本發(fā)明屬于細(xì)胞凍存領(lǐng)域，尤其涉及一種牙周膜干細(xì)胞的凍存液及其凍存方法。
背景技術(shù)：
：牙周疾病不僅是引起成年人失牙的主要原因，還是危害人類口腔乃至全身健康的主要口腔疾病。牙周病是牙周組織的慢性炎癥刺激下的感染性疾病，是牙菌斑中的微生物在相應(yīng)的微環(huán)境下引起的炎癥，它損壞牙周組織，尤其是牙槽骨的破壞和牙周組織的喪失，最終導(dǎo)致牙齒松動脫落以及牙槽骨的吸收。而牙周治療的目標(biāo)就是要治療牙周炎癥，改善微環(huán)境重新再生出新的結(jié)締組織附著和支持組織，完成牙槽骨，牙骨質(zhì)和牙周膜的構(gòu)建。常用的牙周再生方法有引導(dǎo)組織再生術(shù)、根面平整術(shù)等，此類方法簡單易行但并不能完全實(shí)現(xiàn)功能性和結(jié)構(gòu)性牙周組織再生，存在相應(yīng)的局限性。牙周組織工程技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展為牙周再生提供了嶄新的思路和方法。牙周膜是牙根與牙槽骨之間的一層結(jié)締組織，是重要的牙周支持組織，主要由成纖維細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和一些未分化的間充質(zhì)細(xì)胞組成。正常情況下，牙周組織具有自身的更新和修復(fù)能力，其修復(fù)活動是通過牙周膜細(xì)胞自我更新實(shí)現(xiàn)的。在疾病或在受到外界刺激時，通過牙周膜中細(xì)胞的不斷增殖和分化使組織再生。2004年seo等從拔除的第三磨牙牙周膜組織中分離得到牙周膜干細(xì)胞(periodontalligamentsemcells，pdlscs)。此外，在拔牙后牙槽窩的內(nèi)表面也有pdlscs存在。近來，有人從成人牙周組織中得到了高度純化的pdlscs克隆。值得注意的是，更多研究發(fā)現(xiàn)，從炎癥牙周膜組織中也可分離得到pdlscs，并證明其仍保持再生牙骨質(zhì)和牙周膜組織的潛能，也在一定程度彌補(bǔ)了其來源不足的弊端。研究表明，pdlscs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記物stro-1和cd146/muc18，這意味著pdlscs很有可能是來源于血管周圍的細(xì)胞群。而這一點(diǎn)恰恰與同樣表達(dá)stro-1和cd146/muc18的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，bmmscs)非常相似。pdlscs也具有與bmscs相似的多向分化能力，可體外分化為多種細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，在維持牙周組織的穩(wěn)態(tài)，維護(hù)牙槽骨的新陳代謝過程中發(fā)揮了重要作用。雖然有研究采用包括脂肪、骨髓在內(nèi)的多種組織來源的成體干細(xì)胞進(jìn)行牙周再生，但取材的有創(chuàng)性和倫理性等問題仍然制約了其發(fā)展。因此，pdlscs有望成為牙周組織再生的首選種子細(xì)胞。近幾年，干細(xì)胞庫建立的需要以及臨床上對干細(xì)胞的需求增加，對干細(xì)胞凍存與復(fù)蘇方面的研究引起了越來越多的關(guān)注。與其他來源mscs一樣，pdlscs作為組織工程學(xué)研究和潛在臨床應(yīng)用的種子細(xì)胞，其過度傳代會表現(xiàn)明顯衰老或凋亡，且長期體外培養(yǎng)易發(fā)生自發(fā)分化，失去多分化潛能，增殖、黏附能力下降，細(xì)胞凋亡率增加，所以凍存pdlscs也是其研究應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)之一。細(xì)胞凍存液是一種細(xì)胞凍存時使用的溶液，它可以供給細(xì)胞生命代謝所必須的營養(yǎng)物質(zhì)，同時可以防止或減少冷凍冰晶對細(xì)胞的損傷作用。目前常用的細(xì)胞凍存液或市售的細(xì)胞凍存液中通常是由二甲基亞砜(dimathylsulfoxide，dmso)和胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)混合組成。dmso是一種分子量小，且具有強(qiáng)溶解能力和滲透能力的化學(xué)物質(zhì)。在許多研究中，dmso是最常用的細(xì)胞凍存保護(hù)劑，用其保存的細(xì)胞復(fù)蘇后與新鮮細(xì)胞比較，具有相似的表型、細(xì)胞表面標(biāo)記及生長速率。dmso的作用機(jī)制是在降溫過程中透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，降低細(xì)胞內(nèi)、外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)損傷，同時細(xì)胞內(nèi)水分不會過度外滲，避免細(xì)胞過度脫水皺縮。然而，dmso對細(xì)胞有一定毒性作用，濃度過高會引起較高的滲透壓，不利于細(xì)胞復(fù)蘇。因此，目前dmso常規(guī)使用濃度為5％-15％。fbs屬于異源性物質(zhì)，成分復(fù)雜，并存在引入污染和過敏原的風(fēng)險，不適合于臨床應(yīng)用。