本發(fā)明屬于殺菌劑領(lǐng)域，具體涉及一種季銨鹽改性殼聚糖微球及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

中國(guó)的水資源短缺已經(jīng)敲響了警鐘，更重要的是水安全的現(xiàn)狀不容樂(lè)觀。近幾年來(lái)，飲用不合格水威脅人體健康的新聞層出不窮。這主要是由于人們以前飲用煮沸的涼開(kāi)水，現(xiàn)在飲用桶裝水。桶裝水從制作到售賣(mài)要經(jīng)過(guò)多道的工序和運(yùn)輸才能到達(dá)消費(fèi)者手中。此過(guò)程雖然會(huì)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格把關(guān)，但難免會(huì)在某些環(huán)節(jié)出現(xiàn)紕漏造成污染。桶裝水的污染大多是由細(xì)菌或其他微生物引起的中毒或感染。

目前，常見(jiàn)的滅菌劑包括氧化性滅菌劑、非氧化性滅菌劑、復(fù)合型滅菌劑、殼聚糖滅菌劑、固定化滅菌等等。其中氧化性滅菌劑具有滅菌力強(qiáng)、來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，是應(yīng)用最廣泛的滅菌劑。但是氧化性滅菌劑也有缺點(diǎn)：當(dāng)水中有機(jī)物含量較高時(shí)，氯氣滅菌將會(huì)產(chǎn)生氯代有機(jī)物質(zhì)，穩(wěn)定性欠佳，可致癌；運(yùn)輸貯藏成本高；處理工業(yè)水時(shí)，對(duì)菌垢作用能力差。非氧化性殺菌劑殺生作用持久性強(qiáng)、受水中環(huán)境ph值影響較小、對(duì)沉積物或黏泥有滲透、剝離作用。但費(fèi)用卻較高，并且容易引起污染，也會(huì)使水中的微生物產(chǎn)生抗藥性。在水處理過(guò)程中，氧化性滅菌劑分解后會(huì)產(chǎn)生毒副產(chǎn)物，而非氧化性滅菌劑會(huì)有殘留在水中無(wú)法降解，造成“二次污染”。復(fù)配型殺菌劑最主要的功能是使各組分復(fù)配比的協(xié)調(diào)作用達(dá)到最大。對(duì)于殼聚糖滅菌劑，分子量在8-10萬(wàn)的殼聚糖抗菌效果，防腐效果與山梨酸鉀、苯甲酸鈉相匹敵。但是該狀態(tài)的殺菌劑會(huì)殘留在水體中，不能被有效回收更不能循環(huán)使用，存在資源浪費(fèi)的問(wèn)題。

殼聚糖是以廣泛存在于自然界的甲殼素為基料，經(jīng)過(guò)化學(xué)反應(yīng)脫乙酰制得的高分子材料，化學(xué)名稱(chēng)為β-(1，4)-2-氨基-2-脫氧-d-葡萄糖。一般而言，脫乙酰度(degreeofdeacetylation)大于50％或能溶于稀酸的脫乙?；a(chǎn)物統(tǒng)稱(chēng)為殼聚糖。殼聚糖儲(chǔ)量豐富、成本低廉、可生物降解、不易造成污染，本身具有良好的生物相容性，且無(wú)毒副作用。殼聚糖的游離氨基在一定環(huán)境下，氮原子帶有1對(duì)孤對(duì)電子，使基團(tuán)氨基表現(xiàn)出弱堿性。游離氨基基團(tuán)能夠與1個(gè)氫離子結(jié)合，從而使殼聚糖變成帶有正電荷的線形的聚電解質(zhì)。吸附在負(fù)電荷表面，同時(shí)由于殼聚糖的弱堿性，其表面會(huì)帶有弱的正電荷。所以，殼聚糖是少數(shù)具有電荷性性質(zhì)的天然產(chǎn)物，從而殼聚糖成為研究的熱點(diǎn)。為了提高殼聚糖的抗菌能力，科研人員把研究重點(diǎn)放在對(duì)其結(jié)構(gòu)的改性上。

殼聚糖因具有許多優(yōu)良的特性，廣泛應(yīng)用化妝品、食品、化妝品、紡織、環(huán)保、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、電分析化學(xué)等領(lǐng)域。為了進(jìn)一步拓展殼聚糖的應(yīng)用范圍，使殼聚糖分子改性，另活潑的氨基和羥基基團(tuán)得以修飾，賦予殼聚糖更多的特殊功能是現(xiàn)在殼聚糖開(kāi)發(fā)應(yīng)用的熱點(diǎn)領(lǐng)域。

因此，開(kāi)發(fā)一種高效安全、使用方便、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，同時(shí)又能不破壞營(yíng)養(yǎng)成分，無(wú)殘留的殺菌劑成了提高水質(zhì)的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述技術(shù)和成本問(wèn)題，提供一種季銨鹽改性殼聚糖微球及其制備方法和應(yīng)用，以交聯(lián)殼聚糖為母體，與氯化膽堿為配體進(jìn)行合成反應(yīng)，能夠獲得具有較高功能基轉(zhuǎn)化率的季銨鹽改性殼聚糖微球，該改性對(duì)飲用水具有良好的殺菌效果。

