本發(fā)明涉及生防菌劑，具體涉及一種蘋果樹(shù)腐爛病生防菌劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蘋果樹(shù)腐爛病(valsamalimiyabeetyamada)俗稱爛皮病、臭皮病，是由黑腐皮殼屬(valsaceratosperma)引起的北方蘋果樹(shù)重要的病害。該病主要危害3年生以上的結(jié)果樹(shù)，造成樹(shù)勢(shì)衰弱、枝干枯死、死樹(shù)甚至毀園。該病癥狀主要以潰瘍型為主。潰瘍型在早春樹(shù)干、樹(shù)皮上出現(xiàn)紅褐色、水漬狀、微隆起、圓至長(zhǎng)圓形病斑，質(zhì)地松軟，易撕裂，手壓容易凹陷，流出黃褐色汁液，有酒糟味。后期干縮下陷，病部邊緣裂縫，有明顯的小黑點(diǎn)即分生孢子器，潮濕時(shí)小黑點(diǎn)涌出橘黃色卷須分生孢子。一般3-5月份侵染，7-8月開(kāi)始發(fā)病，早春為發(fā)病高峰期。

蘋果樹(shù)腐爛病的防治一直以化學(xué)農(nóng)藥防治為主，但化學(xué)農(nóng)藥長(zhǎng)期并大量的使用已經(jīng)造成環(huán)境污染、生態(tài)失衡、人畜中毒及殺傷有益微生物等嚴(yán)重問(wèn)題。目前生物防治越來(lái)越受到廣大研究者和果農(nóng)的認(rèn)可，因此開(kāi)發(fā)安全性高、環(huán)境兼容性好、有效性持久的生物防治劑成為植物真菌病害綜合防治的熱點(diǎn)研究方向。

目前，已經(jīng)公開(kāi)的防治蘋果樹(shù)腐爛病的生防菌劑涉及細(xì)菌和真菌的較多，比如：

中國(guó)專利cn105331545a公開(kāi)了一種防治蘋果樹(shù)腐爛病的菌株、微生物菌劑及其制備方法。所述菌株61239已于2015年7月1日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccm2015420。生防真菌來(lái)源于自然界中，無(wú)污染、無(wú)公害、無(wú)殘留，對(duì)人畜無(wú)毒副作用，無(wú)論是對(duì)蘋果樹(shù)還是對(duì)人體、生態(tài)環(huán)境都相當(dāng)?shù)陌踩?，可運(yùn)用于蘋果樹(shù)的任何生育期，特別是休眠期，不產(chǎn)生任何抗性，可徹底控制和根治蘋果腐爛病。實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病菌特異性強(qiáng)，控制效果好，平均防效在95％以上。所述菌株61239對(duì)蘋果腐爛病菌具有顯著的抑菌和殺菌活性，特別是能以蘋果樹(shù)體上的老翹皮、各個(gè)剪鋸口處死組織上的纖維素和木質(zhì)素為養(yǎng)分，長(zhǎng)期定殖存活于蘋果樹(shù)上，既能預(yù)防新病斑的產(chǎn)生，又能防止原有老疤的復(fù)發(fā)，可持久地控制蘋果腐爛病菌，從而達(dá)到徹底控制和根治蘋果腐爛病的目的。

中國(guó)專利cn105284902a公開(kāi)了一種防治蘋果樹(shù)腐爛病生防菌發(fā)酵液制備方法；所述菌株sl17和sl18均為枯草芽孢桿菌，已于2015年保藏于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所菌種庫(kù)，菌株sl17保藏編號(hào)為saasipplf17，菌株sl18保藏編號(hào)為saasipplf18。該專利對(duì)所述菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)并濃縮后制得發(fā)酵液藥劑及發(fā)酵液膏劑，有效防治蘋果樹(shù)腐爛病，治愈率約80％，促進(jìn)傷口愈合，傷口愈合平均寬度為9.46cm²，病斑復(fù)發(fā)率為4.21％。

中國(guó)專利cn102851225a公開(kāi)了一株微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌及其在蘋果樹(shù)腐爛病生方劑中的應(yīng)用，所述菌株bj1保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：cctccno:2011475，實(shí)驗(yàn)表明，微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌bj1在蘋果離體枝條防效實(shí)驗(yàn)中。發(fā)酵濾液對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病的防效達(dá)94.97％，在2-3年生蘋果樹(shù)幼樹(shù)防效實(shí)驗(yàn)中也達(dá)70％以上，防效穩(wěn)定，對(duì)環(huán)境友好，發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉；

但是，細(xì)菌和真菌產(chǎn)生的抑菌性生物活性物質(zhì)種類少，產(chǎn)量低，活性低，持效期短，防病效果不理想。

放線菌對(duì)靶標(biāo)菌發(fā)揮生防作用一般通過(guò)兩種途徑：在寄主體外通過(guò)抗生作用、競(jìng)爭(zhēng)作用、捕食和重寄生作用，導(dǎo)致病原菌的致病性及侵染效率降低；放線菌也可在寄主植物組織內(nèi)，誘發(fā)其產(chǎn)生抗性或者產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，影響病原菌的生長(zhǎng)、繁殖，最后導(dǎo)致其死亡。

鏈霉菌是一種放線菌，其產(chǎn)生的抗生素、胞外酶等抗真菌活性物質(zhì)比益生細(xì)菌和真菌所產(chǎn)生的活性物質(zhì)種類更多、活性更強(qiáng)，用其孢子和菌絲制成的活細(xì)胞制劑無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)殘留、不傷害非靶標(biāo)微生物、與環(huán)境兼容性好、防病持效期長(zhǎng)，且產(chǎn)孢量大、孢子抗逆性強(qiáng)、易于制成活細(xì)胞制劑如孢子粉劑、種衣劑、菌絲體培養(yǎng)物等以及便于生產(chǎn)和運(yùn)輸保存。被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)病害的生物防治。

目前，公開(kāi)的防治蘋果樹(shù)腐爛病的鏈霉菌較少，比如：

中國(guó)專利cn104673723a公開(kāi)了一種極長(zhǎng)鏈霉菌株sl01(streptomyceslongissimussl01)及由該菌株制備的微生物菌劑(發(fā)酵液及發(fā)酵濾液)。該發(fā)明還公開(kāi)了兩種微生物菌劑在防治蘋果樹(shù)腐爛病中的應(yīng)用。采用不同處理方法涂抹菌株sl01發(fā)酵液及發(fā)酵濾液發(fā)現(xiàn)，離體枝條和果實(shí)的防效均達(dá)到90％，與藥劑對(duì)照甲基硫菌靈達(dá)到同一水平；2012年大田試驗(yàn)中，刮病斑后涂抹sl01菌劑防治效果100％，劃線后涂抹防效為58％；2013年大田試驗(yàn)中，刮病斑后涂抹sl01菌劑防治效果97.8％，超過(guò)甲基硫菌靈藥劑對(duì)照的防效(84.6％)，劃線后涂抹防效為64.4％，均可有效降低為防治蘋果樹(shù)腐爛病而大量施用化學(xué)農(nóng)藥所造成的對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞，具有很好的生態(tài)和社會(huì)效益，開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景廣闊。

中國(guó)專利cn101822272b公開(kāi)了一種灰黃鏈霉菌在生物防治植物病害中的應(yīng)用。該應(yīng)用具體為灰黃鏈霉菌(streptomycesgriseoflavus)nmg6-3-9cgmccno.3441在生物防治植物病害中的應(yīng)用。該菌株對(duì)苜蓿根腐病病原菌具有非常好的拮抗作用，能夠用于生物防治苜蓿根腐病及其它多種植物病害，在生物防治植物病害領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。該發(fā)明為苜蓿根腐病的生物防治奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為該病生防放線菌制劑的研制與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。張清明等研究了伍卡爾鏈霉菌發(fā)酵濾液對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病的防效達(dá)70％。

上述公開(kāi)的鏈霉菌防病效果仍不很理想，且防病機(jī)理同大多數(shù)細(xì)菌和真菌一樣，主要是通過(guò)代謝產(chǎn)生抗生素、抗菌肽等抗菌物質(zhì)產(chǎn)生拮抗效應(yīng)抑制病原菌的生長(zhǎng)和繁殖，防病效果不徹底，不能根治蘋果樹(shù)腐爛病。

