本發(fā)明涉及植物培養(yǎng)
技術領域：
，具體涉及一種草莓繼代增殖培養(yǎng)基及其應用。
背景技術：
：眾所周知，植物細胞全能性是指植物的每個細胞都包含著該物種的全部遺傳信息，從而具備發(fā)育成完整植株的遺傳能力；細胞全能性概念成為植物組織培養(yǎng)的理論依據。根據該理論，使離體的植物莖尖，通過植物激素的調控作用，培養(yǎng)在人工控制的環(huán)境中，使其脫分化和再分化，形成完整植株的過程。草莓又叫洋莓、地莓等，屬薔薇科、草莓屬、多年生草本植物。草莓果鮮美紅嫩，果肉多汁，含有特殊的濃郁水果芳香，且富含維生素c、維生素a、胡蘿卜素等，有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值。國外最新研究指出：草莓中含有一種胺類物質，對治療白血病和再生障礙性貧血有一定的功效。因此，草莓作為一種老少皆宜的時令水果，市場價位高、需求量大。然而，草莓病毒病作為影響草莓生產的主要病害，嚴重導致草莓減產。浸染草莓的病毒病主要有四種：草莓斑駁病毒、草莓皺縮病毒、草莓輕和黃邊病毒以及草莓鑲脈病毒。據項目組調查：麻江下司，貴陽花溪等地，有良好的草莓種植基礎，種植面積約2萬畝，由于病毒浸染，導致產量下降，嚴重挫傷了莓農的種植積極性，種植面積逐年減少。僅下司花橋一帶，種植面積減少了近1000畝。一些品質較好的品種(如春香)也由于產量低而被淘汰?；诖?，組織培養(yǎng)技術作為脫病毒、提高草莓產量的有效途徑得到了人們的廣泛關注。脫病毒苗在生產上具有長勢旺、果子大、結果期長和產量高等優(yōu)點。然而，由于科研、生產流通以及經濟成本等領域的嚴重脫節(jié)，轉化機制不暢，脫毒苗的推廣應用進展緩慢。因此，研究一種新型的、節(jié)約成本且便于推廣普及的方法尤為重要。技術實現要素：針對現有技術中的缺陷，本發(fā)明旨在提供一種草莓繼代增殖培養(yǎng)基及其應用。采用本發(fā)明提供的繼代增殖培養(yǎng)基，可以使草莓試管苗的增值率提高約8倍，平均株高增加約25.85％、平均葉片數增加約16.03％、平均單株繁殖匍匐莖數增加約109.51％、最終草莓產量增產約53.98％，而且草莓的患病數目和成活率均顯著提高；此外，本發(fā)明的繼代增殖培養(yǎng)基應用方便，成本低廉，易于推廣普及，顯著提高了草莓種植戶的生產積極性。為此，本發(fā)明提供如下技術方案：第一方面，本發(fā)明提供一種繼代增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)基按每升計，包括下述原料組分：6-芐氨基嘌呤0.1mg～1.0mg、萘乙酸0.001mg～0.05mg、白糖15g～35g、瓊脂3.0g～5.0g，余量為ms培養(yǎng)基。在本發(fā)明的進一步實施方式中，包括下述原料組分：6-芐氨基嘌呤0.5mg、萘乙酸0.01mg、白糖30g、瓊脂3.8g，余量為ms培養(yǎng)基。在本發(fā)明的進一步實施方式中，原料組分還包括：茉莉酸0.005mg～0.01mg、硅藻土3g～8g、電氣石粉5g～10g以及赤霉素0.002mg～0.005mg。在本發(fā)明的進一步實施方式中，包括下述原料組分：6-芐氨基嘌呤0.5mg、萘乙酸0.01mg、白糖30g、瓊脂3.8g、茉莉酸0.008mg、硅藻土5g、電氣石粉10g、赤霉素0.003mg、余量為ms培養(yǎng)基。在本發(fā)明的進一步實施方式中，調節(jié)培養(yǎng)基的ph值為6.0～6.2。第二方面，本發(fā)明提供的繼代增殖培養(yǎng)基在草莓脫毒組培快繁方法中的應用。