一種三葉青組培培養(yǎng)基及其制備方法與流程

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本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體為一種三葉青組培培養(yǎng)基及其制備方法。

背景技術(shù)：

三葉青是葡萄科多年生蔓生藤本植物，整株均可入藥，地下塊根藥效更加。三葉青塊根粗壯，一般常見有紡錘形、橢圓形或卵圓形。葉互生，葉柄2-4cm，掌狀復葉。小葉片呈狹橢圓形至狹卵狀橢圓形，長約3-7cm，寬約1.5-3cm。中央小葉較兩側(cè)者略大，葉緣具刺狀疏齒，葉子兩面都無毛，或僅在下面中脈上被毛。由于三葉青的藥效價值，因此很值得進行三葉青的組織培養(yǎng)研究。而組培過程中三葉青成活率低是亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種三葉青組培培養(yǎng)基，該三葉青組培培養(yǎng)基可明顯提高三葉青塊根組織的成活率。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:

一種三葉青組培培養(yǎng)基的制作方法，其制備方法包括如下步驟：

(1)在容器內(nèi)加入純凈水，加熱至沸；

(2)將預設(shè)組分依次加入容器內(nèi)，并攪拌均勻，得到混合液；

(3)調(diào)節(jié)混合溶液的ph，并用錐形瓶分裝且封口后，放置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌，得到滅菌完成的混合液；

(4)將滅菌完成的混合液放入超凈臺冷卻，得到三葉青組培培養(yǎng)基。

作為優(yōu)選，上述步驟(3)中滅菌時間為45-60min。

作為優(yōu)選，上述三葉青組培培養(yǎng)基包括如下組分：硝酸銨0.8-1.2g、硝酸鉀0.4-0.6g、硫酸鐵0.2-0.3g、磷酸二氫鉀0.4-0.6g、氯化鈉0.8-1.2g、葡萄糖1.2-1.4g、光觸媒0.1-0.5g、氯化鈣0.2-0.3g、甘氨酸0.04-0.06g、生長素0.01-0.02g、細胞分裂素0.03-0.05g、激動素0.01-0.02g、玉米素0.01-0.02g、維生素0.04-0.08g、蔗糖1-3g以及植物生長調(diào)節(jié)劑0.04-0.09g。

上述培養(yǎng)基內(nèi)含有三葉青組織培養(yǎng)過程中需要的無機營養(yǎng)物：七水硫酸鎂、氯化鈣、硝酸銨、磷酸二氫鉀、氯化鈉；碳源：葡萄糖；有機附加物：甘氨酸和維生素；生長調(diào)節(jié)劑。上述五大類營養(yǎng)物質(zhì)是三葉青組織生長過程中不可或缺的；

同時，0.8-1.2g硝酸銨為三葉青組織生長提供了充足的氮源，可以有效促進植物細胞中蛋白質(zhì)、葉綠素以及核酸的生成；0.4-0.6g磷酸二氫鉀也為三葉青組織細胞中生物膜、核苷酸以及核酸的形成提供了充足的磷元素，并且磷酸二氫鉀所提供的鉀元素可以促進氮素代謝以及碳水化合物的轉(zhuǎn)移，從而加快了三葉青組織細胞的生長；0.2-0.3g氯化鈣為三葉青組織細胞壁的生長提供了充足的鈣元素；此外，該培養(yǎng)基還添加了七水硫酸鎂作為鎂源，加快葉綠素的形成；培養(yǎng)基內(nèi)添加的有機附加物和生長調(diào)節(jié)劑可以促進三葉青組織快速生長。

上述培養(yǎng)基內(nèi)還添加有光觸媒，即納米二氧化鈦0.2-0.3g及納米氧化鋅0.2-0.3g，光觸媒不僅不會抑制三葉青細胞的生長，而且可以有效殺死從高壓蒸汽滅菌鍋轉(zhuǎn)移至超凈臺過程中所感染的微生物，彌補了超凈臺中的紫外殺菌法無法殺死培養(yǎng)基內(nèi)部雜菌的缺陷。避免雜菌滋生干擾實驗人員觀察三葉青組織的生長或雜菌影響三葉青外植體的健康生長，從而使得三葉青外植體的成活率降低；并且，本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基內(nèi)還配設(shè)合適重量份數(shù)的植物生長調(diào)節(jié)劑，該植物生長調(diào)節(jié)劑可促進三葉青莖塊根誘導分化，從而使得該三葉青外植體成活率大大增加。

更加具體地，上述植物生長調(diào)節(jié)劑包括：生長素0.01-0.02g、細胞分裂素0.03-0.05g、激動素0.01-0.02g以及玉米素0.01-0.02g。

作為優(yōu)選，所述光觸媒為納米二氧化鈦、納米氧化鋅中的一種或兩種。

作為優(yōu)選，所述維生素包括維生素b1和維生素b2中的至少一種。

作為優(yōu)選，所述的培養(yǎng)基按重量計，包括：硝酸銨0.8-1.2g、硝酸鉀0.4-0.6g、硫酸鐵0.2-0.3g、磷酸二氫鉀0.4-0.6g、氯化鈉0.8-1.2g、葡萄糖1.2-1.4g、納米二氧化鈦0.2-0.3g、納米氧化鋅0.2-0.3g，氯化鈣0.2-0.3g、甘氨酸0.04-0.06g、生長素0.01-0.02g、細胞分裂素0.03-0.05g、激動素0.01-0.02g、玉米素0.01-0.02g、維生素b10.02-0.04g、維生素b20.02-0.04g、七水硫酸鎂0.2-0.4g、蔗糖1-3g以及純凈水80-100g。

上述三葉青組培培養(yǎng)基按重量比組成，具體包括：硝酸銨1.0g、硝酸鉀0.5g、硫酸鐵0.25g、磷酸二氫鉀0.5g、氯化鈉1.0g、葡萄糖1.3g、納米二氧化鈦0.25g、納米氧化鋅0.25g、氯化鈣0.25g、甘氨酸0.05g、生長素0.015g、細胞分裂素0.04g、激動素0.015g、玉米素0.015g、維生素b10.03g、維生素b20.03g、七水硫酸鎂0.3g、蔗糖2g以及純凈水90g。

上述培養(yǎng)基的制備方法具體包括如下步驟：

(1)在容器內(nèi)加入90ml純凈水，加熱至沸；

(2)取硝酸銨1.0g、硝酸鉀0.5g、硫酸鐵0.25g、磷酸二氫鉀0.5g、氯化鈉1.0g、葡萄糖1.3g、納米二氧化鈦0.25g、納米氧化鋅0.25g、氯化鈣0.25g、甘氨酸0.05g、生長素0.015g、細胞分裂素0.04g、激動素0.015g、玉米素0.015g、維生素b10.03g、維生素b20.03g以及蔗糖2g依次加入容器內(nèi)，并攪拌均勻，得到混合液；

(3)在混合溶液中加入0.3g七水硫酸鎂，并用錐形瓶分裝且封口后，放置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌50min，得到滅菌完成的混合液；

(4)將滅菌完成的混合液放入超凈臺冷卻。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

采用上述方法制備三葉青培養(yǎng)基可明顯減少三葉青外植體被雜菌污染的可能性，從而進一步提高了三葉青外植體的成活率，有利于三葉青的大面積種植推廣。

具體實施方式

下面采用具體實施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細說明。

實施例1