為解決上述技術(shù)難題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種季銨鹽改性殼聚糖微球，具有如式(ⅰ)所示的結(jié)構(gòu)：

式中，n＝1,2,3…；

所述季銨鹽改性殼聚糖微球以殼聚糖為原料，經(jīng)交聯(lián)后用氯化膽堿改性得到，殼聚糖的脫乙酰度為80％～95％；粘度為50～800mpa·s。

季銨鹽改性殼聚糖微球易溶于水又有較強(qiáng)的抗菌活性。其配體中n⁺具有正電性，吸附帶有負(fù)電荷的細(xì)菌，是細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上的負(fù)電荷分布不均，干擾細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上的負(fù)電荷分布不均干擾細(xì)胞壁或者細(xì)胞膜的合成，最終使細(xì)菌溶解而死亡。

所述季銨鹽改性殼聚糖微球的制備方法，包括：以具有如(ⅱ)所示結(jié)構(gòu)的交聯(lián)殼聚糖微球?yàn)槟阁w，經(jīng)充分溶脹后，加入結(jié)構(gòu)如(ⅲ)所示的配體，調(diào)節(jié)體系ph，進(jìn)行改性反應(yīng)，反應(yīng)完成后經(jīng)洗滌、干燥得具有如式(ⅰ)所示結(jié)構(gòu)的季銨鹽改性殼聚糖微球；

式中，n＝1,2,3…；

優(yōu)選地，交聯(lián)殼聚糖微球置于溶劑中充分溶脹，所述溶劑為1,4-二氧六環(huán)、dmf、dmso、水和甲苯中的至少一種。

溶劑對(duì)配體的轉(zhuǎn)化率影響較大，主要原因有：(1)不同溶劑的極性不同，對(duì)母體溶脹性帶來(lái)的影響也不同；(2)配體在溶劑中的溶解度和分散度不同，造成功能基轉(zhuǎn)化率不同；(3)溶劑本身的物理性質(zhì)產(chǎn)生的影響，如沸點(diǎn)等限制了溶劑的使用。作為優(yōu)選，所述溶劑為1,4-二氧六環(huán)，在該溶劑中進(jìn)行溶脹和反應(yīng)，功能基轉(zhuǎn)化率最高。

優(yōu)選地，配體氯化膽堿的投加量為交聯(lián)殼聚糖微球質(zhì)量的2～6倍。交聯(lián)殼聚糖是大分子物質(zhì)，反應(yīng)物質(zhì)量比是影響微球功能基轉(zhuǎn)化率的重要因素之一，隨著配體投加比例的增加，功能基轉(zhuǎn)化率先增加，然后轉(zhuǎn)換率趨于平緩的趨勢(shì)，進(jìn)一步優(yōu)選，配體氯化膽堿的投加量為母體質(zhì)量的4～6倍，在該投加比例下，功能基轉(zhuǎn)化率最高。

優(yōu)選地，改性反應(yīng)中，調(diào)節(jié)體系ph至7.5～8.5。

優(yōu)選地，改性反應(yīng)中，反應(yīng)溫度為50～90℃，在該溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，功能基轉(zhuǎn)化率先增加后趨于平緩。進(jìn)一步優(yōu)選，反應(yīng)溫度為70～90℃，由于反應(yīng)溶劑對(duì)母體和配體溶解度產(chǎn)生影響，使得配體分子和母體活性位點(diǎn)之間的反應(yīng)在此溫度范圍內(nèi)很快達(dá)到飽和狀態(tài)。

優(yōu)選地，改性反應(yīng)中，反應(yīng)時(shí)間為6～10h。

所述洗滌包括依次用丙酮、無(wú)水乙醇和去離子水進(jìn)行反復(fù)洗滌。

所述交聯(lián)殼聚糖微球的制備包括：在殼聚糖中加入甲醛進(jìn)行預(yù)交聯(lián)反應(yīng)，預(yù)交聯(lián)反應(yīng)后加入交聯(lián)劑環(huán)氧氯丙烷進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)洗滌得具有如(iv)所示結(jié)構(gòu)的交聯(lián)殼聚糖微球中間體；交聯(lián)殼聚糖微球中間體經(jīng)活化后得交聯(lián)殼聚糖微球；

式中，n＝1,2,3…。

所述交聯(lián)殼聚糖微球的制備方法具體包括以下步驟：

(1)將殼聚糖溶解在乙酸溶液中，加入液體石蠟和乳化劑，分散均勻后加入甲醛，使甲醛與殼聚糖c2上的氨基進(jìn)行預(yù)交聯(lián)反應(yīng)，得混合液；

(2)調(diào)節(jié)步驟(1)的混合液至ph為9～10，加入環(huán)氧氯丙烷，通過(guò)反相懸浮交聯(lián)法得交聯(lián)殼聚糖微球中間體；

