其特征在于：該制備方 法具體包括如下步驟（1)脂肽粉末制備：將冷凍保藏的解淀粉芽孢桿菌XZ-173菌株劃線 于LB平板上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)活化，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，在30°C，170rpm的條 件下培養(yǎng)24h，獲得發(fā)酵種子液；稱取5. 67kg黃豆粉，3. 67kg秸桿，0. 17kg淀粉和0. 18kg 酵母提取物，放入50L發(fā)酵罐中，加入IL無機(jī)鹽溶液，調(diào)節(jié)基質(zhì)pH為7. 5,保證含水率為 55%，將轉(zhuǎn)速設(shè)為50?70rpm攪拌60?80min充分混勻基質(zhì)，滅菌；其中，無機(jī)鹽溶液包括： KH2PO4L Og/L，MgSO4 ? 7H20 0? 5g/L，KCl 0? 5g/L，L-苯丙氨酸 2 X l(T3g/L，MnS045 X l(T3g/L， CuSO4O. 16Xl(T3g/L，F(xiàn)eSO4O. 15Xl(T3g/L ;待發(fā)酵罐內(nèi)溫度冷卻并保持穩(wěn)定后，在無菌條件 下按體積/質(zhì)量（v/V) 10 %的量接入種子液，攪拌均勻，調(diào)節(jié)罐內(nèi)相對濕度大于80 %，通氣 量0. 1?0. 5vvm和罐壓0. 01?0. 05Mpa，前24h溫度設(shè)為30°C進(jìn)行發(fā)酵，24h后將溫度設(shè) 為37°C發(fā)酵20h ;稱取一定量發(fā)酵后的基質(zhì)與水按質(zhì)量/體積（w/v) 1:10的比例混合，室溫 振蕩Ih，離心去除不溶物質(zhì)，在上清液中添加HCl至pH為2. 0,出現(xiàn)白色絮狀沉淀，4°C靜置 過夜，再以IOOOOrpm離心20min收集沉淀，沉淀用二氯甲烷進(jìn)行抽提，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶 齊U，殘留物用水溶解并調(diào)PH為中性，冷凍干燥得脂肽粉末； (2) 剝片高嶺土制備：將過200目篩的高嶺土分別加入其重量10%的水和其重量10% 的尿素，然后在95°C下加熱同時快速攪拌lh，獲得高嶺土-尿素插層復(fù)合物；取處理好的高 嶺土-尿素插層復(fù)合物Ig加入100ml lmol/L的硫酸溶液中，混合均勻后用超聲波清洗器 進(jìn)行超聲處理，處理過程溫度為80°C，持續(xù)時間為15min，離心后沉淀用無水乙醇清洗2? 3遍，60°C干燥后，研磨即得剝片高嶺土； (3) 脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑獲得：向水中依次加入脂肽和剝片高嶺土，攪拌搖勻后 在搖床上以30°C，170rpm振蕩24h，即得到脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑。
8. 權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑在防治番茄青枯病上的應(yīng)用。
9. 一種防治番茄青枯病的防治劑，其特征在于：該防治劑包括權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所 述的脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑。
10. 采用權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)方法制備的脂肽-高嶺土復(fù)合生防制劑在防治番茄青枯 病上的應(yīng)用。
【文檔編號】A01N25/08GK104322562SQ201410473482
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月16日
【發(fā)明者】吳彥良, 冉煒, 朱震, 孫立飛, 余光輝, 沈其榮 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)