研究表明：病原菌的細(xì)胞壁以幾丁質(zhì)、纖維素為骨架，以β-1,3-葡聚糖及蛋白質(zhì)為主要填充物。放線菌是抗生素的主要產(chǎn)生菌，生防放線菌除通過(guò)抗生素的拮抗作用抑制病原菌外，在常規(guī)誘導(dǎo)物的作用下，產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶等胞外水解酶的放線菌對(duì)病原菌有抑菌作用，如果能直接以蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體為營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖，并且誘導(dǎo)生防菌自身產(chǎn)生多種可降解病原菌細(xì)胞壁的胞外水解酶，通過(guò)協(xié)同酶溶作用使病原菌細(xì)胞崩解，不僅可直接殺死病原菌，而且可長(zhǎng)期定殖在蘋果樹(shù)腐爛病斑處，徹底防止蘋果樹(shù)腐爛病的發(fā)生，提高防病效果，有效防止腐爛病復(fù)發(fā)。

綜上，制備一種可以直接以蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體為營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖，同時(shí)誘導(dǎo)生防菌自身產(chǎn)生多種可降解病原菌細(xì)胞壁的胞外水解酶以提高防病效果，防止蘋果樹(shù)腐爛病復(fù)發(fā)的蘋果樹(shù)腐爛病生防菌劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員的期盼。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有蘋果樹(shù)腐爛病生防菌劑的缺陷，將可以直接以蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體為營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖，同時(shí)能夠誘導(dǎo)自身產(chǎn)生多種可降解病原菌細(xì)胞壁的胞外水解酶，且可以長(zhǎng)期定殖于蘋果樹(shù)腐爛病病斑處的微白黃鏈霉菌actin-1經(jīng)固體發(fā)酵制成孢子原粉，然后與紫外保護(hù)劑、分散劑、載體等助劑科學(xué)篩選、復(fù)配，提供一種有效提高防病效果，防止蘋果樹(shù)腐爛病復(fù)發(fā)的生防菌劑。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種蘋果樹(shù)腐爛病生防菌劑，主要由以下重量份數(shù)的原料制備：

微白黃鏈霉菌孢子原粉53-61份，載體36-44份，紫外保護(hù)劑1-3份，分散劑0.8-1.2份；

優(yōu)選地，所述蘋果樹(shù)腐爛病生防菌劑，主要由以下重量份數(shù)的原料制備：

微白黃鏈霉菌孢子原粉55-59份，載體38-42份，紫外保護(hù)劑1.5-2.5份，分散劑0.9-1.1份；

更優(yōu)選地，所述蘋果樹(shù)腐爛病生防菌劑，主要由以下重量份數(shù)的原料制備：

微白黃鏈霉菌孢子原粉57份，載體40份，紫外保護(hù)劑2份，分散劑1.0份；

優(yōu)選地，所述微白黃鏈霉菌孢子原粉是將微白黃鏈霉菌菌種經(jīng)活化、產(chǎn)孢制備成孢子懸液，然后繼續(xù)液體發(fā)酵制得發(fā)酵種子液，最后將其接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)發(fā)酵，晾干、粉碎、過(guò)篩而成；

更優(yōu)選地，所述微白黃鏈霉菌孢子原粉的制備方法，包括如下步驟：

1)發(fā)酵種子液的制備：將微白黃鏈霉菌菌種劃線接種于高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，28-32℃培養(yǎng)6-8天至產(chǎn)孢；然后向斜面加入5ml無(wú)菌水，用滅菌接種針將孢子刮下，加入無(wú)菌水中，震蕩混勻，調(diào)整孢子濃度為0.5-1.5×10⁶個(gè)/ml得孢子懸液；將所述孢子懸液按接種量1％(v/v)接種到液體種子培養(yǎng)基中，28-32℃，180-220r/min，搖瓶培養(yǎng)46-50h即得發(fā)酵種子液；

2)固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：按照固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方，先用部分水將k2hpo4、mgso4·7h2o溶解，然后與其它原料混勻，分裝至滅菌袋，于121℃滅菌45min，冷卻至35℃；平鋪于長(zhǎng)70cm，寬50cm，深5cm滅菌后的曲盤中，料層厚度1-3cm；

3)固體發(fā)酵：按體積質(zhì)量比10％的接種量將步驟1)發(fā)酵種子液接種至步驟2)盛有固體發(fā)酵培養(yǎng)基的曲盤中；底層用滅菌的報(bào)紙覆蓋，上層用滅菌的麻包覆蓋，移入曲房；于溫度28-32℃、濕度64-66％培養(yǎng)22-26h后將麻包、報(bào)紙掀開(kāi)，翻耙，然后依次將報(bào)紙、麻包覆蓋，每22-26h重復(fù)操作一次；同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)至94-98h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、過(guò)120目篩即得微白黃鏈霉菌孢子原粉；

所述高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)量組成：可溶性淀粉：20g，k2hpo4·3h2o：0.5g，nacl：0.5g，kno3：1g，mgso4·7h2o：0.5g，feso4·7h2o：0.01g，蒸餾水：1l，瓊脂：20g，ph值7.2-7.4；

所述液體種子培養(yǎng)基質(zhì)量組成：玉米粉：10g，豆餅粉：10g，淀粉：10g，k2hpo4：0.2g，自來(lái)水：1l，ph值7.2；

所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量組成為：棉籽皮：160g，麩皮：280g，玉米粉：120g，豆餅粉120g，碳酸鈣：10g，k2hpo4：2g，mgso4·7h2o：2g，生石灰：5g，自來(lái)水：1l，ph值7.0；

所述微白黃鏈霉菌具體為微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1，是從山東省煙臺(tái)市果園土壤中分離、純化、篩選得到的，保藏編號(hào)為cgmccno.13927，分類命名為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavus；

所述微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1生長(zhǎng)溫度范圍為15-45℃，最適生長(zhǎng)溫度為30℃；耐受ph值范圍為3.0-10.0，最適生長(zhǎng)ph值為7.0；可耐受1-10％的氯化鈉溶液，生長(zhǎng)良好，在濃度為3-5％時(shí)生長(zhǎng)最好；能夠在多種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；

所述微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌的抑菌率為89.82％；對(duì)貝倫格葡萄座腔菌、鏈格孢蘋果?；?、惡疫霉、櫻桃鏈格孢菌、大麗輪枝菌、櫻桃球腔菌、立枯絲核菌、灰葡萄孢霉菌、炭疽病菌、蘋果鏈格孢等多種病原菌具有較好的抑菌效果，抑菌率為76.08-87.10％，具有廣譜抑菌性；

所述微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1在以蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(液體和瓊脂)中能夠正常生長(zhǎng)、繁殖，具有以下特性：

1)誘導(dǎo)自身產(chǎn)生多種胞外水解酶，其中幾丁質(zhì)酶活性峰值為140.26u/ml；β-1,3-葡聚糖酶活性峰值為49.46u/ml；多酚氧化酶活性峰值為39.25u/ml；蛋白酶活性峰值為10.90u/ml；

2)對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌的孢子萌發(fā)有抑制作用：無(wú)菌水對(duì)照處理，蘋果樹(shù)腐爛病病原菌孢子萌發(fā)率為98.60％，而加入微白黃鏈霉菌粗酶液處理，蘋果樹(shù)腐爛病病原菌孢子萌發(fā)率僅僅為3.60％，較對(duì)照抑制率提高96.35％；

3)對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體有明顯的溶解作用：與無(wú)菌水比較，72h時(shí)粗酶液處理的病原菌氣生菌絲體下陷，溶菌圈直徑可達(dá)6mm，產(chǎn)生明顯溶解作用。蛋白酶k溶解作用最顯著，溶解圈直徑為10mm。而無(wú)菌水對(duì)照ck未出現(xiàn)菌絲溶解現(xiàn)象，僅表現(xiàn)出水滴作用的壓痕；

4)對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌有顯著的抑菌效果：能產(chǎn)生活性較強(qiáng)的抑菌物質(zhì)，抑菌率可達(dá)96.7％；

所述微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1經(jīng)傳30代后，對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌及其他病原菌的抑菌活性與微白黃鏈霉菌actin-1第1代抑菌率基本一致，表明本發(fā)明所述的微白黃鏈霉菌actin-1不會(huì)隨傳代次數(shù)的增加而降低抑制活性，具有較高的遺傳穩(wěn)定性。

優(yōu)選地，所述載體為碳酸鈣、硅藻土、活性炭、鈣基膨潤(rùn)土中的任意一種；

更優(yōu)選地，所述載體為硅藻土。

優(yōu)選地，所述分散劑為十二烷基硫酸鈉、可溶性淀粉、羧甲基纖維素鈉、木質(zhì)素磺酸鈉中的任意一種；

更優(yōu)選地，所述分散劑為可溶性淀粉。

優(yōu)選地，所述紫外保護(hù)劑為腐殖酸、糊精、海藻酸鈉、甲基纖維素中的任意一種；

更優(yōu)選地，所述紫外保護(hù)劑為腐殖酸。

本發(fā)明另一目的是提供上述蘋果樹(shù)腐爛病生防菌劑的制備方法，包括如下步驟：按照配方，準(zhǔn)確稱量微白黃鏈霉菌孢子原粉、載體、紫外保護(hù)劑、分散劑，按照等量遞增法混合均勻即得蘋果樹(shù)腐爛病生防菌劑。

