本發(fā)明使用水楊酸(Salicylic acid,SA)和苯并噻二唑(Benzothiadiazole,BTH)預處理感水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)植株日本晴(Nipponbare),隨后用黑條矮縮病毒侵染日本晴秧苗,鑒定出SA及BTH的處理可以提高水稻對RBSDV的抗性,可應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中降低因黑條矮縮病對水稻造成的危害,屬于農(nóng)業(yè)科學技術領域。
背景技術:
:
RBSDV屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬(Fijivirus)第二組成員,以灰飛虱(Small brown planthopper,SBPH)為主要傳毒媒介進行持久性傳播,介體灰飛虱一旦染毒,終身帶毒,并能連續(xù)傳毒,但不經(jīng)卵傳毒。自然條件下,主要寄主有水稻、玉米、大麥、小麥、高粱、粟、看麥娘、稗草及狗尾巴草等禾本科植物。在我國,RBSDV侵染小麥引起小麥綠矮病,侵染玉米引起玉米粗縮病,侵染水稻引起水稻黑條矮縮病。水稻黑條矮縮病植株的典型癥狀為植株矮縮、葉片短小僵直,顏色濃綠,心葉扭曲褶皺,發(fā)病初期葉背面的葉脈和莖稈上出現(xiàn)蠟淚狀白色突起,后期突起變成黑褐色,后期不抽穗或穗小,造成嚴重減產(chǎn)。21世紀以來,水稻黑條矮縮病在我國各水稻產(chǎn)區(qū)尤其是江浙一帶越來越嚴重,對我國水稻生產(chǎn)構成嚴重威脅。
SA,分子式為C7H6O3,無色透明晶體,是植物一種重要的酚類激素,廣泛作用于植物的生理過程:如生長發(fā)育、光合作用、蒸騰作用、礦物質的吸收轉運等。最主要的,SA還是一種極其重要的信號分子參與植物免疫反應,因為它可以誘導產(chǎn)生一些抗病原物病程相關非表達子NPR1等,進入細胞核與受體因子TGA組成復合物,進一步誘導SA途徑相關抗病基因的表達,提高植物抗病能力。
BTH,分子式為C6H4N2S,針狀結晶,SA類似物,是一種典型的植物抗病誘導劑,普通條件下無殺菌作用,但能夠誘導植物的免疫活性,對于植物抗病及防病起著很大的作用。在植物病蟲害防治過程中,BTH作為一種抗病誘導劑,比其他化學物質更加的環(huán)保高效。
技術實現(xiàn)要素:
:
本發(fā)明針對上述研究背景,以RBSDV感病水稻品種日本晴(Nipponbare)為研究對象,對水、SA和BTH處理后的發(fā)病情況進行統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)SA和BTH處理后日本晴的發(fā)病率明顯低于對照組。本發(fā)明提供了利用SA及BTH降低水稻黑條矮縮病發(fā)病率的方法,利用該方法可以調高水稻對RBSDV的抗性,可應用農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、科研、環(huán)保等眾多領域,更加經(jīng)濟環(huán)保地降低病害造成的糧食損失。
附圖說明:
圖1健康水稻與水稻黑條矮縮病植株對比
圖2飼毒所用病株RT-PCR檢測結果
圖3水稻黑條矮縮病株飼喂灰飛虱
圖4度過循回期的灰飛虱Dot-ELISA帶毒率檢測結果
圖5SA和BTH處理后與對照組的差異,ND(No detected)指未被檢測到,不同字母表示在P<0.05水平上存在組間差異。
具體實施方式:
下面實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實施例1,利用水楊酸藥劑預處理水稻調查其病情的方法
1、攜帶RBSDV水稻病株的獲得