在本發(fā)明的進一步實施方式中，包括以下步驟：s101：選取草莓植株的匍匐莖作為外植體，依次進行熱處理和消毒處理；s102：從消毒處理后的外植體剝離莖尖，然后誘導得到不定芽；s103：將誘導得到的不定芽移栽至繼代增殖培養(yǎng)基中進行多代繼代增殖培養(yǎng)，得到試管苗；s104：將試管苗分株接種于誘根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)；s105：將生根培養(yǎng)后的試管苗進行煉苗馴化，之后移栽至基質中進行管理培養(yǎng)，得到草莓苗。在本發(fā)明的進一步實施方式中，s103中，多代繼代增殖培養(yǎng)具體為2～5代；培養(yǎng)的條件具體包括：空氣相對濕度為80％～95％，光照時間為11h·d-1～13h·d-1，光照強度為2000lux～3000lux，溫度為21℃～25℃。在本發(fā)明的進一步實施方式中，光照包括交替照射的第一光源和第二光源，第一光源與第二光源的光照時間之比為1：1，且光照強度之比為(5～8)：1；第一光源為655nm～670nm的光源；第二光源包括430nm～460nm的光源和230nm～250nm的光源，且430nm～460nm的光源和230nm～250nm的光源的光照強度之比為(1～3)：1。本發(fā)明的上述技術方案相比現有技術具有以下優(yōu)點：(1)申請人經過大量實驗發(fā)現：采用本發(fā)明提供的繼代增殖培養(yǎng)基，可以使草莓試管苗的增值率提高約8倍，而且草莓的患病數目和成活率均顯著提高；此外，本發(fā)明的繼代增殖培養(yǎng)基應用方便，成本低廉，易于推廣普及，顯著提高了草莓種植戶的生產積極性。(2)采用本發(fā)明提供的繼代增殖培養(yǎng)基，使得培養(yǎng)得到的草莓苗平均株高增加約25.85％、平均葉片數增加約16.03％、平均單株繁殖匍匐莖數增加約109.51％、最終草莓產量增產約53.98％，從而將草莓生產水平提高到一個新水平。(3)對于本發(fā)明提供的繼代增殖培養(yǎng)基，將其用于黔東南州農業(yè)生產上，平均每畝產值1.625萬元，總產值達3.25億元，從而在解決草莓品種退化，提高產量和質量等方面，取得了顯著的經濟效益。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。具體實施方式下面將對本發(fā)明技術方案的實施例進行詳細的描述。以下實施例僅用于更加清楚的說明本發(fā)明的技術方案，因此只作為實例，而不能以此來限制本發(fā)明的保護范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，數據為三次重復實驗的平均值或平均值±標準差。本發(fā)明提供一種繼代增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)基按每升計，包括下述原料組分：6-芐氨基嘌呤0.1mg～1.0mg、萘乙酸0.001mg～0.05mg、白糖15g～35g、瓊脂3.0g～5.0g，余量為ms培養(yǎng)基。其中，調節(jié)培養(yǎng)基的ph值為6.0～6.2。優(yōu)選地，原料組分還包括：茉莉酸0.005mg～0.01mg、硅藻土3g～8g、電氣石粉5g～10g以及赤霉素0.002mg～0.005mg。另外，將本發(fā)明提供的繼代增殖培養(yǎng)基應用與草莓脫毒組培快繁方法中，具體包括如下步驟：s101：選取草莓植株的匍匐莖作為外植體，依次進行熱處理和消毒處理。s102：從消毒處理后的外植體剝離莖尖，然后誘導得到不定芽。s103：將誘導得到的不定芽移栽至繼代增殖培養(yǎng)基中進行多代繼代增殖培養(yǎng)，得到試管苗。其中，多代繼代增殖培養(yǎng)具體為2～5代；培養(yǎng)的條件具體包括：空氣相對濕度為80％～95％，光照時間為11h·d-1～13h·d-1，光照強度為2000lux～3000lux，溫度為21℃～25℃。