上述方法制備的生防菌劑菌活量為6.2-6.9×10¹²cfu/g。

本發(fā)明還提供上述蘋果樹(shù)腐爛病生防菌劑在防治蘋果樹(shù)腐爛病方面的應(yīng)用。

經(jīng)田間蘋果樹(shù)腐爛病病斑的刮除治療試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1可有效防止蘋果樹(shù)腐爛病復(fù)發(fā)，防治效果為100％，復(fù)發(fā)率為0，且可以長(zhǎng)期定殖于已經(jīng)治愈的蘋果樹(shù)腐爛病病斑處，發(fā)揮長(zhǎng)期的生物防治作用。

有益效果：

1.本發(fā)明生防菌劑中微白黃鏈霉菌actin-1可以以蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體為營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖，利于生防菌在蘋果樹(shù)腐爛病斑處長(zhǎng)期定殖，發(fā)揮長(zhǎng)期的生物防治作用，同時(shí)誘導(dǎo)自身產(chǎn)生多種胞外細(xì)胞壁水解酶，通過(guò)協(xié)同酶溶作用使病原菌細(xì)胞崩解，并且能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的抗菌活性物質(zhì)，對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，多種機(jī)制共同作用阻止蘋果樹(shù)腐爛病病原菌的生長(zhǎng)、繁殖，大大提高了對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病的生防效果。

2.本發(fā)明生防菌劑中微白黃鏈霉菌actin-1對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌的抑菌率為89.82％；對(duì)貝倫格葡萄座腔菌、鏈格孢蘋果專化型、惡疫霉、櫻桃鏈格孢菌、大麗輪枝菌、櫻桃球腔菌、立枯絲核菌、灰葡萄孢霉菌、炭疽病菌、蘋果鏈格孢等多種病原菌具有較好的抑菌效果，抑菌率為76.08-87.10％，具有廣譜抑菌性；

3.本發(fā)明生防菌劑中微白黃鏈霉菌actin-1耐受溫度高，可以在45℃的條件下保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，說(shuō)明微白黃鏈霉菌actin-1不僅在發(fā)酵過(guò)程中可以保持較強(qiáng)的菌種活力，另一方面也可以說(shuō)明，其生防菌劑在應(yīng)用于病原菌的防治過(guò)程中，不僅在常溫條件下可以保持顯著的抑菌效果，而且可以在高溫天氣，仍然保持良好的菌株活力以及抑菌效力，具有較強(qiáng)的耐候性。

4.本發(fā)明生防菌劑中微白黃鏈霉菌actin-1具有耐酸性和耐堿性，在ph值3.0-10酸堿范圍內(nèi)，仍然呈現(xiàn)良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，不僅在發(fā)酵過(guò)程中可以保持較強(qiáng)的菌種活力，在生防菌劑應(yīng)用于病原菌的防治過(guò)程中，也可以抵抗外界不同的酸堿環(huán)境，同時(shí)保持較高的抑菌活力，耐酸堿性強(qiáng)。

5.本發(fā)明生防菌劑中微白黃鏈霉菌actin-1經(jīng)傳30代后，對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌及其他病原菌的抑菌活性與微白黃鏈霉菌actin-1第1代抑菌率基本一致，表明微白黃鏈霉菌actin-1不會(huì)隨傳代次數(shù)的增加而降低抑制活性，具有較高的遺傳穩(wěn)定性。

6.本發(fā)明生防菌劑中微白黃鏈霉菌actin-1發(fā)酵活力高，通過(guò)液體發(fā)酵種子液和固體發(fā)酵及助劑的選擇最終獲得菌活量為6.2-6.9×10¹²cfu/g的生防菌劑，在蘋果樹(shù)腐爛病應(yīng)用上防治效果達(dá)100％，復(fù)發(fā)率為零，同時(shí)該菌還可促進(jìn)病斑傷口愈傷組織的愈合。再分離實(shí)驗(yàn)表明微白黃鏈霉菌actin-1成功在蘋果樹(shù)腐爛病病斑出長(zhǎng)期定殖，且定殖率很高。

本發(fā)明生防菌劑具有防治效果好(抑菌率高)、效率高(徹底降解病原菌細(xì)胞)、復(fù)發(fā)率低(病斑處定殖能力強(qiáng))、適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)(耐高溫、耐酸堿性強(qiáng))、穩(wěn)定強(qiáng)(遺傳穩(wěn)定性強(qiáng))、不易產(chǎn)生抗藥性等多重優(yōu)點(diǎn)，是生物防治的首選，對(duì)提高蘋果樹(shù)腐爛病等果蔬病原菌的防治效果、防止病原菌復(fù)發(fā)、保護(hù)環(huán)境具有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1實(shí)施例9對(duì)照組正常菌絲鏡檢圖；

圖2實(shí)施例9處理組變異菌絲鏡檢圖；

圖3生防菌劑治愈蘋果樹(shù)腐爛病病斑4年后的蘋果樹(shù)腐爛病病斑愈合效果圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

一種蘋果樹(shù)腐爛病生防菌劑，主要由以下重量份數(shù)的原料制備：微白黃鏈霉菌孢子原粉57份，載體40份，紫外保護(hù)劑2份，分散劑1.0份；

所述微白黃鏈霉菌孢子原粉的制備方法，包括如下步驟：

1)發(fā)酵種子液的制備：將微白黃鏈霉菌菌種劃線接種于高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，30℃培養(yǎng)7天至產(chǎn)孢；然后向斜面加入5ml無(wú)菌水，用滅菌接種針將孢子刮下，加入無(wú)菌水中，震蕩混勻，調(diào)整孢子濃度為1×10⁶個(gè)/ml得孢子懸液；將所述孢子懸液按接種量1％(v/v)接種到液體種子培養(yǎng)基中，30℃，200r/min，搖瓶培養(yǎng)48h即得發(fā)酵種子液；

2)固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：按照固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方，先用部分水將k2hpo4、mgso4·7h2o溶解，然后與其它原料混勻，分裝至滅菌袋，于121℃滅菌45min，冷卻至35℃；平鋪于長(zhǎng)70cm，寬50cm，深5cm滅菌后的曲盤中，料層厚度2cm；

3)固體發(fā)酵：按體積質(zhì)量比10％的接種量將步驟1)發(fā)酵種子液接種至步驟2)盛有固體發(fā)酵培養(yǎng)基的曲盤中；底層用滅菌的報(bào)紙覆蓋，上層用滅菌的麻包覆蓋，移入曲房；于溫度30℃、濕度65％培養(yǎng)24h后將麻包、報(bào)紙掀開(kāi)，翻耙，然后依次將報(bào)紙、麻包覆蓋，每24h重復(fù)操作一次；同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)至96h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、過(guò)120目篩即得微白黃鏈霉菌孢子原粉；

所述高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)量組成：可溶性淀粉：20g，k2hpo4·3h2o：0.5g，nacl：0.5g，kno3：1g，mgso4·7h2o：0.5g，feso4·7h2o：0.01g，蒸餾水：1l，瓊脂：20g，ph值7.3；

所述液體種子培養(yǎng)基質(zhì)量組成：玉米粉：10g，豆餅粉：10g，淀粉：10g，k2hpo4：0.2g，自來(lái)水：1l，ph值7.2；

所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量組成為：棉籽皮：160g，麩皮：280g，玉米粉：120g，豆餅粉120g，碳酸鈣：10g，k2hpo4：2g，mgso4·7h2o：2g，生石灰：5g，自來(lái)水：1l，ph值7.0；

所述微白黃鏈霉菌具體為微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1，保藏編號(hào)為cgmccno.13927，分類命名為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavus；

所述載體為硅藻土；

所述分散劑為可溶性淀粉；

所述紫外保護(hù)劑為腐殖酸；

制備方法，包括如下步驟：按照配方，準(zhǔn)確稱量微白黃鏈霉菌孢子原粉、載體、紫外保護(hù)劑、分散劑，按照等量遞增法混合均勻即得蘋果樹(shù)腐爛病生防菌劑。