(3)將交聯(lián)殼聚糖微球中間體用鹽酸加熱至60～80℃處理6～10h，洗滌至中性，得交聯(lián)殼聚糖微球。

優(yōu)選地，殼聚糖的脫乙酰度為80％～95％；粘度為50～800mpa·s。

步驟(1)中，乙酸溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3～5％，每g殼聚糖中加入50～70ml乙酸溶液。

優(yōu)選地，步驟(1)中，每g殼聚糖中加入液體石蠟150～250ml。

優(yōu)選地，步驟(1)中，所述乳化劑為span80，每g殼聚糖中加入乳化劑0.1～0.3ml。

優(yōu)選地，步驟(1)中，每g殼聚糖中加入甲醛2～5ml。

優(yōu)選地，步驟(1)中，預(yù)交聯(lián)反應(yīng)的溫度為50～80℃，反應(yīng)時(shí)間為1～2h。

優(yōu)選地，步驟(2)中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4～6％的naoh水溶液調(diào)節(jié)混合液的ph。

優(yōu)選地，步驟(2)中，環(huán)氧氯丙烷的加入量以步驟(1)中殼聚糖的用量為基準(zhǔn)，每g殼聚糖中加入環(huán)氧氯丙烷3～7ml。

優(yōu)選地，步驟(2)中，反相懸浮交聯(lián)法的溫度為50～80℃，反應(yīng)時(shí)間為4～6h。

本發(fā)明還提供了一種上述季銨鹽改性殼聚糖微球作為滅菌劑在飲用水中的應(yīng)用。

本發(fā)明季銨鹽改性殼聚糖微球作為固定化滅菌劑，與可溶性殺菌劑相比，固定化滅菌劑因?yàn)榭臻g立體原因?qū)е屡c細(xì)菌細(xì)胞作用力減弱，進(jìn)而造成滅菌效果下降，本發(fā)明通過(guò)引入強(qiáng)殺菌能力的功能基團(tuán)，增強(qiáng)固體殺菌劑與細(xì)菌的作用效果。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1、本發(fā)明的原材料殼聚糖儲(chǔ)量豐富、成本低廉、可生物降解、不易造成污染，本身具有良好的生物相容性，且無(wú)毒副作用。并且殼聚糖是天然高分子材料，具有大量的氨基和羥基，c-2位上的氨基、c-3和c-6位上的羥基性質(zhì)活潑，易于發(fā)生各種化學(xué)反應(yīng)。

2、本發(fā)明制備的季銨鹽改性殼聚糖微球可作為新型改性殺菌劑，通過(guò)引入具有優(yōu)良的殺菌效果且?guī)д姾傻募句@鹽，來(lái)增強(qiáng)滅菌效果。

3、本發(fā)明提供的季銨鹽改性殼聚糖微球可回收，可重復(fù)使用，能夠提高資源的利用率，且原料價(jià)格便宜，能夠多次使用并且可以有效降低“二次污染”，符合我國(guó)倡導(dǎo)的資源節(jié)約、可持續(xù)發(fā)展觀念，有廣闊的應(yīng)用前景。

4、本發(fā)明在滅菌的同時(shí)負(fù)載一定量的銀離子或銅離子，既能保證降低水中銀、銅的含量又能提升滅菌微球的功能，用于回收環(huán)境中的銀、銅離子，更好的提高了滅菌微球的附加值。

附圖說(shuō)明

圖1為殼聚糖(ncts)、氯化膽堿(cc)、季銨鹽改性殼聚糖微球(ccc)的紅外光譜圖；

圖2為交聯(lián)殼聚糖微球(ncts)、氯化膽堿(cc)和季銨鹽改性殼聚糖微球(ccc)的熱重曲線；

圖3為季銨鹽改性殼聚糖微球(ccc)滅菌前后的掃描電鏡圖，其中，(a)為ccc滅菌前的掃描電鏡圖，3(b)為ccc滅菌后的掃描電鏡圖；

圖4為實(shí)施例1制備的季銨鹽改性殼聚糖微球?qū)g⁺、cu²⁺、大腸桿菌(e.coil)和金黃色葡萄球菌(s.aureus)的重復(fù)利用率。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明中，計(jì)算功能基轉(zhuǎn)化率(％)的方法如下：

通過(guò)百萬(wàn)分之一的天平準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000mg～2.000mg季銨鹽改性殼聚糖微球，用錫箔紙包裹后依次放入托盤(pán)中等待樣品分析。利用varioeliii型元素分析儀測(cè)定出季銨鹽改性殼聚糖微球中的n元素的含量，并通過(guò)以下公式計(jì)算季銨鹽改性殼聚糖微球中功能基轉(zhuǎn)化率(functionalgroupconversion，％)。

上式中，x為功能基轉(zhuǎn)化率，

f0為殼聚糖中氨基含量(mmol/g)，

n0為殼聚糖的含氮量(％)，

nc為季銨鹽改性殼聚糖微球的含氮量(％)，

ml為配體的摩爾質(zhì)量(g/mol)，

nn為配體分子中氮原子的數(shù)目。

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

實(shí)施例1

(1)將1.0g殼聚糖(cts)置于50ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的乙酸溶液中，攪拌至溶解，以250r/min轉(zhuǎn)動(dòng)速率攪拌15min，加入200ml的液體石蠟，再攪拌10min后升溫至50℃，滴加4滴乳化劑span80，乳化10min。