光照包括交替照射的第一光源和第二光源，第一光源與第二光源的光照時間之比為1：1，且光照強度之比為(5～8)：1；第一光源為655nm～670nm的光源；第二光源包括430nm～460nm的光源和230nm～250nm的光源，且430nm～460nm的光源和230nm～250nm的光源的光照強度之比為(1～3)：1。s104：將試管苗分株接種于誘根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)。s105：將生根培養(yǎng)后的試管苗進行煉苗馴化，之后移栽至基質中進行管理培養(yǎng)，得到草莓苗。下面結合具體實施方式進行說明：實施例一本發(fā)明提供一種草莓脫毒組培快繁方法，包括以下步驟：s101：選取草莓植株的匍匐莖作為外植體，依次進行熱處理和消毒處理。s102：從消毒處理后的外植體剝離莖尖，然后誘導得到不定芽。s103：將誘導得到的不定芽移栽至繼代增殖培養(yǎng)基中進行多代繼代增殖培養(yǎng)，得到試管苗。其中，每升繼代增殖培養(yǎng)基包括下述原料組分：6-芐氨基嘌呤0.5mg、萘乙酸0.01mg、白糖30g、瓊脂3.8g，余量為ms培養(yǎng)基，調節(jié)培養(yǎng)基的ph值為6.2。多代繼代增殖培養(yǎng)為3代；培養(yǎng)的條件具體包括：空氣相對濕度為95％，光照時間為11h·d-1，光照強度為2500lux，溫度為23℃。光照包括交替照射的第一光源和第二光源，第一光源與第二光源的光照時間之比為1：1，且光照強度之比為6：1；第一光源為655nm的光源；第二光源包括450nm的光源和250nm的光源，且450nm的光源和250nm的光源的光照強度之比為2：1。s104：將試管苗分株接種于誘根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)。s105：將生根培養(yǎng)后的試管苗進行煉苗馴化，之后移栽至基質中進行管理培養(yǎng)，得到草莓苗。實施例二本發(fā)明提供一種草莓脫毒組培快繁方法，包括以下步驟：s101：選取草莓植株的匍匐莖作為外植體，依次進行熱處理和消毒處理。s102：從消毒處理后的外植體剝離莖尖，然后誘導得到不定芽。s103：將誘導得到的不定芽移栽至繼代增殖培養(yǎng)基中進行多代繼代增殖培養(yǎng)，得到試管苗。其中，每升繼代增殖培養(yǎng)基包括下述原料組分：6-芐氨基嘌呤1.0mg、萘乙酸0.05mg、白糖15g、瓊脂5.0g，余量為ms培養(yǎng)基，調節(jié)培養(yǎng)基的ph值為6.0。多代繼代增殖培養(yǎng)為5代；培養(yǎng)的條件具體包括：空氣相對濕度為85％，光照時間為13h·d-1，光照強度為2000lux，溫度為21℃。光照包括交替照射的第一光源和第二光源，第一光源與第二光源的光照時間之比為1：1，且光照強度之比為5：1；第一光源為670nm的光源；第二光源包括430nm的光源和230nm的光源，且430nm的光源和230nm的光源的光照強度之比為1：1。s104：將試管苗分株接種于誘根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)。s105：將生根培養(yǎng)后的試管苗進行煉苗馴化，之后移栽至基質中進行管理培養(yǎng)，得到草莓苗。實施例三本發(fā)明提供一種草莓脫毒組培快繁方法，包括以下步驟：s101：選取草莓植株的匍匐莖作為外植體，依次進行熱處理和消毒處理。s102：從消毒處理后的外植體剝離莖尖，然后誘導得到不定芽。s103：將誘導得到的不定芽移栽至繼代增殖培養(yǎng)基中進行多代繼代增殖培養(yǎng)，得到試管苗。