上述方法制備的生防菌劑菌活量為6.9×10¹²cfu/g。

實(shí)施例2

一種蘋果樹(shù)腐爛病生防菌劑，主要由以下重量份數(shù)的原料制備：微白黃鏈霉菌孢子原粉55份，載體38份，紫外保護(hù)劑1.5份，分散劑0.9份；

所述微白黃鏈霉菌孢子原粉的制備方法，包括如下步驟：

1)發(fā)酵種子液的制備：將微白黃鏈霉菌菌種劃線接種于高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，28℃培養(yǎng)6天至產(chǎn)孢；然后向斜面加入5ml無(wú)菌水，用滅菌接種針將孢子刮下，加入無(wú)菌水中，震蕩混勻，調(diào)整孢子濃度為1.5×10⁶個(gè)/ml得孢子懸液；將所述孢子懸液按接種量1％(v/v)接種到液體種子培養(yǎng)基中，28℃，180r/min，搖瓶培養(yǎng)46h即得發(fā)酵種子液；

2)固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：按照固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方，先用部分水將k2hpo4、mgso4·7h2o溶解，然后與其它原料混勻，分裝至滅菌袋，于121℃滅菌45min，冷卻至35℃；平鋪于長(zhǎng)70cm，寬50cm，深5cm滅菌后的曲盤中，料層厚度1cm；

3)固體發(fā)酵：按體積質(zhì)量比10％的接種量將步驟1)發(fā)酵種子液接種至步驟2)盛有固體發(fā)酵培養(yǎng)基的曲盤中；底層用滅菌的報(bào)紙覆蓋，上層用滅菌的麻包覆蓋，移入曲房；于溫度28℃、濕度64％培養(yǎng)22h后將麻包、報(bào)紙掀開(kāi)，翻耙，然后依次將報(bào)紙、麻包覆蓋，每22h重復(fù)操作一次；同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)至94h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、過(guò)120目篩即得微白黃鏈霉菌孢子原粉；

所述高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量組成同實(shí)施例1；

所述微白黃鏈霉菌具體為微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1，保藏編號(hào)為cgmccno.13927，分類命名為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavus；

所述載體為碳酸鈣；

所述分散劑為十二烷基硫酸鈉；

所述紫外保護(hù)劑為海藻酸鈉；

制備方法同實(shí)施例1；

上述方法制備的生防菌劑菌活量為6.8×10¹²cfu/g。

實(shí)施例3

一種蘋果樹(shù)腐爛病生防菌劑，主要由以下重量份數(shù)的原料制備：微白黃鏈霉菌孢子原粉59份，載體42份，紫外保護(hù)劑2.5份，分散劑1.1份；

所述微白黃鏈霉菌孢子原粉的制備方法，包括如下步驟：

1)發(fā)酵種子液的制備：將微白黃鏈霉菌菌種劃線接種于高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，32℃培養(yǎng)8天至產(chǎn)孢；然后向斜面加入5ml無(wú)菌水，用滅菌接種針將孢子刮下，加入無(wú)菌水中，震蕩混勻，調(diào)整孢子濃度為0.5×10⁶個(gè)/ml得孢子懸液；將所述孢子懸液按接種量1％(v/v)接種到液體種子培養(yǎng)基中，32℃，220r/min，搖瓶培養(yǎng)50h即得發(fā)酵種子液；

2)固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：按照固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方，先用部分水將k2hpo4、mgso4·7h2o溶解，然后與其它原料混勻，分裝6個(gè)滅菌袋進(jìn)行121℃滅菌45min，冷卻至35℃；平鋪于長(zhǎng)70cm，寬50cm，深5cm滅菌后的曲盤中，料層厚度3cm；

3)固體發(fā)酵：按體積質(zhì)量比10％的接種量將步驟1)發(fā)酵種子液接種至步驟2)盛有固體發(fā)酵培養(yǎng)基的曲盤中；底層用滅菌的報(bào)紙覆蓋，上層用滅菌的麻包覆蓋，移入曲房；于溫度32℃、濕度66％培養(yǎng)26h后將麻包、報(bào)紙掀開(kāi)，翻耙，然后依次將報(bào)紙、麻包覆蓋，每26h重復(fù)操作一次；同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)至98h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、過(guò)120目篩即得微白黃鏈霉菌孢子原粉；

所述高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量組成同實(shí)施例1；

所述微白黃鏈霉菌具體為微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1，保藏編號(hào)為cgmccno.13927，分類命名為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavus；

所述載體為活性炭；

所述分散劑為羧甲基纖維素鈉；

所述紫外保護(hù)劑為糊精；

制備方法同實(shí)施例1；

上述方法制備的生防菌劑菌活量為6.6×10¹²cfu/g。

實(shí)施例4

一種蘋果樹(shù)腐爛病生防菌劑，主要由以下重量份數(shù)的原料制備：微白黃鏈霉菌孢子原粉53份，載體36份，紫外保護(hù)劑1份，分散劑0.8份；

所述微白黃鏈霉菌孢子原粉的制備方法，包括如下步驟：

1)發(fā)酵種子液的制備：將微白黃鏈霉菌菌種劃線接種于高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，28℃培養(yǎng)8天至產(chǎn)孢；然后向斜面加入5ml無(wú)菌水，用滅菌接種針將孢子刮下，加入無(wú)菌水中，震蕩混勻，調(diào)整孢子濃度為0.5×10⁶個(gè)/ml得孢子懸液；將所述孢子懸液按接種量1％(v/v)接種到液體種子培養(yǎng)基中，32℃，180r/min，搖瓶培養(yǎng)50h即得發(fā)酵種子液；

2)固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：按照固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方，先用部分水將k2hpo4、mgso4·7h2o溶解，然后與其它原料混勻，分裝至滅菌袋，于121℃滅菌45min，冷卻至35℃；平鋪于長(zhǎng)70cm，寬50cm，深5cm滅菌后的曲盤中，料層厚度1cm；

3)固體發(fā)酵：按體積質(zhì)量比10％的接種量將步驟1)發(fā)酵種子液接種至步驟2)盛有固體發(fā)酵培養(yǎng)基的曲盤中；底層用滅菌的報(bào)紙覆蓋，上層用滅菌的麻包覆蓋，移入曲房；于溫度28℃、濕度66％培養(yǎng)26h后將麻包、報(bào)紙掀開(kāi)，翻耙，然后依次將報(bào)紙、麻包覆蓋，每22h重復(fù)操作一次；同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)至98h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、過(guò)120目篩即得微白黃鏈霉菌孢子原粉；

所述高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量組成同實(shí)施例1；

所述微白黃鏈霉菌具體為微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1，保藏編號(hào)為cgmccno.13927，分類命名為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavus；

所述載體為鈣基膨潤(rùn)土；

所述分散劑為木質(zhì)素磺酸鈉；

所述紫外保護(hù)劑為甲基纖維素；

制備方法同實(shí)施例1；

上述方法制備的生防菌劑菌活量為6.4×10¹²cfu/g。

實(shí)施例5

一種蘋果樹(shù)腐爛病生防菌劑，主要由以下重量份數(shù)的原料制備：微白黃鏈霉菌孢子原粉61份，載體44份，紫外保護(hù)劑3份，分散劑1.2份；

所述微白黃鏈霉菌孢子原粉的制備方法，包括如下步驟：

1)發(fā)酵種子液的制備：將微白黃鏈霉菌菌種劃線接種于高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，32℃培養(yǎng)6天至產(chǎn)孢；然后向斜面加入5ml無(wú)菌水，用滅菌接種針將孢子刮下，加入無(wú)菌水中，震蕩混勻，調(diào)整孢子濃度為0.5×10⁶個(gè)/ml得孢子懸液；將所述孢子懸液按接種量1％(v/v)接種到液體種子培養(yǎng)基中，32℃，180r/min，搖瓶培養(yǎng)50h即得發(fā)酵種子液；

2)固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：按照固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方，先用部分水將k2hpo4、mgso4·7h2o溶解，然后與其它原料混勻，分裝至滅菌袋，于121℃滅菌45min，冷卻至35℃；平鋪于長(zhǎng)70cm，寬50cm，深5cm滅菌后的曲盤中，料層厚度3cm；

3)固體發(fā)酵：按體積質(zhì)量比10％的接種量將步驟1)發(fā)酵種子液接種至步驟2)盛有固體發(fā)酵培養(yǎng)基的曲盤中；底層用滅菌的報(bào)紙覆蓋，上層用滅菌的麻包覆蓋，移入曲房；于溫度32℃、濕度64％培養(yǎng)22h后將麻包、報(bào)紙掀開(kāi)，翻耙，然后依次將報(bào)紙、麻包覆蓋，每26h重復(fù)操作一次；同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)至94h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、過(guò)120目篩即得微白黃鏈霉菌孢子原粉；