(2)在步驟(1)中加入2ml甲醛，50℃下反應(yīng)1.5h，之后升溫至70℃，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的naoh水溶液，調(diào)節(jié)溶液ph值至9。之后緩慢地滴加4ml環(huán)氧氯丙烷，反應(yīng)5h后，用蒸餾水洗滌，再依次用石油醚、無(wú)水乙醇洗滌，之后反復(fù)水洗至ph值達(dá)到中性。放于50℃的真空干燥器中干燥至恒重。

(3)將步驟(2)中已制得的交聯(lián)殼聚糖微球用30ml1mol/l的鹽酸水溶液加熱至60℃處理9h。隨后用堿洗，水洗至中性。將反應(yīng)后的產(chǎn)物置于50℃真空干燥，干燥至恒重，得交聯(lián)殼聚糖微球(ncts)。

(4)稱(chēng)取0.5g步驟(3)中制備的交聯(lián)殼聚糖微球(ncts)懸浮于裝有1,4-二氧六環(huán)的三頸瓶中使其充分溶脹，升高溫度至70℃，再加入2.0g氯化膽堿(cc)，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系為弱堿性，溫度為70℃反應(yīng)8h后，用丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水反復(fù)洗滌，將產(chǎn)物放于50℃的真空干燥箱干燥至恒重。即得所述季銨鹽改性殼聚糖微球(ccc)。

經(jīng)檢測(cè)，所得季銨鹽改性殼聚糖微球的功能基轉(zhuǎn)化率為44.2％。

所得季銨鹽改性殼聚糖微球的紅外譜圖如圖1所示，圖中，ncts為步驟(3)中制備得到的交聯(lián)殼聚糖微球，cc為配體氯化膽堿，ccc為季銨鹽改性殼聚糖微球。1485cm^-1是季銨鹽分子中-ch2的特征吸收峰，1080cm^-1是-ch2oh結(jié)構(gòu)中c-o的特征峰。而在季銨鹽改性殼聚糖微球的圖譜中，母體中原1595cm^-1處的氨基吸收峰消失了，但是出現(xiàn)了1465cm^-1處新的吸收峰，這是由于氯化膽堿分子的引入，使得交聯(lián)殼聚糖微球中出現(xiàn)了其特征峰。改性后的圖譜中沒(méi)有出現(xiàn)c-o的特征吸收峰，說(shuō)明羥基參與了反應(yīng)。同時(shí)，甲基和亞甲基峰明顯增強(qiáng)。以上分析充分證明氯化膽堿已成功合成到交聯(lián)殼聚糖微球。

所得季銨鹽改性殼聚糖微球的熱重曲線如圖2所示，從圖2可以看出，在0～250℃范圍內(nèi)，氯化膽堿cc的重量基本沒(méi)有變化。但當(dāng)溫度在250～350℃時(shí)，cc開(kāi)始急劇失重，重量損失非常明顯，失重率為77.2％。350℃后，cc徹底分解。季銨鹽改性殼聚糖微球的tga曲線與交聯(lián)殼聚糖曲線相比，失重曲線極其相似，平衡后失重率不再發(fā)生變化，剩余的灰分和殘?jiān)s為28％。但ccc的分解溫度偏高一些，這說(shuō)明cc的引入能使微球自身的熱穩(wěn)定性有所提升。

實(shí)驗(yàn)1：

殺菌實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)以革蘭氏陰性代表細(xì)菌大腸桿菌(e.coli)cicc21524和革蘭氏陽(yáng)性代表細(xì)菌金黃色葡萄球菌(s.aureus)cicc10384作為受試菌，這兩種菌種均由浙江工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

具體實(shí)驗(yàn)操作步驟及評(píng)價(jià)方法如下：

所用菌株均作為儲(chǔ)備培養(yǎng)物置于輔以15％(v/v)甘油的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，保持于-20℃儲(chǔ)存。然后將菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(以下簡(jiǎn)稱(chēng)lb培養(yǎng)基)內(nèi)，于37℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)12h；待菌種活化后用移液槍取出一定量菌液，在4000rpm下進(jìn)行離心洗滌。將所得菌斑用0.85％的生理鹽水通過(guò)十倍稀釋法稀釋成濃度約為10⁶cfu·ml^-1的菌懸液備用。

殺菌活性測(cè)試

在250ml的錐形瓶中制備適當(dāng)?shù)木鷳乙?，并將其分為?shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。在實(shí)驗(yàn)組的錐形瓶中，加入已充分溶脹的ncts微球及季銨鹽改性殼聚糖微球ccc。對(duì)照組不加滅菌微球，振蕩使其混合均勻。在微球與受試菌充分接觸一定時(shí)間后，按照gb/t4789.3-2010提供的方法，將上述各組上清液分別逐級(jí)地稀釋?zhuān)♂尩竭m宜濃度后，用移液槍吸取1ml上清液，置于瓊脂培養(yǎng)基上，并用玻璃涂布棒涂勻，倒置平板并于37℃下培養(yǎng)，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)。通過(guò)以下公式計(jì)算微球的殺菌率：