特別是在細(xì)胞治療中，異源性蛋白的存在，可能會引起不必要的，甚至是未知的不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響治療結(jié)果。綜上所述，傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存液會對牙周膜干細(xì)胞產(chǎn)生毒性和免疫原性反應(yīng)，因此，研發(fā)一種不對牙周膜干細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性、免疫原性，還能顯著提高細(xì)胞凍存后復(fù)蘇活率的凍存液是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供了一種牙周膜干細(xì)胞的凍存液及其凍存方法，能有效解決傳統(tǒng)凍存液對牙周膜干細(xì)胞產(chǎn)生毒性和免疫原性反應(yīng)導(dǎo)致的凍存效果差，復(fù)蘇后細(xì)胞活率低的技術(shù)缺陷。本發(fā)明提供的一種牙周膜干細(xì)胞的凍存液，包括甘油、間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液和人血白蛋白。作為優(yōu)選，所述凍存液包括：甘油的體積百分含量為10％、間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液的體積百分含量為30-60％、人血白蛋白的體積百分含量為30-60％。作為優(yōu)選，所述凍存液包括：甘油的體積百分含量為10％、間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液的體積百分含量為40％、人血白蛋白的體積百分含量為50％。作為優(yōu)選，所述人血白蛋白質(zhì)量濃度為20％。進(jìn)一步的，本發(fā)明還公開了一種牙周膜干細(xì)胞凍存方法，包括以下步驟：向牙周膜干細(xì)胞中加入所述凍存液，混勻后凍存。作為優(yōu)選，凍存液的加入量為至牙周膜干細(xì)胞密度為1.0×106個/ml-5×106個/ml。作為優(yōu)選，所述凍存具體為所述凍存液與所述牙周膜干細(xì)胞混勻后分裝到凍存管內(nèi)，放入提前恢復(fù)室溫的程序降溫盒后，放置-80℃超低溫冰箱，2-3天后轉(zhuǎn)移到液氮保存。本發(fā)明公開一種牙周膜干細(xì)胞凍存液，包括甘油、間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液和人血白蛋白。通過甘油、間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液和人血白蛋白三者的協(xié)同作用。其中，甘油可作為滲透性冷凍保護(hù)劑，細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷，同時細(xì)胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細(xì)胞過分脫水皺縮；間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液和人血白蛋白可維持細(xì)胞正常滲透壓，保持細(xì)胞膜完整性，維持正常ph值以及保護(hù)細(xì)胞膜表面蛋白功能正常。本發(fā)明可大大提高了細(xì)胞膜對水的通透性，可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。此凍存液不含dmso，避免了其對細(xì)胞的毒害作用，同時不含有動物源血清，避免了引入污染和過敏原的風(fēng)險，與常規(guī)細(xì)胞凍存液相比具有更高的臨床安全性。同時，本發(fā)明的牙周膜干細(xì)胞凍存液及凍存方法能保持凍存牙周膜干細(xì)胞的活性，復(fù)蘇后牙周膜干細(xì)胞活率顯著提高，而且不影響細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)，并不影響其分化潛能，特別是分化成成脂細(xì)胞和成骨細(xì)胞的潛能。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1示牙周膜干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)率圖；圖2示采用實(shí)施例復(fù)蘇細(xì)胞的細(xì)胞復(fù)蘇結(jié)果及細(xì)胞活率統(tǒng)計；圖3示采用對比例培養(yǎng)的細(xì)胞生長曲線圖；圖4示采用實(shí)施例3培養(yǎng)的細(xì)胞生長曲線；圖5示采用對比例和實(shí)施例3培養(yǎng)的細(xì)胞生長形態(tài)圖像(左邊欄為對比例，右邊欄為實(shí)施例3，第1、2、3橫行為第一、二、三天細(xì)胞生長圖)；圖6示采用對比例和實(shí)施例3培養(yǎng)的細(xì)胞生長形態(tài)圖像(左邊欄為對比例，右邊欄為實(shí)施例3，第1、2、3橫行為第四、五、六天細(xì)胞生長圖)；圖7示采用對比例和實(shí)施例3培養(yǎng)的細(xì)胞生長形態(tài)圖像(左邊欄為對比例，右邊欄為實(shí)施例3，第1橫行為第七天細(xì)胞生長圖)；圖8示實(shí)施例3的pdlscs表面標(biāo)志物表達(dá)率圖；圖9示對比例與實(shí)施例3成骨分化效果圖(200×)；圖10示對比例與實(shí)施例3成脂分化效果圖(200×)。