所述高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量組成同實(shí)施例1；

所述微白黃鏈霉菌具體為微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1，保藏編號(hào)為cgmccno.13927，分類命名為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavus；

所述載體為硅藻土；

所述分散劑為可溶性淀粉；

所述紫外保護(hù)劑為海藻酸鈉；

制備方法同實(shí)施例1；

上述方法制備的生防菌劑菌活量為6.5×10¹²cfu/g。

實(shí)施例6

一種蘋果樹(shù)腐爛病生防菌劑，主要由以下重量份數(shù)的原料制備：微白黃鏈霉菌孢子原粉56份，載體40份，紫外保護(hù)劑3份，分散劑1.0份；

所述微白黃鏈霉菌孢子原粉的制備方法同實(shí)施例1；

所述高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量組成同實(shí)施例1；

所述微白黃鏈霉菌具體為微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1，保藏編號(hào)為cgmccno.13927，分類命名為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavus；

所述載體、紫外保護(hù)劑、分散劑為本領(lǐng)域常規(guī)市售產(chǎn)品；

制備方法同實(shí)施例1；

上述方法制備的生防菌劑菌活量為6.2×10¹²cfu/g。

實(shí)施例7微白黃鏈霉菌actin-1生長(zhǎng)溫度及耐酸堿試驗(yàn)

微白黃鏈霉菌actin-1孢子懸液的制備：將微白黃鏈霉菌actin-1劃線接種于高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，30℃培養(yǎng)7天至產(chǎn)孢；加入5ml無(wú)菌水，用滅菌接種針將孢子刮入無(wú)菌水中，震蕩混勻，調(diào)整孢子濃度為1×10⁶個(gè)/ml得到孢子懸液。

1.生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)

配制2216e液體培養(yǎng)基，分裝于48個(gè)500ml三角瓶中，100ml/瓶，121℃滅菌30min，備用；將上述孢子懸液按照5‰(v/v)接種于其中的36個(gè)三角瓶中，作為處理組，不接種的12個(gè)三角瓶作為對(duì)照組，按照0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃溫度梯度分組，每組3個(gè)處理1個(gè)對(duì)照進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)條件200rpm震蕩培養(yǎng)5天，觀察并記錄各溫度下微白黃鏈霉菌actin-1的生長(zhǎng)情況。結(jié)果見(jiàn)表7。

2.耐酸堿性試驗(yàn)

用稀hcl或naoh溶液將2216e液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)成不同ph值(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)，每個(gè)ph值2216e液體培養(yǎng)基分裝4個(gè)500ml三角瓶中，100ml/瓶，于121℃滅菌30min。將上述孢子懸液按5‰(v/v)分別接種到上述裝有不同ph值的2216e液體培養(yǎng)基中。每個(gè)ph值液體培養(yǎng)基接種3個(gè)，設(shè)為處理組，1個(gè)不接種，設(shè)為對(duì)照組，全部于30℃，200rpm震蕩培養(yǎng)5天，記錄各ph值下微白黃鏈霉菌actin-1生長(zhǎng)情況。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1微白黃鏈霉菌actin-1生長(zhǎng)溫度及耐酸堿結(jié)果

注：“+”代表生長(zhǎng)，“-”代表不生長(zhǎng)，“++”代表生長(zhǎng)良好，“+++”代表生長(zhǎng)茂盛。

由表1可以看出，微白黃鏈霉菌actin-1具有較強(qiáng)的耐熱性，可以在45℃的條件生長(zhǎng)，由此說(shuō)明，微白黃鏈霉菌actin-1不僅在常溫條件下可以保持顯著的抑菌效果，而且可以在高溫的天氣，仍然保持良好的菌株活力以及抑菌效力。

微白黃鏈霉菌actin-1具有耐酸性以及極強(qiáng)的耐堿性，在ph值3.0-10.0的酸堿脅迫下，能夠生長(zhǎng)，說(shuō)明微白黃鏈霉菌actin-1不僅在發(fā)酵過(guò)程中可以保持較強(qiáng)的菌種活力，而且在生防菌劑應(yīng)用于病原菌的防治過(guò)程中，也可以抵抗外界不同的酸堿環(huán)境，從而保持較高的抑菌活力。

實(shí)施例8微白黃鏈霉菌actin-1廣譜抑菌性驗(yàn)證及遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)：

進(jìn)行微白黃鏈霉菌actin-1對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌(蘋果黑腐皮殼菌)、蘋果斑點(diǎn)落葉病病原菌(鏈格孢蘋果?；?等11株病原菌的抑菌實(shí)驗(yàn)，具體操作步驟如下：

1)將微白黃鏈霉菌actin-1劃線接種于高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基平板，于30℃培養(yǎng)5天；將蘋果樹(shù)腐爛病病原菌點(diǎn)接于pda培養(yǎng)基平板，于28℃培養(yǎng)7天；獲得活化微白黃鏈霉菌actin-1和活化病原菌；

2)對(duì)峙實(shí)驗(yàn)二：在直徑90mm的pda培養(yǎng)基平板背面畫十字，以十字交叉點(diǎn)為平板圓心，在十字線上距圓心25mm處3個(gè)點(diǎn)分別接種3個(gè)6mm的活化微白黃鏈霉菌actin-1菌餅作為處理組，第4個(gè)點(diǎn)不接菌作為對(duì)照組；在圓心處接種1個(gè)6mm的活化病原菌菌餅；分別置于30℃培養(yǎng)7天，分別統(tǒng)計(jì)對(duì)照病原菌半徑和處理病原菌半徑，計(jì)算抑菌率。

抑菌率(％)＝(對(duì)照病原菌半徑mm-處理病原菌半徑mm)/對(duì)照病原菌半徑mm×100。

將微白黃鏈霉菌actin-1進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并測(cè)定第10代菌、第20代菌和第30代菌對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌(蘋果黑腐皮殼菌)及貝倫格葡萄座腔菌、鏈格孢蘋果?；汀阂呙?、櫻桃鏈格孢菌、大麗輪枝菌、櫻桃球腔菌、立枯絲核菌、灰葡萄孢霉菌、炭疽病菌、蘋果鏈格孢等其他10種病害病原菌的抑菌率，結(jié)果見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)方法同上。

表2微白黃鏈霉菌actin-1不同傳代菌株對(duì)11種病原菌的抑菌率

可以看出，微白黃鏈霉菌actin-1不僅對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌有很強(qiáng)的抑制能力，對(duì)貝倫格葡萄座腔菌、鏈格孢蘋果?；?、惡疫霉、櫻桃鏈格孢菌、大麗輪枝菌、櫻桃球腔菌、立枯絲核菌、灰葡萄孢霉菌、炭疽病菌、蘋果鏈格孢等10種果蔬病原菌的抑制能力也很強(qiáng)，具有廣譜抑菌性。

經(jīng)傳代10代、20代、30代的微白黃鏈菌菌株actin-1對(duì)11種病原菌的抑菌率與第一代相比幾乎沒(méi)有降低，表明本發(fā)明所述的微白黃鏈霉菌actin-1不會(huì)隨傳代次數(shù)的增加而降低對(duì)上述病原菌的抑制活性，具有較高的遺傳穩(wěn)定性。

實(shí)施例9微白黃鏈霉菌actin-1對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲的影響

挑取實(shí)施例8中微白黃鏈霉菌actin-1對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌對(duì)峙實(shí)驗(yàn)二平板處理組邊緣菌絲及空白對(duì)照組菌絲進(jìn)行40倍鏡檢，鏡檢結(jié)果分別見(jiàn)圖2和圖1，鏡檢結(jié)果表明處理組菌絲不正常的分支增多，菌絲頂端膨大分支變異，菌絲頂端或中間有泡囊產(chǎn)生，還有部分菌絲扭曲集結(jié)的現(xiàn)象，說(shuō)明微白黃鏈霉菌actin-1既能抑制蘋果樹(shù)腐爛病病原菌孢子的萌發(fā)也能使病原菌菌絲變異從而抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)。

實(shí)施例10微白黃鏈霉菌actin-1對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體的利用及誘導(dǎo)產(chǎn)酶研究

(1)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體的制備：將蘋果樹(shù)腐爛病病原菌點(diǎn)接于pda培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)7天獲得活化病原菌；挑取所述活化病原菌菌絲，接種到裝有100ml察氏液體培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，30℃、160rpm搖床振蕩培養(yǎng)10天。用滅菌的雙層紗布過(guò)濾收集菌絲體，用去離子水沖洗5-10次至無(wú)殘留培養(yǎng)液，45℃烘干，研磨至細(xì)粉狀，過(guò)60目篩即得；