其中：b％表示殺菌率；m0為對(duì)照組活菌數(shù)；m1為實(shí)驗(yàn)組活菌數(shù)。

為提高殺菌率的準(zhǔn)確性，殺菌率由同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和樣品組取樣進(jìn)行平板計(jì)數(shù)后結(jié)果根據(jù)公式計(jì)算得到。

mic為最小抑菌濃度，是指抗菌藥物能抑制培養(yǎng)基中細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度；mbc為最小殺菌濃度，指抗菌藥物殺死99％以上的供試微生物所需要的最小濃度，即使活菌數(shù)量降低三個(gè)數(shù)量級(jí)。mic值與mbc值是殺菌劑抗菌活性的指標(biāo)，顯示了滅菌劑抑制殺死微生物的能力。

表1是交聯(lián)殼聚糖微球ncts和季銨鹽改性殼聚糖微球ccc對(duì)兩種受試菌株的mic值與mbc值測(cè)試結(jié)果。

表1殺菌微球ccc對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的mic及mbc

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，季銨鹽改性殼聚糖微球殺菌性能優(yōu)于改性前的交聯(lián)殼聚糖微球，且較少的滅菌劑量就能達(dá)到理想的殺菌效果。ccc的滅菌作用可能是與兩種受試菌表面的電負(fù)性有關(guān)，ccc帶有正電荷，可和菌體靜電吸附，破壞細(xì)胞膜，使細(xì)胞破裂死亡。

季銨鹽改性殼聚糖微球ccc滅菌前后的掃描電鏡圖如圖3所示，其中，圖3(a)為ccc滅菌前的掃描電鏡圖，圖3(b)為ccc滅菌后的掃描電鏡圖。由圖可知，ccc滅菌前表面光滑且較為平整，說(shuō)明功能基試劑的接入有助于改善微球的表面結(jié)構(gòu)；微球滅菌后表面同樣出現(xiàn)片狀物質(zhì)。這些片狀物應(yīng)為經(jīng)ccc作用，細(xì)菌活細(xì)胞破裂，內(nèi)容物流出后與細(xì)胞膜碎片共同覆于微球表面。更進(jìn)一步證明滅菌微球ccc的滅菌機(jī)理是基于破壞活細(xì)胞完整性以達(dá)到殺死細(xì)菌的目的。

實(shí)驗(yàn)2：

滅菌微球?qū)g⁺、cu²⁺的吸附測(cè)試

準(zhǔn)確稱(chēng)取15.0mg的季銨鹽改性殼聚糖微球于100ml的碘量瓶中，再加入25.0mlph為5的hac-naac緩沖液充分溶脹后，分別加入濃度為3.0mg·ml^-1的ag⁺、cu²⁺溶液5.0ml，常溫下恒溫振蕩，轉(zhuǎn)速為100rpm·min^-1，待吸附達(dá)到平衡后，分別得負(fù)載銀離子后的季銨鹽改性殼聚糖微球ccc-ag⁺和負(fù)載銅離子后的季銨鹽改性殼聚糖微球ccc-cu²⁺。

微球負(fù)載銀、銅離子后對(duì)其殺菌效果會(huì)產(chǎn)生一定的影響。銀、銅離子本身就具有殺菌效果，但負(fù)載離子后滅菌微球的活性功能基就會(huì)減少，這些變化都會(huì)對(duì)微球殺菌效果有影響，所以要進(jìn)行負(fù)載微球的殺菌效果測(cè)試。

將負(fù)載銀、銅離子后的季銨鹽改性殼聚糖微球作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，按照實(shí)驗(yàn)1中的測(cè)試方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察每種微球的mic值與mbc值的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2負(fù)載ag⁺和cu²⁺的ccc對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的mic、mbc值

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吸附銅離子后的微球殺菌作用于金黃色葡萄球菌時(shí)，mbc值和mic值成4倍關(guān)系。說(shuō)明作用于金黃色葡萄球菌滅菌微球數(shù)量的需求增加。這可能是因?yàn)槲诫x子后，對(duì)細(xì)菌起作用的活性位點(diǎn)減少了，故而降低了殺菌效果。但ccc-ag⁺的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的mbc值與ccc的mbc值相比，數(shù)值更小，進(jìn)一步說(shuō)明該發(fā)明既能保證降低水中銀的含量又能提升滅菌的效果。

實(shí)驗(yàn)3：

季銨鹽改性殼聚糖微球的再生

將2mol/lhcl和etoh以1：3的體積混合制備再生洗脫液，對(duì)季銨鹽改性殼聚糖微球進(jìn)行再生，使微球功能基恢復(fù)原來(lái)的活性。對(duì)重生后的微球進(jìn)行重復(fù)吸附和滅菌操作，測(cè)試微球的重復(fù)使用次數(shù)，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，ccc對(duì)ag⁺重復(fù)吸附5次，其吸附率分別是99.69％、98.24％、97.51％、96.13％和95.27％。而對(duì)cu²⁺的吸附率依次為99.75％、98.26％、97.59％、96.27％及95.34％。很顯然，5次的重復(fù)使用，離子吸附率都在95％以上。由此可認(rèn)為洗脫5次對(duì)微球的損傷不大。