其中，每升繼代增殖培養(yǎng)基包括下述原料組分：6-芐氨基嘌呤0.1mg、萘乙酸0.05mg、白糖30g、瓊脂5.0g，余量為ms培養(yǎng)基，調節(jié)培養(yǎng)基的ph值為6.1。多代繼代增殖培養(yǎng)為4代；培養(yǎng)的條件具體包括：空氣相對濕度為80％，光照時間為12h·d-1，光照強度為3000lux，溫度為25℃。光照包括交替照射的第一光源和第二光源，第一光源與第二光源的光照時間之比為1：1，且光照強度之比為8：1；第一光源為660nm的光源；第二光源包括460nm的光源和230nm的光源，且460nm的光源和230nm的光源的光照強度之比為2：1。s104：將試管苗分株接種于誘根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)。s105：將生根培養(yǎng)后的試管苗進行煉苗馴化，之后移栽至基質中進行管理培養(yǎng)，得到草莓苗。實施例四本實施例在實施例一的基礎上改變相關參數而成。本發(fā)明提供一種草莓脫毒組培快繁方法，包括以下步驟：s101：選取草莓植株的匍匐莖作為外植體，依次進行熱處理和消毒處理。s102：從消毒處理后的外植體剝離莖尖，然后誘導得到不定芽。s103：將誘導得到的不定芽移栽至繼代增殖培養(yǎng)基中進行多代繼代增殖培養(yǎng)，得到試管苗。其中，每升繼代增殖培養(yǎng)基包括下述原料組分：6-芐氨基嘌呤0.5mg、萘乙酸0.01mg、白糖30g、瓊脂3.8g、茉莉酸0.008mg、硅藻土5g、電氣石粉10g、赤霉素0.003mg、余量為ms培養(yǎng)基，調節(jié)培養(yǎng)基的ph值為6.2。多代繼代增殖培養(yǎng)為3代；培養(yǎng)的條件具體包括：空氣相對濕度為95％，光照時間為11h·d-1，光照強度為2500lux，溫度為23℃。光照包括交替照射的第一光源和第二光源，第一光源與第二光源的光照時間之比為1：1，且光照強度之比為6：1；第一光源為655nm的光源；第二光源包括450nm的光源和250nm的光源，且450nm的光源和250nm的光源的光照強度之比為2：1。s104：將試管苗分株接種于誘根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)。s105：將生根培養(yǎng)后的試管苗進行煉苗馴化，之后移栽至基質中進行管理培養(yǎng)，得到草莓苗。實施例五本實施例在實施例二的基礎上改變相關參數而成。本發(fā)明提供一種草莓脫毒組培快繁方法，包括以下步驟：s101：選取草莓植株的匍匐莖作為外植體，依次進行熱處理和消毒處理。s102：從消毒處理后的外植體剝離莖尖，然后誘導得到不定芽。s103：將誘導得到的不定芽移栽至繼代增殖培養(yǎng)基中進行多代繼代增殖培養(yǎng)，得到試管苗。其中，每升繼代增殖培養(yǎng)基包括下述原料組分：6-芐氨基嘌呤1.0mg、萘乙酸0.05mg、白糖15g、瓊脂5.0g、茉莉酸0.01mg、硅藻土3g、電氣石粉10g以及赤霉素0.002mg，余量為ms培養(yǎng)基，調節(jié)培養(yǎng)基的ph值為6.0。多代繼代增殖培養(yǎng)為5代；培養(yǎng)的條件具體包括：空氣相對濕度為85％，光照時間為13h·d-1，光照強度為2000lux，溫度為21℃。光照包括交替照射的第一光源和第二光源，第一光源與第二光源的光照時間之比為1：1，且光照強度之比為5：1；第一光源為670nm的光源；第二光源包括430nm的光源和230nm的光源，且430nm的光源和230nm的光源的光照強度之比為1：1。s104：將試管苗分株接種于誘根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)。