所述pda培養(yǎng)基質(zhì)量組成為：馬鈴薯(200g)濾液：1l，葡萄糖：20g，瓊脂：20g，ph值自然；

所述察氏液體培養(yǎng)基質(zhì)量組成：nan03：3g，k2hpo4：1g，mgso4·7h2o：0.5g，kcl：0.5g，feso4·7h2o：0.01g，蔗糖：30g，蒸餾水：1l，ph值自然；

(2)粗酶液的制備方法為：

將微白黃鏈霉菌actin-1劃線接種于高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)7天獲得活化鏈霉菌；并用接種環(huán)接種一環(huán)到裝有100ml的液體培養(yǎng)基a、b、c、d的500ml三角瓶中，每種培養(yǎng)基設(shè)3個(gè)重復(fù)，30℃、160rpm搖床培養(yǎng)，在第3、5、7和9天于超凈臺(tái)上用無(wú)菌吸管吸出20ml培養(yǎng)液，將少量無(wú)菌脫脂棉置于漏斗底部過(guò)濾孢子，濾液于4000rpm離心5min，上清液即為粗酶液；

所述基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基a質(zhì)量組成為：蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體：10g，k2hpo4·3h2o：0.5g，kno3：1g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o：10mg，蒸餾水：1l，ph值自然；

所述基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基b質(zhì)量組成為：膠體幾丁質(zhì)：10g，k2hpo4·3h2o：0.5g，kno3：1g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o：10mg，蒸餾水：1l，ph值自然；

所述基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基c質(zhì)量組成為：淀粉：10g，k2hpo4·3h2o：0.5g，kno3：1g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o：10mg，蒸餾水：1l，ph值自然；

所述基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基d質(zhì)量組成為：酵母菌粉：10g，k2hpo4·3h2o：0.5g，kno3：1g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o：10mg，蒸餾水：1l，ph值自然；

所需說(shuō)明的是：基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基a所制備的粗酶液測(cè)定胞外幾丁質(zhì)酶(chitinase)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucosidase)、多酚氧化酶(ppo)及蛋白酶(protease)活性；基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基b制備的粗酶液測(cè)定以膠體幾丁質(zhì)作為幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)時(shí)所產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶活性；基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基c制備的粗酶液測(cè)定以淀粉作為β-1,3-葡聚糖酶和多酚氧化酶誘導(dǎo)物時(shí)產(chǎn)生的β-1,3-葡聚糖酶和多酚氧化酶活性；基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基d制備的粗酶液以酵母菌粉作為蛋白酶誘導(dǎo)物時(shí)產(chǎn)生的蛋白酶活性；

a.幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定：取1ml粗酶液，加1ml10g/l的膠體幾丁質(zhì)，混勻后置于37℃恒溫水浴中水解3h，沸水浴中煮5min終止反應(yīng)，反應(yīng)液于4000rpm離心5min，取1ml上清液或稀釋液用dns法測(cè)定水解液中n-乙酰氨基葡萄糖含量。

將37℃時(shí)1ml酶液在1h內(nèi)水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1μgn-乙酰氨基葡萄糖的幾丁質(zhì)酶活性定義為1u。

結(jié)果：基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基a中添加蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體作為唯一碳能源時(shí)，微白黃鏈霉菌actin-1培養(yǎng)液中可檢出幾丁質(zhì)酶活性，酶活較高。不同培養(yǎng)時(shí)間微白黃鏈霉菌actin-1粗酶液的幾丁質(zhì)酶活性不同，隨培養(yǎng)時(shí)間增加，幾丁質(zhì)酶活性增加，第5天，酶活達(dá)峰值，為140.26u/ml，達(dá)酶活性峰值后隨培養(yǎng)時(shí)間增加酶活性降低；在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基b中以膠體幾丁質(zhì)為誘導(dǎo)時(shí)酶活也是第5天達(dá)峰值，為120.47u/ml，低于病原菌菌絲體的粗酶液的幾丁質(zhì)酶活性。

b.β-1,3-葡聚糖酶活性測(cè)定：取0.5ml粗酶液，加入0.5ml10g/l的昆布多糖，混勻后置于45℃恒溫水浴中水解30min。將水解液置于沸水浴中5min終止反應(yīng)。取1ml水解液或稀釋液用dns法測(cè)定水解液中葡萄糖含量。

將45℃時(shí)1ml酶液在1min內(nèi)水解昆布多糖產(chǎn)生1μg葡萄糖的β-1,3-葡聚糖酶活性定義為1u。

結(jié)果：基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基a中添加蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體作為唯一碳能源時(shí)，微白黃鏈霉菌actin-1培養(yǎng)液中可檢出β-1,3-葡聚糖酶活性，酶活較高。酶活性隨著培養(yǎng)時(shí)間增加而增加，在第7天時(shí)酶活達(dá)到峰值49.46u/ml，達(dá)到峰值后隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，酶活降低；當(dāng)基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基c中以淀粉為誘導(dǎo)物時(shí)，酶活峰值比以菌絲體為碳源時(shí)稍高，達(dá)50.25u/ml。

c.多酚氧化酶活性測(cè)定：取0.02mol/l的鄰苯二酚溶液3ml、0.1mol/l的醋酸鹽緩沖液(ph值4.8)3ml、粗酶液1ml加入到試管中，充分搖勻，于30℃恒溫水浴中水解10min，在400nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，以每分od值變化0.01定義為1u；

結(jié)果：基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基a中添加蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體作為唯一碳能源時(shí)，微白黃鏈霉菌actin-1粗酶液中可檢出多酚氧化酶活性。酶活性隨培養(yǎng)時(shí)間增加而增高，第7天時(shí)酶活性達(dá)峰值39.25u/ml，達(dá)峰值后隨培養(yǎng)時(shí)間增加酶活降低。當(dāng)基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基c中以淀粉為誘導(dǎo)物時(shí),第5天多酚氧化酶的活性達(dá)峰值，為24.91u/ml，低于菌絲體為唯一碳源時(shí)的多酚氧化酶活性。

d.蛋白酶活測(cè)定：福林試劑法，將1ml粗酶液40℃1min水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸的蛋白酶活性定義為1u。

結(jié)果：基礎(chǔ)培養(yǎng)基a中添加蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體作為唯一碳氮能源時(shí),微白黃鏈霉菌actin-1培養(yǎng)液中可檢出蛋白酶活性。培養(yǎng)第7天時(shí)的酶活性為10.90u/ml，表明蘋果樹(shù)腐爛病病原菌絲體對(duì)微白黃鏈霉菌actin-1的蛋白酶合成有誘導(dǎo)作用。微白黃鏈霉菌actin-1在基礎(chǔ)培養(yǎng)基d中以酵母粉作為碳氮能源時(shí)蛋白酶活性第7天達(dá)峰值，為9.90um/l，與以病原菌菌絲體誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白酶活性差異不大。

表3微白黃鏈霉菌actin-14種水解酶峰值活性(u/ml)

(3)微白黃鏈霉菌actin-1粗酶液在皿內(nèi)對(duì)病原菌氣生菌絲的溶解作用：

將蘋果樹(shù)腐爛病病原菌點(diǎn)接于pda培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)7天，用無(wú)菌水洗脫、刮取孢子和菌絲于裝有攪拌子的三角瓶中，得到含蘋果樹(shù)腐爛病病原菌孢子和菌絲的懸液，震蕩、磁力攪拌使孢子充分分散，過(guò)濾除去菌絲得孢子懸液，用無(wú)菌水稀釋使孢子含量為1×10⁷個(gè)/ml得蘋果樹(shù)腐爛病病原菌孢子懸液；將其均勻涂布于pda平板上，28℃下培養(yǎng)8天，待平皿培養(yǎng)基表面均勻長(zhǎng)滿氣生菌絲后，用微量移液器分別吸取50μl步驟(2)中用基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基a所制備的第3天、5天、7天和9天的微白黃鏈霉菌actin-1的粗酶液，以點(diǎn)滴方式滴加于平皿內(nèi)氣生菌絲表面，同時(shí)以10mg/l的蛋白酶k及無(wú)菌水為對(duì)照，30℃培養(yǎng)72h，觀察病原菌氣生菌絲溶解現(xiàn)象。