2016年4月于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院采集植株矮縮、葉色濃綠,分蘗略有增多,心葉有缺刻等表現(xiàn)出水稻黑條矮縮病典型癥狀的新鮮水稻植株(圖1)。參照Trizol(Reagent)說明書提取水稻葉片的總RNA。并用NanoDrop 2000分光光度計檢測濃度和質量。只有260/280的比值在1.9和2.1之間且260/230的比值大于2.0的RNA可以用作后續(xù)的實驗。采用已發(fā)表引物RB1-S9-F:5′-GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3′(R:A/G;Y:T/C;M:A/C)和RB-S9-R:5′-GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3′(H:T/G;M:G/A/T)(引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)進行RT-PCR檢測,確定水稻疑似病株是否攜帶RBSDV。以提取的2μL水稻葉片總RNA為模板、RB-S9-R為引物,參照M-MuLV反轉錄酶(Fermentas)說明書進行反轉錄,合成cDNA。以合成的2μL cDNA為模板、RB1-S9-F/RB-S9-R為引物進行PCR反應,使用常規(guī)PCR反應體系,最終體系由ddH2O補足20μL。PCR反應程序為94℃預變性5min;94℃變性45s,56℃退火45s,72℃延伸90s,35個循環(huán);72℃延伸10min。反應結束后取2μL PCR擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增的目的條帶(1200bp)(圖2)。挑選出3株較好水稻病株以備飼毒。
2、植物材料、病毒分析以及侵染方法
水稻種子(Nipponbare)首先用0.1%HgCl2消毒1h;然后用去離子水沖洗干凈,25℃浸種2d,催芽1d;催芽后的種子點播于1L燒杯中培養(yǎng),每杯40粒,每隔兩天澆灌適量的Hoagland營養(yǎng)液,光照14h,黑暗10h,溫度28±1℃。
本室常年飼養(yǎng)無毒灰飛虱群體,為避免傳毒介體污染,每次使用無毒灰飛虱若蟲前取100頭Dot-ELISA法檢測其是否攜帶RBSDV,確定其為無毒蟲。將篩選備用的新鮮水稻病株種于5L燒杯中,土面覆蓋濾紙,將適量1-2齡無毒灰飛虱若蟲移入其中,并用紗布封口(圖3),飼喂48h后將其移入預先育有武育粳3號健康秧苗的1L燒杯中度循回期(10-12d),循回期過后取100頭灰飛虱用Dot-ELISA法檢測其RBSDV帶毒率(圖4)。
3、不同處理下的發(fā)病情況
14d左右的水稻秧苗,在其土壤較干燥的情況下,分別施加dH2O、500μM SA各30mL(SA購于臺灣生工生物科技有限公司)。黑暗下過夜處理12h,平均每株秧苗以10頭的量接入灰飛虱,侵染3d。隨后將蟲小心掃出,室內(nèi)緩養(yǎng)1d,再將秧苗移栽至大田,正常管理。1個月左右查看發(fā)病情況,統(tǒng)計發(fā)病率。重復三次。
如表中所示,相比于對照組,SA處理后日本晴的發(fā)病率降低了約45%左右,效果顯著,可以得到結論,外源添加水楊酸可以在很大程度上降低水稻黑條矮縮病的發(fā)病率。進一步數(shù)據(jù)分析如圖5。
實施例2,利用苯并噻二唑藥劑預處理水稻調查其病情的方法
1、攜帶RBSDV水稻病株的獲得
同實施例1。
2、植物材料、病毒分析以及侵染方法
同實施例2。
3、不同處理下的發(fā)病情況
14d左右的水稻秧苗,在其土壤較干燥的情況下,分別施加dH2O、500μM BTH各30mL(BTH購于臺灣生工生物科技有限公司)。黑暗下過夜處理12h,平均每株秧苗以10頭的量接入灰飛虱,侵染3d。隨后將蟲小心掃出,室內(nèi)緩養(yǎng)1d,再將秧苗移栽至大田,正常管理。1個月左右查看發(fā)病情況,統(tǒng)計發(fā)病率。重復三次。
如表中所示,相比于對照組,BTH處理后日本晴的發(fā)病率降低了約50%左右,效果顯著,可以得到結論,外源添加BTH可以在很大程度上降低水稻黑條矮縮病的發(fā)病率。進一步數(shù)據(jù)分析如圖5。
上述實施不以任何形式限定本發(fā)明。