本發(fā)明涉及dna分子標記技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種篩選少根紫萍葉生長相關(guān)的分子標記的方法。
背景技術(shù)：
富、高度雜合且穩(wěn)定性好、遵循孟德爾分離定律共顯性遺傳、易于pcr擴增等特點，已成為近年來廣泛應(yīng)用的dna標記，常應(yīng)用于生物資源的家系譜系認證、基因連鎖分析、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、種群遺傳多樣性等許多研究領(lǐng)域。
在自然環(huán)境中，少根紫萍基本以無性生殖進行繁殖，當環(huán)境條件適宜時2天即可克隆出一代，種群遺傳多樣性水平較低。
現(xiàn)有技術(shù)提供多種衛(wèi)星標記的檢測方法，例如，中國發(fā)明授權(quán)專利文獻一種銹斑蟳微衛(wèi)星標記的快速檢測方法授權(quán)公告號cn103305611b該發(fā)明涉及一種銹斑蟳微衛(wèi)星標記的快速檢測方法，包括：（1）銹斑蟳基因組dna的提取；（2）根據(jù)genebank數(shù)據(jù)庫中銹斑蟳的功能基因序列，獲得含有微衛(wèi)星重復的基因序列；（3）微衛(wèi)星標記引物的設(shè)計；（4）銹斑蟳不同個體的基因組dna的pcr擴增；（5）pcr產(chǎn)物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。該發(fā)明的檢測方法具有快速、準確、靈敏等優(yōu)點，能夠直觀地檢測出銹斑蟳不同個體的基因型，從而快速獲得銹斑蟳在功能基因微衛(wèi)星位點遺傳變異的多態(tài)性圖譜，該微衛(wèi)星標記可應(yīng)用于銹斑蟳遺傳變異與種群遺傳多樣性分析等領(lǐng)域，但微衛(wèi)星標記檢測速度還有提升空間。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種快速篩選與少根紫萍葉生長相關(guān)的分子標記方法，清晰少根紫萍的葉數(shù)/株、葉長和葉寬與相關(guān)dna位點的關(guān)系。
本發(fā)明針對背景技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：篩選少根紫萍葉生長相關(guān)的分子標記的方法，包括克隆體培養(yǎng)、基因組dna提取、設(shè)計微衛(wèi)星引物、pcr擴增和數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。
作為優(yōu)選，植株克隆體培養(yǎng)的營養(yǎng)液成份及其濃度為：氮0.3~0.4g/l、磷酐0.1~0.15g/l、氧化鉀0.16~0.23g/l、氧化鎂0.01~0.015g/l和硫0.012~0.02g/l。上述營養(yǎng)液能全面提供少根紫萍生長所需的大量元素和微量元素，無性繁殖速度快，基因突變的概率低，可得到大量基因相同的植株，樣本量足。
作為優(yōu)選，植株克隆體在光照培養(yǎng)箱中進行室內(nèi)培養(yǎng)50~70d，培養(yǎng)條件為22.5~23.5℃，濕度73~83%，光照強度為1800~2200lux，光暗時間14~16:10~8h。上述培養(yǎng)條件下，少根紫萍的光合作用強，生長速度快。
作為優(yōu)選，微衛(wèi)星引物為：sp10：f:ccatctgtcgtcctttttccc；r:cgccccatcacttatttcgta；sp14：f:gtccatccttctcagcacaat；r:ccgtacaagatctaagccttt；sp42：f:tgagatcaggctggagcagtg；r:gtttacgtgggctaccaaaca；sp47：f:tgggcctatggcgattagggg；r:gcggcatccacggagaaaatg；sp51：f:ctcgcacatcagttcacagga；r:tcagacatctggcgcagtaga；sp52：f:gtcctccctttgattgctcgtc；r:aagcatcatgggctcttcagg；sp53：f:aggacgacgacctctactgcc；r:tacgagttctgcggaccatca。