結(jié)果：微白黃鏈霉菌actin-1對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲有明顯的溶解作用，與無(wú)菌水比較，72h時(shí)觀察，粗酶液處理的病原菌氣生菌絲體下陷，溶菌圈直徑可達(dá)6mm，產(chǎn)生明顯溶解作用。蛋白酶k溶解作用最顯著，溶解圈直徑為10mm。而無(wú)菌水對(duì)照ck未出現(xiàn)菌絲溶解現(xiàn)象，僅表現(xiàn)出水滴作用的壓痕。說(shuō)明微白黃鏈霉菌actin-1在蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體誘導(dǎo)下合成水解酶以及蛋白酶都參與了溶解病原菌的作用。

(4)微白黃鏈霉菌actin-1粗酶液對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌孢子萌發(fā)的影響

蘋果樹(shù)腐爛病病原菌孢子懸液的制備：同步驟(3)；

孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)：取步驟(2)中用基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基a培養(yǎng)7天所制備的微白黃鏈霉菌actin-1的粗酶液2ml按照1:4(v/v)的比例與無(wú)菌水混合，同時(shí)接入100μl上述蘋果樹(shù)腐爛病病原菌孢子懸液，以無(wú)菌水為對(duì)照，30℃避光培養(yǎng)18h后，取50μl萌發(fā)懸液在40倍鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，并按公式計(jì)算萌發(fā)率及抑制率；

萌發(fā)率(％)＝萌發(fā)孢子數(shù)/總孢子數(shù)×100

抑制率(％)＝(對(duì)照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率)/對(duì)照萌發(fā)率×100

結(jié)果：基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基a培養(yǎng)7天所制備的微白黃鏈霉菌actin-1的粗酶液對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌的孢子萌發(fā)有抑制作用。無(wú)菌水對(duì)照處理，蘋果樹(shù)腐爛病病原菌孢子萌發(fā)率為98.60％，而加入微白黃鏈霉菌actin-1粗酶液處理的蘋果樹(shù)腐爛病病原菌孢子萌發(fā)率僅僅為3.60％，較對(duì)照抑制率提高96.35％；

(5)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體添加量對(duì)微白黃鏈霉菌actin-1產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響

將基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基a中蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體量分別設(shè)置為5g/l、10g/l、20g/l三個(gè)濃度處理，將微白黃鏈霉菌actin-1分別接種到裝有100ml上述三個(gè)濃度液體培養(yǎng)的500ml三角瓶中，30℃、160rpm搖床培養(yǎng)7天，發(fā)酵液用無(wú)菌0.22μm濾膜過(guò)濾器過(guò)濾獲得無(wú)菌濾液。將無(wú)菌濾液按照10％(v/v)比例與冷卻至50℃左右的pda培養(yǎng)基進(jìn)行混合，以10％(v/v)無(wú)菌水為對(duì)照，制成平板，于平板中央接種6mm蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌餅，每種處理3個(gè)重復(fù)，7天后，計(jì)算抑菌率。

抑菌率％＝(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-6mm)

結(jié)果：如表4所示不同菌絲體用量時(shí)的抑菌率均在培養(yǎng)第7天時(shí)最高。分別為52.1％，83.4％和96.7％。隨著菌絲體量增加抑菌率提高。說(shuō)明菌絲體可誘導(dǎo)微白黃鏈霉菌actin-1抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生。

表4不同菌絲體添加量無(wú)菌液抑菌率(％)

結(jié)論：以蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體為唯一碳源時(shí)，可誘導(dǎo)微白黃鏈霉菌actin-1同步合成幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶、多酚氧化酶以及蛋白酶等真菌細(xì)胞壁溶解酶；大大提高了微白黃鏈霉菌actin-1對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病的防治效果；微白黃鏈霉菌actin-1粗酶液對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲有溶解作用。以蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體為碳源時(shí)微白黃鏈霉菌actin-1能產(chǎn)生活性較強(qiáng)的抑菌物質(zhì)，抑菌率可達(dá)96.7％。

可知，在蘋果樹(shù)腐爛病病灶處施用微白黃鏈霉菌actin-1生防菌劑時(shí),當(dāng)蘋果樹(shù)腐爛病病原菌菌絲體與微白黃鏈霉菌actin-1接觸，微白黃鏈霉菌actin-1會(huì)以其為碳源生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)合成多種胞外細(xì)胞壁水解酶，通過(guò)協(xié)同酶溶作用是病原菌細(xì)胞崩解，同時(shí)產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病菌生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，兩種機(jī)制共同作用組織蘋果樹(shù)腐爛病病原菌的繁殖，提高微白黃鏈霉菌actin-1對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病的生防效果。

實(shí)施例11實(shí)驗(yàn)室內(nèi)蘋果樹(shù)離體枝條生防實(shí)驗(yàn)

(1)離體枝條實(shí)驗(yàn)方法：

微白黃鏈霉菌actin-1培養(yǎng)濾液的制備方法：

培養(yǎng)濾液制備：接種5％(v/v)微白黃鏈霉菌actin-1孢子懸液，制備方法同實(shí)施例2，于盛有50ml高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，30℃、180rpm搖床震蕩培養(yǎng)8天。發(fā)酵結(jié)束后，先將發(fā)酵液4000rpm離心后，上層發(fā)酵清液經(jīng)定性濾紙粗濾，再用裝有直徑為0.45μm濾膜的砂芯過(guò)濾器抽濾，最后再用裝有直徑為0.22μm濾膜的無(wú)菌細(xì)菌濾器過(guò)濾，即得到培養(yǎng)濾液，裝入滅菌三角瓶中于4℃冰箱保藏備用。

微白黃鏈霉菌actin-1菌餅和培養(yǎng)濾液對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病的防治效果-離體枝條實(shí)驗(yàn)；

采集試驗(yàn)田1-2年生富士蘋果枝條，剪取40cm長(zhǎng)、粗細(xì)一致的枝段，用75％乙醇進(jìn)行表面消毒，然后用滅菌水沖洗干凈，兩端用濕潤(rùn)的脫脂棉保濕。用直徑6mm的打孔器燒紅后打孔，每個(gè)枝條2個(gè)孔，作為接種點(diǎn)：

實(shí)驗(yàn)1(預(yù)防保護(hù)作用)：向上述接種點(diǎn)接種微白黃鏈霉菌actin-1菌餅，以接種空白培養(yǎng)基pda為陰性對(duì)照，兩天后去除菌餅并接種旺盛生長(zhǎng)的蘋果樹(shù)腐爛病菌菌餅，該處理設(shè)為處理1；向上述接種點(diǎn)涂抹培養(yǎng)濾液，以涂抹無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，涂抹0.5g/l的苯醚甲環(huán)唑溶液作為陽(yáng)性對(duì)照(向接種孔中先涂抹100μl，室溫晾干，再涂抹100μl，室溫晾干)，晾干后當(dāng)天接種旺盛生長(zhǎng)的蘋果樹(shù)腐爛病菌菌餅，該處理設(shè)為處理2；每個(gè)枝條2個(gè)接種點(diǎn)，每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理組6個(gè)接種點(diǎn)，上述接種點(diǎn)用保鮮膜保濕72h，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-14天，觀察蘋果樹(shù)腐爛病的發(fā)生情況，測(cè)量病斑大小，計(jì)算病斑面積和防治效果，見(jiàn)表4。

實(shí)驗(yàn)2(治理作用)：向上述接種點(diǎn)接種旺盛生長(zhǎng)的蘋果樹(shù)腐爛病菌菌餅，保鮮膜保濕2天后，去掉腐爛病菌菌餅，然后接種微白黃鏈霉菌actin-1菌餅，以接種空白培養(yǎng)基pda為陰性對(duì)照，該處理設(shè)為處理1；向上述接種點(diǎn)接種旺盛生長(zhǎng)的蘋果樹(shù)腐爛病菌菌餅，保鮮膜保濕2天后，去掉腐爛病菌菌餅，涂抹培養(yǎng)濾液，以涂抹無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，涂抹0.5g/l的苯醚甲環(huán)唑溶液作為陽(yáng)性對(duì)照(向接種孔中先涂抹100μl，室溫晾干，再涂抹100μl，室溫晾干)每個(gè)枝條2個(gè)接種點(diǎn)，每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理6個(gè)接種點(diǎn)，。上述接種點(diǎn)用保鮮膜保濕72h，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-14天，觀察蘋果樹(shù)腐爛病的發(fā)生情況，測(cè)量病斑大小，計(jì)算病斑面積和防治效果。見(jiàn)表5。