實(shí)驗(yàn)4：

季銨鹽改性殼聚糖滅菌微球在自來(lái)水、桶裝水中的應(yīng)用

稱(chēng)取150mg季銨鹽改性殼聚糖滅菌微球裝入玻璃柱中，對(duì)其進(jìn)行高壓滅菌處理，然后將滅菌后的過(guò)濾柱放到超凈工作臺(tái)中備用。取自來(lái)水和放置7天后的桶裝水各50ml，并在超凈工作臺(tái)中將其分別以正常速度流經(jīng)滅菌柱，并快速取出1ml過(guò)濾后的水，進(jìn)行涂布平板檢測(cè)細(xì)菌。結(jié)果顯示沒(méi)有細(xì)菌出現(xiàn)，該結(jié)果證明滅菌微球具有良好的吸附殺菌能力。

實(shí)施例2

(1)將1.0g殼聚糖(cts)置于50ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的乙酸溶液中，攪拌至溶解，以250r/min轉(zhuǎn)動(dòng)速率攪拌15min，加入200ml的液體石蠟，再攪拌10min后升溫至50℃，滴加4滴乳化劑span80，乳化10min。

(2)在步驟(1)中加入2.0ml甲醛，50℃下反應(yīng)1.5h，之后升溫至60℃，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的naoh水溶液，調(diào)節(jié)溶液ph值至9。之后緩慢地滴加4ml環(huán)氧氯丙烷，反應(yīng)5h后，用蒸餾水洗滌，再依次用石油醚、無(wú)水乙醇洗滌，之后反復(fù)水洗至ph值達(dá)到中性。放于50℃的真空干燥器中干燥至恒重。

(3)將步驟(2)中已制得的交聯(lián)殼聚糖微球用40ml1mol/l的鹽酸水溶液加熱至70℃處理9h。隨后用堿洗，水洗至中性。將反應(yīng)后的產(chǎn)物置于50℃真空干燥，干燥至恒重。

(4)稱(chēng)取0.5g步驟(3)中制備的交聯(lián)殼聚糖微球(ncts)懸浮于裝有n，n-二甲基甲酰胺的三頸瓶中使其充分溶脹，升高溫度至60℃，再加入2.0g氯化膽堿(cc)，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系為弱堿性，溫度為60℃反應(yīng)8h后，用丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水反復(fù)洗滌，將產(chǎn)物放于50℃的真空干燥箱干燥至恒重。即得所述季銨鹽改性殼聚糖微球(ccc)。

經(jīng)檢測(cè)，所得季銨鹽改性殼聚糖微球的功能基轉(zhuǎn)化率為25.16％。

實(shí)施例3

(1)將1.0g殼聚糖(cts)置于50ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的乙酸溶液中，攪拌至溶解，以250r/min轉(zhuǎn)動(dòng)速率攪拌15min，加入150ml的液體石蠟，再攪拌10min后升溫至50℃，滴加4滴乳化劑span80，乳化10min。

(2)在步驟(1)中加入3.0ml甲醛，在60℃下反應(yīng)2h，之后升溫至70℃，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的naoh水溶液，調(diào)節(jié)溶液ph值至9。之后緩慢地滴加4ml環(huán)氧氯丙烷，反應(yīng)5h后，用蒸餾水洗滌，再依次用石油醚、無(wú)水乙醇洗滌，之后反復(fù)水洗至ph值達(dá)到中性。放于50℃的真空干燥器中干燥至恒重。

(3)將步驟(2)中已制得的交聯(lián)殼聚糖微球用40ml1mol/l的鹽酸水溶液加熱至70℃處理9h。隨后用堿洗，水洗至中性。將反應(yīng)后的產(chǎn)物置于50℃真空干燥，干燥至恒重。

(4)稱(chēng)取0.5g步驟(3)中制備的交聯(lián)殼聚糖微球(ncts)懸浮于裝有二甲亞砜的三頸瓶中使其充分溶脹，升高溫度至50℃，再加入2.0g氯化膽堿(cc)，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系為弱堿性，溫度為50℃反應(yīng)8h后，用丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水反復(fù)洗滌，將產(chǎn)物放于50℃的真空干燥箱干燥至恒重。即得所述季銨鹽改性殼聚糖微球(ccc)。

經(jīng)檢測(cè)，所得季銨鹽改性殼聚糖微球的功能基轉(zhuǎn)化率為15.66％。

實(shí)施例4

(1)將1.0g殼聚糖(cts)置于50ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的乙酸溶液中，攪拌至溶解，以250r/min轉(zhuǎn)動(dòng)速率攪拌15min，加入250ml的液體石蠟，再攪拌10min后升溫至50℃，滴加4滴乳化劑span80，乳化10min。

