本發(fā)明涉及一種農(nóng)林領(lǐng)域的植物組織培養(yǎng)育苗技術(shù)。

背景技術(shù)：

植物組織培養(yǎng)技術(shù)種苗生產(chǎn)、脫除病毒、種質(zhì)改良等具有廣闊的市場(chǎng)前景。但由于技術(shù)環(huán)節(jié)還存在不少問(wèn)題，組培成本太高，是影響組培苗市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的主要因素之一。植物組培培養(yǎng)基添加豐富的有機(jī)無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為保證免受微生物污染，培養(yǎng)基必須高壓滅菌，高壓滅菌具有資金投入大、能耗高等缺點(diǎn)。近年引起興趣的植物開放式組織培養(yǎng)，是在培養(yǎng)基添加抗菌劑，不需高壓滅菌，在開放環(huán)境(不需超凈臺(tái))接種，開放組培在提高操作效率、降低組培成本意義重大，相關(guān)專利申請(qǐng)日益增多，如申請(qǐng)?zhí)?00810047258.1、200910060484.8、200910088122.X、201010257107.6、201110195928.6、201110410305.6、201110134608.X、201110210244.9、201110311185.4、201110134616.4、201310238845.X、201310204499.3、201410097129.9、201510151118.9、201510024637.9等。

開放式組培中，雖然培養(yǎng)基中抗菌劑能抑制微生物污染，但同時(shí)可能對(duì)所培養(yǎng)植物生長(zhǎng)發(fā)育有毒副作用，這對(duì)矛盾是開放式組培的技術(shù)難點(diǎn)(關(guān)鍵)。開放式組培培養(yǎng)基微生物污染來(lái)自培養(yǎng)基自身所夾雜的微生物和瓶?jī)?nèi)空間的微生物。從已經(jīng)公開的資料來(lái)看，抗菌組培培養(yǎng)基的抗菌劑只對(duì)固體培養(yǎng)基部分抗菌，并不針對(duì)瓶?jī)?nèi)空間的微生物，以致培養(yǎng)基所附加抗菌劑必須保持在較高的濃度，難免對(duì)所培養(yǎng)植物材料產(chǎn)生毒副作用，該缺點(diǎn)限制了開放式組培在植物育苗上的廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種開放式組培的培養(yǎng)基制作方法，以解決背景技術(shù)中的問(wèn)題。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種開放式組培的培養(yǎng)基制作方法，包括如下步驟：配制含抗菌劑的開放組培培養(yǎng)基，分裝到培養(yǎng)瓶平放冷凝后，在培養(yǎng)基表面灌注一凝膠保護(hù)層，覆蓋培養(yǎng)基表面；所述凝膠保護(hù)層的厚度為0.1-1cm，凝膠為熱可逆凝膠，凝膠在凝膠保護(hù)層中的用量為0.04-1.5％；凝膠保護(hù)層中包括抗菌劑、營(yíng)養(yǎng)成分、激素和活性炭。

所述抗菌劑包括抗生素、防腐劑、殺菌劑中的至少一種，其總含量為0.02-0.5％；營(yíng)養(yǎng)成分(氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫、鐵、維生素、糖等)、激素與培養(yǎng)基所添加營(yíng)養(yǎng)成分、激素相同；活性炭添加量為0.05-0.5％。

在本發(fā)明中，抗生素種類包括多抗霉素、武夷霉素、鏈霉素、青霉素、氯霉素中的至少一種，用量分別為0.02-0.05％。

防腐劑包括山梨酸鉀0.1-0.5％、對(duì)羥基苯甲酸丙酯鈉0.03-0.3％、鄰苯酚鈉0.03-0.3％。

殺菌劑包括次氯酸鈉0.1-0.5％、六亞甲基四胺(烏洛托品)0.1-0.5％，十二烷基二甲基芐基溴化銨(新潔爾滅)0.02-0.2％、多菌靈0.03-0.3％、百菌清0.04-0.4％、甲基托布津0.03-0.3％、代森錳鋅0.08-0.5％、苦參堿0.05-0.3％、鹽酸小檗堿0.1-0.5％、乙蒜素0.05-0.3％中的至少一種。