其中，圖1和圖8橫坐標(biāo)中的cd146-a、cd105-a、cd73-a、hla-dr-a、cd34-a、cd45-a為表面抗原cd146、cd105、cd73、hla-dr、cd34、cd45，縱坐標(biāo)為抗原表達(dá)率。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了一種牙周膜干細(xì)胞凍存液和凍存方法，能有效解決傳統(tǒng)凍存液對牙周膜干細(xì)胞產(chǎn)生毒性和免疫原性反應(yīng)導(dǎo)致的凍存效果差，復(fù)蘇后細(xì)胞活率低的技術(shù)缺陷。下面將對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。其中，本發(fā)明所用間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液為市售產(chǎn)品：lonza12-725f，ultracultureserum-freemedium(sfm)。實(shí)施例1對pdlscs進(jìn)行原代分離培養(yǎng)、鑒定及傳代。pdlscs進(jìn)行原代分離培養(yǎng)，包括以下步驟：1、取材：取12-18歲健康供者的因正畸需要拔除的第3磨牙，快速浸入已經(jīng)4℃預(yù)冷含3倍體積的雙抗的pbs中。2、漂洗：用含3倍雙抗的pbs從牙根到牙冠的方向沖洗牙體，徹底清除血污，重復(fù)3次。3、牙周組織刮?。河檬中g(shù)刀片冠根單向刮取根中下1/3段的牙周膜組織，移入離心管，并用眼科剪將組織塊剪成約為1mm3大小。4、消化：加入適量膠原酶-dispase酶1:1混合消化液(膠原酶3g/l，dispase酶4g/l)，置37℃恒溫?fù)u床中消化30-35min。消化結(jié)束后，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量pbs重懸，1000r/min離心5min，棄上清。5、接種：加入培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)10％fbs的dmem培養(yǎng)液)重懸細(xì)胞，接種于六孔板，5％co2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。6、純化：待細(xì)胞長滿細(xì)胞平板面積的80％-90％后，收集細(xì)胞，用磁珠分選法純化細(xì)胞，將收集的細(xì)胞與stro-1單抗在4℃孵育1h后，與磁珠混合4℃孵育30min，在磁力設(shè)備作用下篩選出stro-1和pdlscs，pdlscs接種于新的六孔板中，在5％co2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。對pdlscs進(jìn)行鑒定，包括以下步驟：待細(xì)胞長滿平板面積的80-90％后，收集細(xì)胞(約1×106個)，加入3g/ltriton浸泡20min后，pbs洗3遍，10％山羊血清室溫封閉2h，分別滴加1:200稀釋的cd146、cd105、cd73、hla-dr、cd34、cd45抗體各50μl，同時對照組(不孵育抗體的陰性組)滴加純pbs50μl，4℃處理16h，次日室溫放置30min，pbs漂洗3遍，各組分別滴加1:500稀釋的fitc標(biāo)記二抗igg，常溫避光孵育1h，pbs漂洗2遍，10％福爾馬林固定細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測定抗原的陽性率。結(jié)果顯示，與對照組相比，分離的pdlscs表面抗原cd146、cd105、cd73表達(dá)陽性，而hla-dr、cd34、cd45表達(dá)陰性，說明從牙齒中成功分離到pdlscs。表1pdlscs細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)率細(xì)胞表型cd146cd105cd73hla-drcd34cd45陽性表達(dá)率(％)99.8099.8099.800.200.200.30pdlscs傳代，包括以下步驟：待鑒定結(jié)果為陽性的pdlscs鋪板，長滿平板面積的80-90％后，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入0.25％胰蛋白酶，消化1-3分鐘，鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓時，立即加入含10％體積百分比fbs的dmem培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄上清。加入含10％體積百分比fbs的dmem培養(yǎng)液，進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，按5×104個/ml密度接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，5％co2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每隔2-3天換液一次。