(2)在步驟(1)中加入4.0ml甲醛，在70℃下反應(yīng)1h，之后升溫至80℃，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的naoh水溶液，調(diào)節(jié)溶液ph值至10。之后緩慢地滴加4ml環(huán)氧氯丙烷，反應(yīng)4h后，用蒸餾水洗滌，再依次用石油醚、無(wú)水乙醇洗滌，之后反復(fù)水洗至ph值達(dá)到中性。放于50℃的真空干燥器中干燥至恒重。

(3)將步驟(2)中已制得的交聯(lián)殼聚糖微球用30ml1mol/l的鹽酸水溶液加熱至80℃處理6h。隨后用堿洗，水洗至中性。將反應(yīng)后的產(chǎn)物置于50℃真空干燥，干燥至恒重。

(4)稱(chēng)取0.5g步驟(3)中制備的交聯(lián)殼聚糖微球(ncts)懸浮于裝有水的三頸瓶中使其充分溶脹，升高溫度至60℃，再加2.0g氯化膽堿(cc)，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系為弱堿性，溫度為80℃反應(yīng)8h后，用丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水反復(fù)洗滌，將產(chǎn)物放于50℃的真空干燥箱干燥至恒重。即得所述季銨鹽改性殼聚糖微球(ccc)。

經(jīng)檢測(cè)，所得季銨鹽改性殼聚糖微球的功能基轉(zhuǎn)化率為28.2％。

實(shí)施例5

(1)將1.0g殼聚糖(cts)置于50ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的乙酸溶液中，攪拌至溶解，以250r/min轉(zhuǎn)動(dòng)速率攪拌15min，加入250ml的液體石蠟，再攪拌10min后升溫至50℃，滴加4滴乳化劑span80，乳化10min。

(2)在步驟(1)中加入5ml甲醛，在50℃下反應(yīng)2h，之后升溫至70℃，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的naoh水溶液，調(diào)節(jié)溶液ph值至10。之后緩慢地滴加4ml環(huán)氧氯丙烷，反應(yīng)5h后，用蒸餾水洗滌，再依次用石油醚、無(wú)水乙醇洗滌，之后反復(fù)水洗至ph值達(dá)到中性。放于50℃的真空干燥器中干燥至恒重。

(3)將步驟(2)中已制得的交聯(lián)殼聚糖微球用50ml1mol/l的鹽酸水溶液加熱至60℃處理10h。隨后用堿洗，水洗至中性。將反應(yīng)后的產(chǎn)物置于50℃真空干燥，干燥至恒重。

(4)稱(chēng)取0.5g步驟(3)中制備的交聯(lián)殼聚糖微球(ncts)懸浮于裝有甲苯的三頸瓶中使其充分溶脹，升高溫度至50℃，再加入2.0g氯化膽堿(cc)，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系為弱堿性，溫度為70℃反應(yīng)8h后，用丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水反復(fù)洗滌，將產(chǎn)物放于50℃的真空干燥箱干燥至恒重。即得所述季銨鹽改性殼聚糖微球(ccc)。

經(jīng)檢測(cè)，所得季銨鹽改性殼聚糖微球的功能基轉(zhuǎn)化率為11.33％。

實(shí)施例6

(1)將1.0g殼聚糖(cts)置于50ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的乙酸溶液中，攪拌至溶解，以250r/min轉(zhuǎn)動(dòng)速率攪拌15min，加入200ml的液體石蠟，再攪拌10min后升溫至50℃，滴加4滴乳化劑span80，乳化10min。

(2)在步驟(1)中加入2.0ml甲醛，在50℃下反應(yīng)1.5h，之后升溫至70℃，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的naoh水溶液，調(diào)節(jié)溶液ph值至9。之后緩慢地滴加4ml環(huán)氧氯丙烷，反應(yīng)5h后，用蒸餾水洗滌，再依次用石油醚、無(wú)水乙醇洗滌，之后反復(fù)水洗至ph值達(dá)到中性。放于50℃的真空干燥器中干燥至恒重。

(3)將步驟(2)中已制得的交聯(lián)殼聚糖微球用30ml1mol/l的鹽酸水溶液加熱至70℃處理9h。隨后用堿洗，水洗至中性。將反應(yīng)后的產(chǎn)物置于50℃真空干燥，干燥至恒重。

(4)稱(chēng)取0.5g步驟(3)中制備的交聯(lián)殼聚糖微球(ncts)懸浮于裝有1,4-二氧六環(huán)的三頸瓶中使其充分溶脹，升高溫度至70℃，再加入1.0g氯化膽堿(cc)，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系為弱堿性，溫度為70℃反應(yīng)8h后，用丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水反復(fù)洗滌，將產(chǎn)物放于50℃的真空干燥箱干燥至恒重。即得所述季銨鹽改性殼聚糖微球(ccc)。

經(jīng)檢測(cè)，所得季銨鹽改性殼聚糖微球的功能基轉(zhuǎn)化率為15.8％。

實(shí)施例7

(1)將1.0g殼聚糖(cts)置于50ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的乙酸溶液中，攪拌至溶解，以250r/min轉(zhuǎn)動(dòng)速率攪拌15min，加入200ml的液體石蠟，再攪拌10min后升溫至50℃，滴加3滴乳化劑span80，乳化10min。

(2)在步驟(1)中加入2.0ml甲醛，在50℃下反應(yīng)1.5h，之后升溫至70℃，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的naoh水溶液，調(diào)節(jié)溶液ph值至9。之后緩慢地滴加4ml環(huán)氧氯丙烷，反應(yīng)5h后，用蒸餾水洗滌，再依次用石油醚、無(wú)水乙醇洗滌，之后反復(fù)水洗至ph值達(dá)到中性。放于50℃的真空干燥器中干燥至恒重。

(3)將步驟(2)中已制得的交聯(lián)殼聚糖微球用30ml1mol/l的鹽酸水溶液加熱至70℃處理9h。隨后用堿洗，水洗至中性。將反應(yīng)后的產(chǎn)物置于50℃真空干燥，干燥至恒重。

(4)稱(chēng)取0.5g步驟(3)中制備的交聯(lián)殼聚糖微球(ncts)懸浮于裝有1,4-二氧六環(huán)的三頸瓶中使其充分溶脹，升高溫度至70℃，再加入3.0g氯化膽堿(cc)，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系為弱堿性，溫度為70℃反應(yīng)8h后，用丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水反復(fù)洗滌，將產(chǎn)物放于50℃的真空干燥箱干燥至恒重。即得所述季銨鹽改性殼聚糖微球(ccc)。

經(jīng)檢測(cè)，所得季銨鹽改性殼聚糖微球的功能基轉(zhuǎn)化率為44.8％。

實(shí)施例8

(1)將1.0g殼聚糖(cts)置于50ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的乙酸溶液中，攪拌至溶解，以250r/min轉(zhuǎn)動(dòng)速率攪拌15min，加入200ml的液體石蠟，再攪拌10min后升溫至50℃，滴加4滴乳化劑span80，乳化10min。

(2)在步驟(1)中加入4.0ml甲醛，在50℃下反應(yīng)2h，之后升溫至70℃，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的naoh水溶液，調(diào)節(jié)溶液ph值至9。之后緩慢地滴加7ml環(huán)氧氯丙烷。反應(yīng)6h后，用蒸餾水洗滌，再依次用石油醚、無(wú)水乙醇洗滌，之后反復(fù)水洗至ph值達(dá)到中性。放于50℃的真空干燥器中干燥至恒重。

(3)將步驟(2)中已制得的交聯(lián)殼聚糖微球用40ml1mol/l的鹽酸水溶液加熱至70℃處理7h。隨后用堿洗，水洗至中性。將反應(yīng)后的產(chǎn)物置于50℃真空干燥，干燥至恒重。

(4)稱(chēng)取0.5g步驟(3)中制備的交聯(lián)殼聚糖微球(ncts)懸浮于裝有1,4-二氧六環(huán)的三頸瓶中使其充分溶脹，升高溫度至5℃，再加入2.0g氯化膽堿(cc)，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系為弱堿性，溫度為50℃反應(yīng)8h后，用丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水反復(fù)洗滌，將產(chǎn)物放于50℃的真空干燥箱干燥至恒重。即得所述季銨鹽改性殼聚糖微球(ccc)。

經(jīng)檢測(cè)，所得季銨鹽改性殼聚糖微球的功能基轉(zhuǎn)化率為17.1％。

實(shí)施例9

(1)將1.0g殼聚糖(cts)置于70ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的乙酸溶液中，攪拌至溶解，以250r/min轉(zhuǎn)動(dòng)速率攪拌15min，加入250ml的液體石蠟，再攪拌10min后升溫至70℃，滴加5滴乳化劑span80，乳化10min。

(2)在步驟(1)中加入2.5ml甲醛，在70℃下反應(yīng)1.5h，之后升溫至70℃，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的naoh水溶液，調(diào)節(jié)溶液ph值至10。之后緩慢地滴加4ml環(huán)氧氯丙烷，反應(yīng)5h后，用蒸餾水洗滌，再依次用石油醚、無(wú)水乙醇洗滌，之后反復(fù)水洗至ph值達(dá)到中性。放于50℃的真空干燥器中干燥至恒重。

(3)將步驟(2)中已制得的交聯(lián)殼聚糖微球用30ml1mol/l的鹽酸水溶液加熱至80℃處理9h。隨后用堿洗，水洗至中性。將反應(yīng)后的產(chǎn)物置于50℃真空干燥，干燥至恒重。

(4)稱(chēng)取0.5g步驟(3)中制備的交聯(lián)殼聚糖微球(ncts)懸浮于裝有1,4-二氧六環(huán)的三頸瓶中使其充分溶脹，升高溫度至90℃，再加入3.0g氯化膽堿(cc)，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系為弱堿性，溫度為90℃反應(yīng)8h后，用丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水反復(fù)洗滌，將產(chǎn)物放于50℃的真空干燥箱干燥至恒重。即得所述季銨鹽改性殼聚糖微球(ccc)。

經(jīng)檢測(cè)，所得季銨鹽改性殼聚糖微球的功能基轉(zhuǎn)化率為45.1％。