病斑面積＝1/4×π×長(zhǎng)徑×短徑

防治效果(％)＝[(對(duì)照病斑面積－菌餅面積)－(處理病斑面積－菌餅面積)]/(對(duì)照病斑面積－菌餅面積)×100

表4.微白黃鏈霉菌actin-1對(duì)離體枝條蘋果樹(shù)腐爛病的保護(hù)作用

注：同一列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示處理間差異達(dá)到5％顯著水平；

表5.微白黃鏈霉菌actin-1對(duì)離體枝條蘋果樹(shù)腐爛病的治療作用

注：同一列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示處理間差異達(dá)到5％顯著水平；

可以看出，預(yù)防保護(hù)作用菌餅和培養(yǎng)濾液防效差異不大，均可達(dá)95％以上，菌餅防效為95.50％，培養(yǎng)濾液為95.12％。治療效果二者相近，菌餅對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病離體枝條治療效果達(dá)86.05％，培養(yǎng)濾液治療效果達(dá)83.48％，與化學(xué)藥劑苯醚甲環(huán)唑效果相當(dāng)。

實(shí)施例12本發(fā)明生防菌劑對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病的防治作用-田間實(shí)驗(yàn)

田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)：共4個(gè)處理，取本發(fā)明實(shí)施例1制備的，按照生防菌劑:凈土(m/m)＝1:1、生防菌劑:凈土(m/m)＝1:5、生防菌劑:凈土(m/m)＝1:10復(fù)配，設(shè)為處理組；對(duì)照組僅僅為凈土。試驗(yàn)地點(diǎn)在陜西省寶雞市千陽(yáng)縣陜西楓丹百麗蘋果園進(jìn)行，試樹(shù)品種為5年生“富士”。

(1)通過(guò)田間實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證微白黃鏈霉菌對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病的保護(hù)和治療效果

預(yù)防保護(hù)作用：5年生，長(zhǎng)勢(shì)相近的富士蘋果樹(shù)，主枝上用6mm打孔器打孔造成新鮮傷口2cm²，將以上4種處理微白黃鏈霉菌actin-1生防菌劑用適量水和成泥狀，貼到傷口出處，菌泥的厚度為1.5cm左右，用保鮮膜包裹保濕，3天后，接種旺盛生長(zhǎng)的蘋果樹(shù)腐爛病菌餅，用保鮮膜包裹保濕，7天后，除去保鮮膜。每處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)6棵樹(shù)。4周后觀測(cè)腐爛病的發(fā)病情況，計(jì)算發(fā)病率、病斑面積和防治效果；結(jié)果如表6。

治療作用：5年生、長(zhǎng)勢(shì)相近的富士蘋果樹(shù)，主枝上用6mm打孔器打孔造成新鮮傷口2cm²，接種旺盛生長(zhǎng)的蘋果樹(shù)腐爛病菌餅，用保鮮膜包裹保濕，3天后，去除腐爛病病原菌菌餅，將以上4種處理的微白黃鏈霉菌actin-1生防菌劑用適量水和成泥狀，貼到傷口出處菌泥的厚度為1.5cm左右，用保鮮膜包裹保濕，7天后，除去保鮮膜。每處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)6棵樹(shù)。4周后觀測(cè)腐爛病的發(fā)病情況，計(jì)算發(fā)病率、病斑面積和治療效果；結(jié)果如表7。

發(fā)病率(％)＝病株樹(shù)/總株數(shù)

病斑面積＝1/4×π×長(zhǎng)徑×短徑

防治效果(％)＝[(對(duì)照病斑面積－菌餅面積)－(處理病斑面積－菌餅面積)]/(對(duì)照病斑面積－菌餅面積)×100

表6田間微白黃鏈霉菌對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病的保護(hù)作用

注：同一列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示處理間差異達(dá)到5％顯著水平；

表7田間微白黃鏈霉菌對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病的治療作用

注：同一列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示處理間差異達(dá)到5％顯著水平；

田間保護(hù)效果顯示，微白黃鏈霉菌actin-1生防菌劑與凈土以比例1：1和1:5混合作用時(shí)，只有一棵樹(shù)染病，預(yù)防效果顯著，當(dāng)比例為1:10時(shí)，病株樹(shù)增加1棵，效果也較好。治療效果顯示，微白黃鏈霉菌actin-1生防菌劑與凈土以比例1：1和1:5混合作用時(shí)，蘋果樹(shù)發(fā)病率為16.67％，防治效果分別達(dá)87.80％和87.60％，治療果顯著，當(dāng)比例為1:10時(shí)，防治效果略低，但是也達(dá)到95.23％，于對(duì)照相比，效果顯著；說(shuō)明微白黃鏈霉菌actin-1可有效抑制腐爛病菌的侵入和擴(kuò)展，對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病田間防治作用極為明顯。

需要說(shuō)明的是本發(fā)明實(shí)施例2-6所制備的生防菌劑同樣具有上述效果，各實(shí)施例之間效果差異性不大。

實(shí)施例13通過(guò)田間實(shí)驗(yàn)微白黃鏈霉菌對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病病斑的愈合效果

田間腐爛病樹(shù)病斑的刮除治療實(shí)驗(yàn)：將病斑部位及其周圍1cm健康部位用刮刀刮至韌皮部，然后將實(shí)施例1制備的生防菌劑與凈土1:1混合均勻，用水和成泥狀，貼到腐爛病疤處，菌泥的厚度為1.5cm，后裹上黑色塑料薄膜保濕，3棵/組，共9棵，同時(shí)以凈土和泥作為對(duì)照，3棵/組，共9棵，開(kāi)始每個(gè)月進(jìn)行一次調(diào)查，后期半年或一年進(jìn)行一次調(diào)查。記錄病斑復(fù)發(fā)情況并測(cè)量愈傷組織的寬度，計(jì)算防治效果，結(jié)果見(jiàn)表8。

防治效果(％)＝(對(duì)照復(fù)發(fā)率-處理復(fù)發(fā)率)/對(duì)照復(fù)發(fā)率×100

半年后觀察18塊病斑，對(duì)照組9塊全部復(fù)發(fā)，且病斑面積隨時(shí)間延長(zhǎng)增大，處理組沒(méi)有復(fù)發(fā)病斑，防效達(dá)100％。處理組平均傷組織寬6.36cm，兩年后愈傷組織寬10.23cm，四年后，愈傷組織17.3cm，且沒(méi)有復(fù)發(fā)，見(jiàn)圖3；說(shuō)明微白黃鏈霉菌actin-1生防菌劑對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病的治療效果有效且持久；

表8微白黃鏈霉菌對(duì)田間蘋果樹(shù)腐爛病病斑的愈傷效果

注：同一列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示處理間差異達(dá)到5％顯著水平；

需要說(shuō)明的是本發(fā)明實(shí)施例2-6所制備的生防菌劑同樣具有上述效果，各實(shí)施例之間效果差異性不大。

實(shí)施例14微白黃鏈霉菌actin-1定殖能力檢測(cè)

將實(shí)施例13處理組的9棵蘋果樹(shù)半年后愈傷組織邊緣皮剝?nèi)∠聛?lái)，帶回實(shí)驗(yàn)室保濕，分離培養(yǎng)，結(jié)果9株樹(shù)上均分離到streptomycesalbidoflavusactin-1，說(shuō)明該菌可以定殖于蘋果樹(shù)干，且定殖率很高，能長(zhǎng)期發(fā)揮防治作用。

具體操作如下：取回的蘋果樹(shù)腐爛病愈傷組織樹(shù)皮用自來(lái)水沖洗干凈，剪成0.25cm²小塊，置于75％酒精中浸泡30s，再用4％次氯酸鈉表面消毒3.5min后，放入滅菌水中沖洗4次，每次至少1min，用滅菌濾紙吸干多余水分后，每4個(gè)小塊用滅菌研磨器研磨，再用無(wú)菌水稀釋涂布于高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基中，每個(gè)組織3個(gè)重復(fù)，30℃培養(yǎng)3-10天。以最后一次沖洗的滅菌水涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，驗(yàn)證組織表面消毒情況。

結(jié)果：9棵蘋果樹(shù)均分離到鏈霉菌，將對(duì)分離得到的鏈霉菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子鑒定，并與streptomycesalbidoflavusactin-1進(jìn)行序列比對(duì)，最終得到的鏈霉菌與actin-1序列同源性均為100％，可知，分離得到的鏈霉菌是微白黃鏈霉菌actin-1。

可知，本發(fā)明所用微白黃鏈霉菌不僅實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)蘋果樹(shù)腐爛病防治效果較好，田間防治效果及愈傷效果均較為理想，可應(yīng)用于腐爛病多發(fā)的地區(qū)蘋果果園。

需要說(shuō)明的是本發(fā)明實(shí)施例2-6所制備的生防菌劑同樣具有上述效果，各實(shí)施例之間效果差異性不大。