作為優(yōu)選，pcr擴增體系為18~22ul，其中包括3.4~4.2utaqdna聚合酶（sangon）、1.6~2.2ul10×pcrbuffer、0.7~0.9mmdntp、上游、下游引物各0.3mm、50~100ngdna模板，ddh2o補至終體積20ul；在bio-radpcr擴增儀上進行擴增，擴增程序為92~96℃預變性4.5~5.6min；93~96℃變性28~33s，52~56℃復性33~37s，70~75℃延伸36~43s，共33~38個循環(huán)；最終70~75℃延伸2.5~3.4min。上述pcr擴增可快速得到大量的經(jīng)微衛(wèi)星引物標記的少根紫萍的dna序列。
作為優(yōu)選，數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析為對紫萍克隆的葉數(shù)/株、葉長和葉寬進行統(tǒng)計描述，應(yīng)用單因素方差分析和最小顯著差數(shù)法或dunnettt3非參數(shù)多重比較兩兩基因型生長性狀特征之間的差異性；應(yīng)用一般線性模型過程對葉數(shù)/株、葉長和葉寬性狀與微衛(wèi)星位點的關(guān)聯(lián)性進行最小二乘分析,并對同一位點的各基因型進行多重比較。少根紫萍葉長和葉寬均與sp10、sp14、sp42、sp47、sp51、sp52和sp53顯著相關(guān)（除sp51位點p<0.05，其余p<0.001）。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明可快速得到大量的經(jīng)微衛(wèi)星引物標記的少根紫萍的dna序列，微衛(wèi)星標記檢測速度快，可快速獲得少根紫萍sp10、sp14、sp42、sp47、sp51、sp52和sp53遺傳標記基因座呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜。少根紫萍葉長和葉寬均與sp10、sp14、sp42、sp47、sp51、sp52和sp53顯著相關(guān)（除sp51位點p<0.05，其余p<0.001）。了解基因型差異對紫萍生長以及污染物凈化能力的影響，提高廢水的生物治理效率。
具體實施例
下面通過實施例對本發(fā)明方案作進一步說明：
實施例1：
篩選少根紫萍葉生長相關(guān)的分子標記的方法，包括克隆體培養(yǎng)、基因組dna提取、設(shè)計微衛(wèi)星引物、pcr擴增和數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。
植株克隆體培養(yǎng)的營養(yǎng)液成份及其濃度為：氮0.3~0.4g/l、磷酐0.1~0.15g/l、氧化鉀0.16~0.23g/l、氧化鎂0.01~0.015g/l和硫0.012~0.02g/l。上述營養(yǎng)液能全面提供少根紫萍生長所需的大量元素和微量元素，無性繁殖速度快，基因突變的概率低，可得到大量基因相同的植株，樣本量足。
植株克隆體在光照培養(yǎng)箱中進行室內(nèi)培養(yǎng)50~70d，培養(yǎng)條件為22.5~23.5℃，濕度73~83%，光照強度為1800~2200lux，光暗時間14~16:10~8h。上述培養(yǎng)條件下，少根紫萍的光合作用強，生長速度快。
微衛(wèi)星引物為：sp10：f:ccatctgtcgtcctttttccc；r:cgccccatcacttatttcgta；sp14：f:gtccatccttctcagcacaat；r:ccgtacaagatctaagccttt；sp42：f:tgagatcaggctggagcagtg；r:gtttacgtgggctaccaaaca；sp47：f:tgggcctatggcgattagggg；r:gcggcatccacggagaaaatg；sp51：f:ctcgcacatcagttcacagga；r:tcagacatctggcgcagtaga；sp52：f:gtcctccctttgattgctcgtc；r:aagcatcatgggctcttcagg；sp53：f:aggacgacgacctctactgcc；r:tacgagttctgcggaccatca。