s105：將生根培養(yǎng)后的試管苗進行煉苗馴化，之后移栽至基質中進行管理培養(yǎng)，得到草莓苗。實施例六本實施例在實施例三的基礎上改變相關參數而成。本發(fā)明提供一種草莓脫毒組培快繁方法，包括以下步驟：s101：選取草莓植株的匍匐莖作為外植體，依次進行熱處理和消毒處理。s102：從消毒處理后的外植體剝離莖尖，然后誘導得到不定芽。s103：將誘導得到的不定芽移栽至繼代增殖培養(yǎng)基中進行多代繼代增殖培養(yǎng)，得到試管苗。其中，每升繼代增殖培養(yǎng)基包括下述原料組分：6-芐氨基嘌呤0.1mg、萘乙酸0.05mg、白糖30g、瓊脂5.0g、茉莉酸0.005mg、硅藻土8g、電氣石粉5g以及赤霉素0.005mg，余量為ms培養(yǎng)基，調節(jié)培養(yǎng)基的ph值為6.1。多代繼代增殖培養(yǎng)為4代；培養(yǎng)的條件具體包括：空氣相對濕度為80％，光照時間為12h·d-1，光照強度為3000lux，溫度為25℃。光照包括交替照射的第一光源和第二光源，第一光源與第二光源的光照時間之比為1：1，且光照強度之比為8：1；第一光源為660nm的光源；第二光源包括460nm的光源和230nm的光源，且460nm的光源和230nm的光源的光照強度之比為2：1。s104：將試管苗分株接種于誘根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)。s105：將生根培養(yǎng)后的試管苗進行煉苗馴化，之后移栽至基質中進行管理培養(yǎng)，得到草莓苗。另外，為了進一步說明本發(fā)明技術方案的優(yōu)勢，設置以下對比例。需要說明的是，對比例一至八中，除繼代增殖培養(yǎng)基不同外，其余參數均同實施例一。對比例一每1l繼代增殖培養(yǎng)基的原料組分包括：6-芐氨基嘌呤0.5mg、萘乙酸0.05mg、吲哚丁酸0.5mg、白糖30g、瓊脂3.8g，余量為ms培養(yǎng)基。對比例二每1l繼代增殖培養(yǎng)基的原料組分包括：6-芐氨基嘌呤0.5mg、萘乙酸0.1mg、吲哚丁酸1.0mg、白糖30g、瓊脂3.8g，余量為ms培養(yǎng)基。對比例三每1l繼代增殖培養(yǎng)基的原料組分包括：6-芐氨基嘌呤1.0mg、萘乙酸0.01mg、吲哚丁酸0.5mg、白糖30g、瓊脂3.8g，余量為ms培養(yǎng)基。對比例四每1l繼代增殖培養(yǎng)基的原料組分包括：6-芐氨基嘌呤1.0mg、萘乙酸0.05mg、吲哚丁酸1.0mg、白糖30g、瓊脂3.8g，余量為ms培養(yǎng)基。對比例五每1l繼代增殖培養(yǎng)基的原料組分包括：6-芐氨基嘌呤1.0mg、萘乙酸0.1mg、吲哚丁酸0mg、白糖30g、瓊脂3.8g，余量為ms培養(yǎng)基。對比例六每1l繼代增殖培養(yǎng)基的原料組分包括：6-芐氨基嘌呤1.5mg、萘乙酸0.01mg、吲哚丁酸1.0mg、白糖30g、瓊脂3.8g，余量為ms培養(yǎng)基。對比例七每1l繼代增殖培養(yǎng)基的原料組分包括：6-芐氨基嘌呤1.5mg、萘乙酸0.05mg、吲哚丁酸0mg、白糖30g、瓊脂3.8g，余量為ms培養(yǎng)基。對比例八每1l繼代增殖培養(yǎng)基的原料組分包括：6-芐氨基嘌呤1.5mg、萘乙酸0.1mg、吲哚丁酸0.5mg、白糖30g、瓊脂3.8g，余量為ms培養(yǎng)基。對比例九該對比例除s103中的光照外，其余參數均相同與實施例一。具體地，s103：將誘導得到的不定芽移栽至繼代增殖培養(yǎng)基中進行多代繼代增殖培養(yǎng)，得到試管苗。其中，每升繼代增殖培養(yǎng)基包括下述原料組分：6-芐氨基嘌呤0.5mg、萘乙酸0.01mg、白糖30g、瓊脂3.8g，余量為ms培養(yǎng)基，調節(jié)培養(yǎng)基的ph值為6.2。