對比例對比例凍存液的配制：將凍存液體積百分含量為10％的dmso、凍存液體積百分含量為90％的fbs混合后制得對比例的凍存液，于4℃冰箱冷藏備用。實(shí)施例2實(shí)施例2凍存液的配制：將實(shí)施例2凍存液的體積百分含量為10％的甘油、實(shí)施例2凍存液的體積百分含量為30％的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液和實(shí)施例2凍存液的體積百分含量為60％的人血白蛋白(人血白蛋白質(zhì)量濃度為20％)，混合后制得實(shí)施例2的凍存液，于4℃冰箱冷藏備用。實(shí)施例3實(shí)施例3凍存液的配制：將實(shí)施例3凍存液的體積百分含量為10％的甘油、將實(shí)施例3凍存液的體積百分含量為40％的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液和將實(shí)施例3凍存液的體積百分含量為50％的人血白蛋白(人血白蛋白質(zhì)量濃度為20％)，混合后制得實(shí)施例3的凍存液，于4℃冰箱冷藏備用。實(shí)施例4實(shí)施例4凍存液的配制：將體積百分含量為10％的甘油、體積百分含量為50％的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液和體積百分含量為40％的人血白蛋白(人血白蛋白質(zhì)量濃度為20％)，混合后制得實(shí)施例4的凍存液，于4℃冰箱冷藏備用。實(shí)施例5實(shí)施例5凍存液的配制：將將實(shí)施例3凍存液的體積百分含量為10％的甘油、將實(shí)施例3凍存液的體積百分含量為60％的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液和將實(shí)施例3凍存液的體積百分含量為30％的人血白蛋白(人血白蛋白質(zhì)量濃度為20％)，混合后制得實(shí)施例5的凍存液，于4℃冰箱冷藏備用。實(shí)施例6細(xì)胞凍存步驟為：1、細(xì)胞收集：選取第3代pdlscs，待細(xì)胞長滿平板的80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入適量0.25％胰蛋白酶，消化1-3分鐘，鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓時，立即加入適量間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄上清。2、凍存：分別用配制好的各實(shí)施例和對比例凍存液凍存細(xì)胞，凍存液加入量為至牙周膜干細(xì)胞密度為1.0×106個/ml，設(shè)置重復(fù)3次。分裝到2ml凍存管內(nèi)，1.5ml/管，放入提前恢復(fù)室溫的程序降溫盒，放置-80℃超低溫冰箱，程序降溫盒能保證溫度以1℃/min的速度下降；2天后轉(zhuǎn)移到液氮保存。實(shí)施例7對各實(shí)施例和對比例的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，包括以下步驟：對比例與各實(shí)施例凍存的細(xì)胞于液氮凍存一個月后，分別取出三組重復(fù)進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，凍存管取出立即放入37℃水浴鍋中溶解，溶解過程中需不斷搖晃凍存管。1-2min液體融化后，用10ml間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液(用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍)，混勻后取0.5ml細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)與活性檢測。實(shí)驗結(jié)果顯示，本發(fā)明所述pdlscs凍存液凍存效果明顯優(yōu)于常規(guī)細(xì)胞凍存液(表2，圖2)。表2采用實(shí)施例復(fù)蘇細(xì)胞的細(xì)胞復(fù)蘇結(jié)果及細(xì)胞活率統(tǒng)計實(shí)施例8對實(shí)施例3和對比例的細(xì)胞生長曲線比較，包括以下步驟：對比例與實(shí)施例3凍存的細(xì)胞于液氮凍存一個月后，凍存管取出立即放入37℃水浴鍋中溶解，溶解過程中需不斷搖晃凍存管。1-2min液體融化后，用10ml間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液(用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍)，1000r/min離心5min，棄上清。用含10ng/mlegf的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基重懸后，細(xì)胞按1×104個/ml密度接種于24孔板中，放入5％co2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。