pcr擴增體系為18~22ul，其中包括3.4~4.2utaqdna聚合酶（sangon）、1.6~2.2ul10×pcrbuffer、0.7~0.9mmdntp、上游、下游引物各0.3mm、50~100ngdna模板，ddh2o補至終體積20ul；在bio-radpcr擴增儀上進行擴增，擴增程序為92~96℃預變性4.5~5.6min；93~96℃變性28~33s，52~56℃復性33~37s，70~75℃延伸36~43s，共33~38個循環(huán)；最終70~75℃延伸2.5~3.4min。上述pcr擴增可快速得到大量的經(jīng)微衛(wèi)星引物標記的少根紫萍的dna序列。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析為對紫萍克隆的葉數(shù)/株、葉長和葉寬進行統(tǒng)計描述，應(yīng)用單因素方差分析和最小顯著差數(shù)法或dunnettt3非參數(shù)多重比較兩兩基因型生長性狀特征之間的差異性；應(yīng)用一般線性模型過程對葉數(shù)/株、葉長和葉寬性狀與微衛(wèi)星位點的關(guān)聯(lián)性進行最小二乘分析,并對同一位點的各基因型進行多重比較。少根紫萍葉長和葉寬均與sp10、sp14、sp42、sp47、sp51、sp52和sp53顯著相關(guān)（除sp51位點p<0.05，其余p<0.001）。
實施例2：
篩選少根紫萍葉生長相關(guān)的分子標記的方法，包括克隆體培養(yǎng)、基因組dna提取、設(shè)計微衛(wèi)星引物、pcr擴增和數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。
植株克隆體培養(yǎng)的營養(yǎng)液成份及其濃度為：氮0.32g/l、磷酐0.12g/l、氧化鉀0.19g/l、氧化鎂0.012g/l和硫0.016g/l。上述營養(yǎng)液能全面提供少根紫萍生長所需的大量元素和微量元素，無性繁殖速度快，基因突變的概率低，可得到大量基因相同的植株，樣本量足。
植株克隆體在光照培養(yǎng)箱中進行室內(nèi)培養(yǎng)60d，培養(yǎng)條件為23℃，濕度78%，光照強度為2000lux，光暗時間16:8h。上述培養(yǎng)條件下，少根紫萍的光合作用強，生長速度快。
微衛(wèi)星引物為：sp10：f:ccatctgtcgtcctttttccc；r:cgccccatcacttatttcgta；sp14：f:gtccatccttctcagcacaat；r:ccgtacaagatctaagccttt；sp42：f:tgagatcaggctggagcagtg；r:gtttacgtgggctaccaaaca；sp47：f:tgggcctatggcgattagggg；r:gcggcatccacggagaaaatg；sp51：f:ctcgcacatcagttcacagga；r:tcagacatctggcgcagtaga；sp52：f:gtcctccctttgattgctcgtc；r:aagcatcatgggctcttcagg；sp53：f:aggacgacgacctctactgcc；r:tacgagttctgcggaccatca。
pcr擴增體系為20ul，其中包括4utaqdna聚合酶（sangon）、2ul10×pcrbuffer、0.8mmdntp、上游、下游引物各0.3mm、50-100ngdna模板，ddh2o補至終體積20ul。在bio-radpcr擴增儀上進行擴增，擴增程序為94℃預變性5min；94℃變性30s，54℃復性35s，72℃延伸40s，共35個循環(huán)；最終72℃延伸3min。pcr擴增產(chǎn)物在3730xl測序儀上進行毛細管電泳檢測。上述pcr擴增可快速得到大量的經(jīng)微衛(wèi)星引物標記的少根紫萍的dna序列。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析為對紫萍克隆的葉數(shù)/株、葉長和葉寬進行統(tǒng)計描述，應(yīng)用單因素方差分析和最小顯著差數(shù)法或dunnettt3非參數(shù)多重比較兩兩基因型生長性狀特征之間的差異性；應(yīng)用一般線性模型過程對葉數(shù)/株、葉長和葉寬性狀與微衛(wèi)星位點的關(guān)聯(lián)性進行最小二乘分析,并對同一位點的各基因型進行多重比較。少根紫萍葉長和葉寬均與sp10、sp14、sp42、sp47、sp51、sp52和sp53顯著相關(guān)（除sp51位點p<0.05，其余p<0.001）。
實施例3：
篩選少根紫萍葉生長相關(guān)的分子標記的方法，包括克隆體培養(yǎng)、基因組dna提取、設(shè)計微衛(wèi)星引物、pcr擴增和數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。