在本發(fā)明中，如用于灌注的溶膠因自然冷卻凝滯時(shí)，可加熱溶化，繼續(xù)灌注培養(yǎng)基。

在本發(fā)明中，所述凝膠原料包括瓊脂、卡拉膠、結(jié)冷膠、果膠、魔芋膠中的至少一種。

在本發(fā)明中，所述熱可逆凝膠，可一種或幾種復(fù)配；瓊脂用量0.2％-1.5％，卡拉膠用量0.2-0.7％，結(jié)冷膠用量0.04％-0.4％，魔芋膠用量0.1-0.7％，LM型果膠用量0.1-1.0％，黃原膠用量0.2-0.7％。

本發(fā)明提供了一種開放式組培的培養(yǎng)基制作方法，采用天然熱可逆水凝膠，附加抗菌劑、營(yíng)養(yǎng)成分和活性炭,與水混合加熱融化，灌注到凝固的開放組培培養(yǎng)基表面，冷卻形成一薄凝膠層，保護(hù)層透氣良好，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育沒有明顯副作用。其原理為：由于開放式組培的培養(yǎng)基污染微生物相當(dāng)部分來(lái)自瓶?jī)?nèi)空間，這些微生物沉降到含抗菌劑的保護(hù)層表面，繁殖受到抑制，避免或減輕培養(yǎng)基遭受這些微生物侵染。

本發(fā)明的有益效果為：

(1)凝膠層所含抗菌劑濃度與一般開放組培所添加抗菌劑濃度相同，但可使培養(yǎng)基所添加的抗菌劑濃度(只抑制培養(yǎng)基自身所夾雜的微生物)較一般開放組培所添加抗菌劑濃度(既要抑制培養(yǎng)基自身所夾雜的微生物，又要抑制瓶?jī)?nèi)空間的微生物)來(lái)得低，使得對(duì)插入培養(yǎng)基的植物組織(如根等生長(zhǎng)組織)傷害較小。

(2)凝膠層添加活性炭吸附抗菌劑，避免或減少抗菌劑滲透到培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)物造成傷害。

(3)凝膠層含營(yíng)養(yǎng)成分，可供植物培養(yǎng)物生長(zhǎng)。這些都為開放式組培的成功應(yīng)用創(chuàng)造了有利條件。

本發(fā)明針對(duì)開放式組培中培養(yǎng)基添加抗菌劑濃度即要能有效抑制微生物污染，同時(shí)對(duì)所培養(yǎng)植物沒有明顯毒副作用的技術(shù)難點(diǎn)，應(yīng)用本發(fā)明方法制作開放組培培養(yǎng)基所添加的抗菌劑只(主要)用于抑制培養(yǎng)基內(nèi)部夾雜微生物的繁殖，有效降低培養(yǎng)基抗菌劑使用濃度，解決開放組培這一技術(shù)的共性問(wèn)題，該方法成本低廉、操作簡(jiǎn)易，具推廣普及可行性。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一

1、開放式組培培養(yǎng)基(對(duì)照組)制備，玻璃培養(yǎng)瓶(底部直徑6cm的罐頭瓶)洗凈，MS+6-BA 1.0ml/L+蔗糖3％，瓊脂0.6％，抗菌劑山梨酸鉀0.3％和新潔爾滅0.1％(經(jīng)實(shí)驗(yàn)，該抗菌劑濃度為開放組培培養(yǎng)基不發(fā)生微生物污染的最低濃度)，與水混合煮沸至完全溶解，定容，調(diào)pH5.6，趁熱分裝到培養(yǎng)瓶，平放冷卻凝固。

2.處理組開放組培培養(yǎng)基制備，玻璃培養(yǎng)瓶(底部直徑6cm的罐頭瓶)洗凈，MS+6-BA1.0ml/L+蔗糖3％，瓊脂0.6％，抗菌劑山梨酸鉀0.3％，高壓滅菌后平放自然冷卻。凝膠層成分同對(duì)照組培養(yǎng)基，即MS+6-BA 1.0ml/L+蔗糖3％+瓊脂0.6％+山梨酸鉀0.3％+新潔爾滅0.1％，另附加活性炭0.1％，煮沸至完全融化，冷凝前灌注到處理組開放組培培養(yǎng)基，完全覆蓋培養(yǎng)基表面，溶膠層厚度約2mm，加蓋，平放冷卻凝固。

3.接種室噴70％酒精降塵，紫外燈照射20min，用70％的酒精將接種臺(tái)面和手擦干凈，打開瓶蓋接種鐵皮石斛組培芽苗，常規(guī)培養(yǎng)。

4.對(duì)照(培養(yǎng)基未灌注凝膠)、處理組(灌注瓊脂凝膠薄層)培養(yǎng)40天，培養(yǎng)基表面、內(nèi)部均未見有微生物菌落，鐵皮石斛長(zhǎng)勢(shì)(高度、葉數(shù)、顏色)也沒顯著差異。

結(jié)論：處理組培養(yǎng)基山梨酸鉀濃度與對(duì)照相同，少了新潔爾滅，所以在培養(yǎng)基表面灌注凝膠薄層，可使在培養(yǎng)基添加較少抗菌劑情況下進(jìn)行開放組培。

實(shí)施例二

1、開放式組培培養(yǎng)基(對(duì)照組)制備，650ml蘭花瓶(底部直徑8cm)，培養(yǎng)基MS+NAA0.5ml/L+6-BA 0.1ml/L+蔗糖2％+10％生香蕉泥(W/V)，瓊脂0.6％，抗菌劑次氯酸鈉0.2％+六亞甲基四胺(烏洛托品)0.1％，與水混合加熱至完全溶解，定容，調(diào)pH5.6，趁熱分裝到培養(yǎng)瓶，平放冷卻凝固。

2、處理組開放式組培培養(yǎng)基(同對(duì)照組，即培養(yǎng)基添加次氯酸鈉0.2％+六亞甲基四胺烏洛托品0.1％)，高壓滅菌后平放自然冷卻。凝膠層制備方法：卡拉膠0.5％，附加成分MS+NAA 0.5ml/L+6-BA 0.1ml/L+蔗糖2％+10％生香蕉泥(W/V)，抗菌劑次氯酸鈉0.3％+六亞甲基四胺(烏洛托品)0.2％，活性炭0.1％，與水煮沸成溶膠，冷凝前灌注到已經(jīng)冷凝的瓊脂培養(yǎng)基，鋪滿培養(yǎng)基表面，溶膠層厚度約5mm，加蓋，平放冷卻凝固成凝膠薄層。

3.接種室噴70％酒精降塵，紫外燈照射20min，用70％的酒精將接種臺(tái)面和手擦干凈，打開瓶蓋接種植物材料(鐵皮石斛組培芽苗)，常規(guī)培養(yǎng)。

4、對(duì)照(未灌注凝膠)培養(yǎng)基培養(yǎng)8天就有微生物菌落，培養(yǎng)第40天，培養(yǎng)基表面平均每瓶有微生物菌落4.4個(gè)，培養(yǎng)基內(nèi)部未見有微生物菌落。說(shuō)明培養(yǎng)基添加次氯酸鈉0.2％+六亞甲基四胺0.1％，不足以抑制開放組培培養(yǎng)基微生物污染(要成功進(jìn)行開放式組培，無(wú)疑需添加較高的抗菌劑濃度)。處理組(灌注凝膠薄層)培養(yǎng)第40天，瓊脂培養(yǎng)基表面、內(nèi)部均未見有微生物菌落，說(shuō)明有了凝膠保護(hù)層，培養(yǎng)基添加次氯酸鈉0.2％+六亞甲基四胺0.1％就適合于進(jìn)行開放式組培。

由于本實(shí)施例設(shè)計(jì)的開放組培對(duì)照組和處理組培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分、抗菌劑相同，對(duì)照組發(fā)生微生物污染，而培養(yǎng)基表面灌注凝膠薄層能抑制污染，使在培養(yǎng)基添加較低濃度抗菌劑情況下進(jìn)行開放組培成為可能。