每天收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，每次隨機(jī)收集計算3個重復(fù)(孔1、孔2、孔3)，連續(xù)7天，繪制細(xì)胞生長曲線。結(jié)果顯示采用本發(fā)明所述人pdlscs凍存液凍存pdlscs，復(fù)蘇后培養(yǎng)細(xì)胞生長規(guī)律正常，其增殖活性高于常規(guī)的細(xì)胞凍存液凍存pdlscs，如表3和表4、圖3、圖4所示。每天細(xì)胞收集前在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察兩組細(xì)胞的生長形態(tài)并采集圖像。結(jié)果如圖5-圖7所示。圖3-圖7結(jié)果均說明本發(fā)明實(shí)施例3的凍存液對細(xì)胞復(fù)蘇后具有促進(jìn)增殖作用。表3對比例凍存的mdscs復(fù)蘇培養(yǎng)每天計數(shù)結(jié)果表4實(shí)施例3凍存的mdscs復(fù)蘇培養(yǎng)每天計數(shù)結(jié)果實(shí)施例9對實(shí)施例3的細(xì)胞表面標(biāo)記物測定，包括以下步驟：實(shí)施例3凍存的細(xì)胞于液氮凍存一個月后，凍存管取出立即放入37℃水浴鍋中溶解，溶解過程中需不斷搖晃凍存管。1-2min液體融化后，用10ml間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液(用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍)，1000r/min離心5min，棄上清。用10ml含10ng/mlegf的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基重懸后，細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，放入5％co2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。48h后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志物cd146、cd105、cd73、hla-dr、cd34和cd45的表達(dá)情況。結(jié)果如表5和圖8。檢測結(jié)果表明，采用本發(fā)明所述牙周膜干細(xì)胞凍存液凍存細(xì)胞，復(fù)蘇后的pdlscs表達(dá)干細(xì)胞典型的表面標(biāo)記物，與凍存前pdlscs比較無顯著性差異。表明本發(fā)明所述pdlscs凍存液不會影響pdlscs的細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)。表5實(shí)施例3pdlscs細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)率實(shí)施例10多向分化潛能檢測，包括以下步驟：對比例與實(shí)施例3凍存的細(xì)胞于液氮凍存一個月后，凍存管取出立即放入37℃水浴鍋中溶解，溶解過程中需不斷搖晃凍存管。1-2min液體融化后，用10ml間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液(用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍)，1000r/min離心5min，棄上清。用含10ng/mlegf的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基重懸后，細(xì)胞按1×105個/ml密度接種于6孔板中，放入5％co2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)80％以上，位凍存過的正常牙周膜干細(xì)胞和實(shí)施例3凍存復(fù)蘇后的牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)成骨分化和成脂分化。14天后對兩組成脂分化實(shí)驗組細(xì)胞進(jìn)行油紅o染色，21天后對兩組成骨分化實(shí)驗組細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色。如圖9所示，對比例的陰性對照和成脂誘導(dǎo)組與實(shí)施例3的陰性對照和成脂誘導(dǎo)組染色結(jié)果相似，圖10表明對比例的陰性對照和成骨誘導(dǎo)組與實(shí)施例3的陰性對照和成骨誘導(dǎo)組染色結(jié)果相似，該實(shí)驗結(jié)果表明本發(fā)明所述牙周膜干細(xì)胞凍存液不會影響pdlscs的成脂和成骨分化潛能(圖9、圖10)。綜上所述，該發(fā)明能有效解決現(xiàn)有的凍存液對牙周膜干細(xì)胞凍存效果差，復(fù)蘇后細(xì)胞活率低的技術(shù)缺陷。本發(fā)明的牙周膜干細(xì)胞凍存液又能很好保持凍存細(xì)胞活性，復(fù)蘇后牙周膜干細(xì)胞活率顯著提高，而且不影響細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)及其成脂和成骨的分化潛能。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁12