本發(fā)明屬于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種能夠快速構(gòu)建長期穩(wěn)定的高尿酸血癥模型的方法，特別是一種以大鼠為試樣的高尿酸血癥模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：
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近年來，隨著人們生活水平的提高和飲食方式的改變，高尿酸血癥的發(fā)生率逐年升高；多項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，高尿酸血癥是心血管疾病、腎臟疾病和糖尿病等代謝綜合征的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，已經(jīng)成為全世界威脅人類生存質(zhì)量的健康問題。高尿酸血癥在臨床上通常作為痛風(fēng)的標(biāo)志，在高尿酸血癥的患病人群中，有5％～12％的人最終發(fā)展為痛風(fēng)；目前對于痛風(fēng)的治療，臨床常用藥有別嘌呤醇和苯溴馬隆等，但這些藥物均有一定的毒副作用，如導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷，對皮膚黏膜、造血系統(tǒng)、腎臟和肝臟等都有較大的損害；因此，治療痛風(fēng)新藥物的研究得到了很高的關(guān)注，而建立穩(wěn)定持續(xù)的高尿酸血癥模型是對高尿酸血癥與痛風(fēng)研究的重要前提。

目前，常用的高尿酸血癥模型構(gòu)建方法的機(jī)制一般涉及補(bǔ)充外源性尿酸、補(bǔ)充尿酸前體物質(zhì)、抑制尿酸酶活性以及抑制腎臟尿酸排泄等，如利用酵母以及腺嘌呤和次黃嘌呤等嘌呤類物質(zhì)，或直接給予外源性尿酸構(gòu)建模型；但由于大鼠、小鼠等常用作實(shí)驗(yàn)對象的哺乳動物體內(nèi)存在人類缺乏的尿酸酶，在中長期試驗(yàn)中，尿酸酶活性被激活，使血尿酸水平不能維持在較高的水平上；近年來，國內(nèi)外最常用的高尿酸血癥模型構(gòu)建藥物氧嗪酸鉀可競爭性地與尿酸酶結(jié)合，抑制尿酸酶的活性，使體內(nèi)血尿酸水平在短時(shí)間內(nèi)增高，并可維持較長時(shí)間；但由于其競爭性抑制的機(jī)制需長期給藥，可對實(shí)驗(yàn)動物腎臟造成較強(qiáng)炎癥反應(yīng)等不良效果；目前較常用的抑制尿酸排泄的藥物主要為抗結(jié)核藥物乙胺丁醇和煙酸，該模型構(gòu)建方法的缺點(diǎn)是乙胺丁醇和煙酸等物質(zhì)可造成肝功損害。

有流行病學(xué)調(diào)查顯示，果糖的攝入量正逐年增長，果糖消費(fèi)量的增長與人群血尿酸平均水平的升高存在一定的關(guān)聯(lián)性，另外，高果糖飲食與高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化、腹型肥胖等代謝性疾病的發(fā)生均存在一定關(guān)系；有研究表明10％果糖水可使大鼠血尿酸水平升高，但是形成的高尿酸水平極不穩(wěn)定，因此，很難作為理想的高尿酸血癥動物模型被廣泛應(yīng)用；而且采用單一藥物構(gòu)建模型的方法因其作用機(jī)制單一，往往不能取得很好的效果，故目前大多數(shù)研究采用聯(lián)合構(gòu)建模型的方式，聯(lián)合構(gòu)建模型不僅能使高尿酸血癥模型維持時(shí)間更長，血尿酸升高更明顯，而且也更接近人類高尿酸血癥的發(fā)生機(jī)制和實(shí)際情況；故采用含嘌呤較高的酵母聯(lián)合高果糖飲食的方法誘導(dǎo)高尿酸血癥，形成穩(wěn)定的動物模型，為開展尿酸代謝、干預(yù)效果及其機(jī)制研究能夠提供良好的技術(shù)支持，也是當(dāng)前學(xué)術(shù)界探討的主題任務(wù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)，尋求設(shè)計(jì)一種以動物為試樣的利用酵母聯(lián)合果糖飲食誘導(dǎo)高尿酸血癥，再建立穩(wěn)定的高尿酸血癥模型的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述的高尿酸血癥模型的構(gòu)建方法，其工藝過程包括以下步驟：

(1)試樣選取：選取體重為180～220g，年齡為6～8周齡雄性清潔級Wistar大鼠，飼養(yǎng)于無特定病原體級(Specific Pathogen Free,SPF)的動物飼養(yǎng)室；

(2)適應(yīng)性喂養(yǎng)：將步驟(1)中選取的Wistar大鼠于SPF級動物飼養(yǎng)室中進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)3～7天，適應(yīng)性喂養(yǎng)期間觀察大鼠的體表特征和行為活動，將體表特征或行為活動異常的大鼠挑選出并隔離，保留合格試樣大鼠；適應(yīng)性喂養(yǎng)的環(huán)境為：溫度為20～24攝氏度，相對濕度為50％～70％，光照節(jié)律為12D：12L，工作照度為150～300lx，氣流或風(fēng)速0.1～0.2m/s，噪聲≤60dB；所述適應(yīng)性喂養(yǎng)的飼料中粗蛋白重量百分比含量為20.50％，粗脂肪含量為4.62％，粗纖維含量為4.35％，粗灰分含量為6.2％，鈣含量為1.23％，磷含量為0.91％，能量為345kcal/kg；

(3)模型構(gòu)建：對步驟(2)中經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)后體表特征和行為活動均無異常的合格試樣大鼠，于SPF級動物飼養(yǎng)室中喂養(yǎng)質(zhì)量百分比為20％的酵母飼料和質(zhì)量百分比為10％的果糖水溶液或?qū)?yīng)比例的鮮水果汁，合格試樣大鼠進(jìn)食與飲水自由進(jìn)行5～10天后，得到試樣大鼠高尿酸血癥模型；質(zhì)量百分比為20％的酵母飼料制作方法是：先將步驟(2)中所述對大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)的普通大鼠顆粒飼料粉碎成粒徑為0.1～1mm的粉末，然后在其中均勻加入重量百分比為20％的酵母膏，再將飼料重新制作成直徑為2～6mm的顆粒；

(4)模型應(yīng)用：對步驟(3)中構(gòu)建的大鼠高尿酸血癥模型進(jìn)行隔周斷尾取血，經(jīng)3000r/min離心5min，取300μl血清，用全自動生化分析儀測定血清尿酸(SUA)、血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)；處死大鼠后，摘取各組大鼠右側(cè)腎臟，4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后制成3μl厚切片，HE染色，光鏡(×400)下觀察腎臟組織學(xué)變化，利用酵母聯(lián)合果糖誘導(dǎo)大鼠高尿酸血癥，得到的模型具有典型的疾病表征，血清尿酸指標(biāo)長期維持較高水平，不造成腎臟嚴(yán)重器質(zhì)性損傷，符合高尿酸血癥大鼠腎臟病理損傷機(jī)制，為高尿酸血癥的研究提供穩(wěn)定模型。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，采用飼料與飲水結(jié)合的方法造模，其操作簡單，易于掌握，避免長期灌胃或注射造成動物損傷，方法安全可靠，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中空白對照組C、酵母對照組Y、酵母氧嗪酸鉀組YO和酵母果糖組YF的血清中XOD活性和ADA活性以及10％肝勻漿中XOD活性和ADA活性。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中空白對照組a、酵母對照組b、酵母氧嗪酸鉀組c和酵母果糖組d光鏡下腎臟結(jié)構(gòu)。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例4中空白對照組C、酵母對照組Y、酵母氧嗪酸鉀組YO和酵母果糖組YF的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法，如無說明，均為常規(guī)方法；實(shí)施例中所使用的材料試劑，如無說明，均為商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1：本實(shí)施例的具體構(gòu)建高尿酸血癥模型的具體步驟為

(1)動物試樣選取與模型構(gòu)建：選取8周齡雄性清潔級Wistar大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，飼于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院SPF級動物飼養(yǎng)室，實(shí)驗(yàn)開始前用普通大鼠顆粒飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠體表特征，行為活動是否有異常變化，對異常大鼠進(jìn)行隔離，最終選出經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)后體表特征和行為活動均無異常的Wistar大鼠40只；適應(yīng)性喂養(yǎng)的環(huán)境為：溫度：20～24℃，相對濕度：50％～70％，光照節(jié)律：12D：12L，工作照度：150～300lx，氣流、風(fēng)速0.1～0.2m/s，噪聲≤60dB；所述適應(yīng)性喂養(yǎng)的飼料為普通大鼠顆粒飼料，其配方中粗蛋白含量為20.50％，粗脂肪含量為4.62％，粗纖維含量為4.35％，粗灰分含量為6.2％，鈣含量為1.23％，磷含量為0.91％，能量為345kcal/kg；

(2)材料與設(shè)備：

氧嗪酸鉀(CAS：2207-75-2)購于上海麥克林生化科技有限公司；酵母膏的嘌呤含量為1.2％，貨號：01-014，購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；D-果糖(CAS：57-48-7)，購于北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；尿酸、肌酐、尿素氮測定試劑盒，購于中生北控生物科技有限公司；黃嘌呤氧化酶、腺苷脫氨酶測定試劑盒，購于南京建成試劑公司；一抗(兔抗)：RST、GLUT9、OATl、GAPDH、二抗抗體(羊抗兔)，購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；CX4全自動生化分析儀購于貝克曼庫爾特公司；這些大鼠試樣和材料設(shè)備為模型建立所需。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只雄性Wistar大鼠按體質(zhì)量分組，分別是空白對照、酵母對照、酵母氧嗪酸鉀和酵母果糖4組，每組10只，空白對照組給予普通大鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，其他三組給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2的酵母飼料喂養(yǎng)；酵母果糖組大鼠給予質(zhì)量濃度10％果糖飲水，其他三組給予自來水飲水；高酵母氧嗪酸鉀組予以0.5g/(kg·d)氧嗪酸鉀灌胃，其他三組予以蒸餾水灌胃，灌胃體積均為10ml/(kg·d)；所有大鼠均自由飲水和進(jìn)食；在喂養(yǎng)分別滿2、4、6和8W的早晨8點(diǎn)，大鼠禁食12h后剪尾取血1.0～1.5ml，室溫靜置凝血，3000r/min離心5min，取300μl血清，用全自動生化分析儀測定血清尿酸(SUA)、血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)；結(jié)果如表1顯示，在實(shí)驗(yàn)2w后，酵母對照組、酵母氧嗪酸鉀組和酵母果糖組血SUA水平分別達(dá)到262.66、267.44和345.91μmol/L；與空白對照組相比均顯著性上升(P<0.05)，分別升高26.49％、28.79％和66.58％；而且酵母果糖組SUA水平比酵母對照組和酵母氧嗪酸鉀組大鼠血尿酸水平分別增加83.25和78.47μmol/L(P值均<0.05)；在實(shí)驗(yàn)4w后，酵母對照組、酵母氧嗪酸鉀組和酵母果糖組與空白對照組相比SUA水平顯著升高(p<0.05)，分別升高88.38、164.02和101.88μmol/L；在實(shí)驗(yàn)6w后，酵母對照組、酵母氧嗪酸鉀組和酵母果糖組，與空白對照組相比，SUA水平顯著升高(P<0.05)；酵母對照組、酵母氧嗪酸鉀組和酵母果糖組三組之間SUA水平無顯著差異；在實(shí)驗(yàn)8w后，酵母對照組SUA水平下降至322.21μmol/L，與空白對照組(265.77μmol/L)相比已無顯著性差異(P>0.05)，酵母氧嗪酸鉀組(465.25μmol/L)和酵母果糖組(451.41μmol/L)與空白對照組相比，SUA水平仍然顯著升高(P<0.05)。

表2結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)分別滿2、4、6和8W時(shí)，酵母果糖組BUN水平降至6.01、4.62、4.71、3.65mmol/L，與空白對照組相比BUN水平均顯著降低(p<0.05)，分別下降27.32％、37.48％、35.12％、50.14％，因此在實(shí)驗(yàn)第2w末到第8w末，酵母果糖組的BUN表現(xiàn)為下降趨勢，大鼠體內(nèi)BUN濃度逐漸降低；在實(shí)驗(yàn)第4w末，酵母氧嗪酸鉀組BUN水平與酵母對照組相比顯著降低(p<0.05)；表3結(jié)果顯示所示，除第6w末酵母對照組與空白對照組相比，SCr水平顯著降低(p<0.05)，其他各時(shí)間段各組SCr水平無顯著差異；BUN是機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，BUN水平的高低可反映腎臟功能，當(dāng)BUN水平升高時(shí)可提示腎功能損壞、腎小球?yàn)V過率較低，但腎臟具有較強(qiáng)代償能力，當(dāng)腎臟損傷較輕時(shí)，BUN水平可不表現(xiàn)為升高；當(dāng)腎小球?yàn)V過率下降至50％以下時(shí)，BUN水平才能升高，同時(shí)可伴隨SCr水平升高，本實(shí)施例中各組大鼠均未出現(xiàn)BUN與SCr水平升高現(xiàn)象，說明并未出現(xiàn)腎臟功能的嚴(yán)重?fù)p害；

綜合結(jié)論：酵母聯(lián)合果糖干預(yù)能使大鼠SUA水平長期穩(wěn)定維持在一個(gè)較高的水平上，在第2、4、6、8周末分別達(dá)到345.91、403.71、447.21、451.41μmol/L，與空白對照組相比分別升高了66.5％、33.8％、37.5％和69.8％。

表1：各組大鼠血清尿酸水平(x±S,μmol/L)

注：a:與空白對照組相比，p<0.05,b:與酵母對照組相比，p<0.05,c:與酵母氧嗪酸鉀組相比，p<0.05；

表2：各組大鼠血清尿素氮水平(x±S,mmol/L)

注：a:與空白對照組相比，p<0.05,b:與酵母對照組相比，p<0.05,c:與酵母氧嗪酸鉀組相比，p<0.05；

表3：各組大鼠血清肌酐水平(x±S,mmol/L)

注：a:與空白對照組相比，p<0.05。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例采用實(shí)施例1的動物干預(yù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：在動物實(shí)驗(yàn)第8w末，大鼠禁食12h后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，室溫靜置凝血，3000r/min離心10min，取100μl血清測定黃嘌呤氧化酶(XOD)活性，取50μL血清，測定腺苷脫氨酶(ADA)活性；然后摘取各組大鼠肝臟，取1g肝臟組織與9ml生理鹽水用組織搗碎機(jī)10000～15000r/min上下研磨制成10％肝勻漿，取100μl10％肝勻漿測定XOD活性，取50μl 10％肝均漿測定ADA活性；結(jié)果如附圖1所示，酵母果糖組與空白對照組相比，血清中XOD活性和ADA活性(圖1(a))均顯著上升(P<0.05)，達(dá)到了46.30和26.83U/L，分別升高21.33％和37.30％；10％肝勻漿中XOD活性和ADA活性(圖1(b))均顯著上升(P<0.05)，達(dá)到了10.44和15.31U/L，分別升高36.11％和38.05％；酵母氧嗪酸鉀組與空白對照組相比，血清中XOD活性升高21.75％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；10％肝勻漿中ADA活性和XOD活性均顯著升高(P<0.05)；綜合結(jié)論：酵母聯(lián)合果糖干預(yù)能使大鼠SUA水平升高，其機(jī)制可能與大鼠體內(nèi)XOD與ADA被激活有關(guān)。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例采用實(shí)施例1的動物干預(yù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：在動物實(shí)驗(yàn)第8w末，大鼠禁食12h后，處死大鼠，摘取各組大鼠右側(cè)腎臟，4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后制成3μl厚切片，HE染色，光鏡(×400)下觀察；結(jié)果如附圖2所示，空白對照組與酵母對照組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)正常，腎皮質(zhì)中腎小球分布均勻，大小正常，腎小管無腫脹變性；酵母氧嗪酸鉀組大鼠腎臟偶見間質(zhì)片灶狀單核淋巴細(xì)胞浸潤，無明顯纖維化；酵母果糖組大鼠腎小管管腔間質(zhì)偶見結(jié)晶物沉積，無明顯纖維化；綜合結(jié)論：酵母果糖組大鼠腎小管偶見結(jié)晶物沉積，病理損傷較輕，符合高尿酸血癥大鼠腎臟病理損傷機(jī)制。

實(shí)施例4：

本實(shí)施例采用實(shí)施例1的動物干預(yù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)第54日時(shí)，用代謝籠法收集各組大鼠24h尿液，并測量尿液體積，于離心機(jī)中3000r/min離心10min，取上清液測定尿液尿酸(UUA)、尿液肌酐(UCr)，計(jì)算尿酸清除率(CUA)和肌酐清除率(CCR)，CUA計(jì)算公式為：UUA/SUA×每分鐘尿量(ml/min)，CCR計(jì)算公式為：UCr/SCr×每分鐘尿量(ml/min)；在動物實(shí)驗(yàn)第8w末，大鼠禁食12h后，處死大鼠，摘取各組大鼠左側(cè)腎臟，提取大鼠腎組織中腎臟皮質(zhì)刷狀緣膜(BBMV)蛋白及腎臟皮層蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法測定BBMV和腎皮質(zhì)上清中的蛋白含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品；將蛋白統(tǒng)一稀釋后，沸水浴煮5min，經(jīng)10％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙稀(PVDF)膜，配置5％脫脂奶于室溫封閉1h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1～2h，化學(xué)發(fā)光劑X光片上曝光，底片經(jīng)掃描儀透掃后轉(zhuǎn)化為圖片，用Quantity one軟件定量分析，確定雜交條帶的相對吸光度值；結(jié)果顯示(表4)，酵母果糖組大鼠24h尿量與空白對照組相比明顯升高(P<0.05)，酵母果糖組與酵母氧嗪酸鉀組大鼠CUA與空白對照組相比明顯降低(P均<0.05)，各組大鼠CCR值無顯著性變化；Western Blotting的結(jié)果表明(圖3):與空白對照組相比,酵母果糖組與酵母氧嗪酸鉀組大鼠腎臟皮質(zhì)有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)子1(OAT1)蛋白表達(dá)顯著降低(P均<0.05)；酵母果糖組大鼠腎臟BBMV中腎臟尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(RST)蛋白表達(dá)與空白對照組相比顯著升高(P<0.05)，同時(shí)，酵母氧嗪酸鉀組大鼠腎臟RST蛋白表達(dá)與空白對照組相比有升高趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與空白對照組相比，酵母果糖組與酵母氧嗪酸鉀組大鼠腎臟BBWV中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9(GLUT9)蛋白有升高趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；綜合結(jié)論：本實(shí)施例中酵母果糖組大鼠尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)紊亂，這是酵母果糖組大鼠血尿酸升高的重要原因；

表4：各組大鼠尿酸清除率與肌酐清除率情況(x±S)

注：a:與空白對照組相比，p<0.05,b:與酵母對照組相比，p<0.05。