植株克隆體培養(yǎng)的營養(yǎng)液成份及其濃度為：氮0.32g/l、磷酐0.12g/l、氧化鉀0.2g/l、氧化鎂0.013g/l和硫0.017g/l。上述營養(yǎng)液能全面提供少根紫萍生長所需的大量元素和微量元素，無性繁殖速度快，基因突變的概率低，可得到大量基因相同的植株，樣本量足。
對不同培養(yǎng)系中的每一植株（葉片相連）計數(shù)葉片的數(shù)量，使用游標卡尺測量葉片的葉長（葉片最長長度）、葉寬（葉片最短長度）及每條根的長度。
微衛(wèi)星引物為：sp10：f:ccatctgtcgtcctttttccc；r:cgccccatcacttatttcgta；sp14：f:gtccatccttctcagcacaat；r:ccgtacaagatctaagccttt；sp42：f:tgagatcaggctggagcagtg；r:gtttacgtgggctaccaaaca；sp47：f:tgggcctatggcgattagggg；r:gcggcatccacggagaaaatg；sp51：f:ctcgcacatcagttcacagga；r:tcagacatctggcgcagtaga；sp52：f:gtcctccctttgattgctcgtc；r:aagcatcatgggctcttcagg；sp53：f:aggacgacgacctctactgcc；r:tacgagttctgcggaccatca。
采用改良的ctab方法提取少根紫萍和少根紫萍基因組dna。pcr擴增體系為20ul，其中包括4utaqdna聚合酶（sangon）、2ul10×pcrbuffer、0.8mmdntp、上游、下游引物各0.3mm、50-100ngdna模板，ddh2o補至終體積20ul。在bio-radpcr擴增儀上進行擴增，擴增程序為94℃預變性5min；94℃變性30s，54℃復性35s，72℃延伸40s，共35個循環(huán)；最終72℃延伸3min。pcr擴增產(chǎn)物在3730xl測序儀上進行毛細管電泳檢測。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析為采用spss19.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。對紫萍克隆的葉數(shù)/株、葉長和葉寬進行統(tǒng)計描述，應(yīng)用單因素方差分析（one-wayanova）和最小顯著差數(shù)法（least-significantdifference，lsd）或dunnettt3非參數(shù)多重比較兩兩基因型生長性狀特征之間的差異性；應(yīng)用一般線性模型（generallinearmodels,glm）過程對葉數(shù)/株、葉長和葉寬性狀與微衛(wèi)星位點的關(guān)聯(lián)性進行最小二乘分析,并對同一位點的各基因型進行多重比較。少根紫萍葉長和葉寬均與sp10、sp14、sp42、sp47、sp51、sp52和sp53顯著相關(guān)（除sp51位點p<0.05，其余p<0.001）。
微衛(wèi)星標記掃描：
用毛細管電泳檢測2個微衛(wèi)星標記的少根紫萍。結(jié)果顯示，3個少根紫萍克隆為3個不同的mlgs。
表1少根紫萍3個克隆在2個微衛(wèi)星位點的基因型
表2七個微衛(wèi)星位點不同基因型在少根紫萍葉生長性狀的多重比較
少根紫萍3個克隆經(jīng)培養(yǎng)獲得143~165個分株，葉片總數(shù)為448~581。由表2可看出少根紫萍葉長和葉寬均與sp10、sp14、sp42、sp47、sp51、sp52和sp53顯著相關(guān)（除sp51位點p<0.05，其余p<0.001）。
本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進行贅述。
以上所述的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行了詳細說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
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<110>浙江海洋大學
<120>篩選與少根浮萍葉生長相關(guān)的分子標記的方法
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