多代繼代增殖培養(yǎng)為3代；培養(yǎng)的條件具體包括：空氣相對濕度為95％，光照時間為11h·d-1，光照強度為2500lux，溫度為23℃，選用正常日光光源照射。另外，將本發(fā)明各實施例和各對比例得到的草莓苗進行定期觀察記錄，系統評價其生長狀況。一、繼代增殖培養(yǎng)過程中試管苗的生長情況將s102得到的不定芽各接種10瓶，每瓶接種2苗，進行s103中的繼代增殖培養(yǎng)，定期觀察記錄，30d后對得到的試管苗觀察記錄。對記錄的結果進行統計分析，具體結果如表1所示。表1繼代增殖培養(yǎng)過程中試管苗的生長情況由表1數據可以看出：在實施例一和各對比例中，即在6-ba、naa、iba三個因素中，影響不定芽分化的主要因素是6-ba，增殖倍數最高的濃度是1.5mg/l；其次是naa，增殖倍數最高的濃度是naa0.05mg/l，即ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l，用這一培養(yǎng)基配方進行進一步試驗，發(fā)現誘導出來的叢生芽長勢很弱，大部分叢生芽都是水漬狀，不適合以后的增殖；而增殖倍數稍低的培養(yǎng)基配方，即：ms+6-ba0.5mg/l+naa0.01mg/l，芽生長比較壯，生長良好，無水漬狀。實施例一選用ms+6-ba0.5mg/l+naa0.01mg/l+3％白糖+0.38％瓊脂作繼代增殖培養(yǎng)基，可使試管苗30天繼代一次，叢生芽的增值倍數為7.6倍，芽生長比較壯，生長良好，無水漬狀。二、各實施例最終草莓苗的生長狀況將各實施例最終得到的草莓苗的生長狀況進行統計分析，以采用常規(guī)培養(yǎng)基得到的草莓苗長勢作基準，各統計參數均取平均值，具體結果如表2所示。表2各實施例和對比例草莓苗的生長狀況株高增加/％葉片數增加/％單株繁殖匍匐莖數/％草莓增產/％實施例一25.8516.03109.5153.98實施例二26.9317.62108.8955.64實施例三26.8717.86110.0653.79實施例四30.0620.98128.6568.96實施例五29.5820.62126.5368.21實施例六29.9819.59127.2367.05需要說明的是，除了實施例一至實施例六列舉的情況，其他原料組分的種類和配比、制備過程中的條件和參數等也是可以的。采用本發(fā)明提供的繼代增殖培養(yǎng)基，可以使草莓試管苗的增值率提高約8倍，平均株高增加約25.85％、平均葉片數增加約16.03％、平均單株繁殖匍匐莖數增加約109.51％、最終草莓產量增產約53.98％，而且草莓的患病數目和成活率均顯著提高；此外，本發(fā)明的繼代增殖培養(yǎng)基應用方便，成本低廉，易于推廣普及，顯著提高了草莓種植戶的生產積極性。在本發(fā)明的描述中，需要理解的是，術語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特征的數量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。在本發(fā)明的描述中，“多個”的含義是兩個以上，除非另有明確具體的限定。在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結合和組合。需要說明的是，本發(fā)明草莓脫毒組培快繁方法中，除繼代增殖培養(yǎng)外，其他所涉及的參數均按本領域常規(guī)方法進行處理。盡管上面已經示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領域的普通技術人員在本發(fā)明的范圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。當前第1頁12