本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種緣毛鳥足蘭的組培快繁方法。
背景技術(shù)：
緣毛鳥足蘭(Satyrium ciliatun Ldl.)為蘭科鳥足蘭屬(Satyrium Sw.)的一種地生蘭。鳥足蘭屬約有89個(gè)種，絕大部分分布在非洲大陸和馬達(dá)加斯加群島，亞洲僅有鳥足蘭(S.nepalenseD.Don,Prodr.)、云南鳥足蘭(S.yunnanenseRolfe)和緣毛鳥足蘭(Satyrium ciliatunLdl.)等3個(gè)種分布，而我國僅有云南鳥足蘭和緣毛鳥足蘭分布，其中緣毛鳥足蘭主要分布于中國的藏南、西南和湘西等地，其多生長在海拔1900～4100m的亞高山地帶的稀矮灌叢下或林間草地上。
緣毛鳥足蘭是在具有近20000種的蘭科植物中迄今為止報(bào)導(dǎo)過的雄性不育類型與兩性類型共存的唯一例子。緣毛鳥足蘭為多年生草本植物，地下有塊莖，每年長出一個(gè)新塊莖，越冬，第二年發(fā)芽長出新植株，老的塊莖在生長季節(jié)后期萎縮，腐爛。由于塊莖營養(yǎng)繁殖方式只能延續(xù)植株的數(shù)量，并不能增加植株數(shù)量。加上利益驅(qū)使，緣毛鳥足蘭受到過度的采挖，其野生居群遭到極大的破壞，因此對其進(jìn)行人工繁育刻不容緩。
目前，國內(nèi)外尚未有緣毛鳥足蘭組織培養(yǎng)種苗繁殖的報(bào)道，也未有緣毛鳥足蘭種苗組織培養(yǎng)專利的申請。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對上述技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在提供一種通過誘導(dǎo)、增殖、分化、壯苗、煉苗移栽等過程成功獲得了優(yōu)質(zhì)的緣毛鳥足蘭組培苗，建立緣毛鳥足蘭組培快速繁殖技術(shù)體系的緣毛鳥足蘭的組培快繁方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)效果，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：一種緣毛鳥足蘭的組培快繁方法，依次包括根狀莖中間繁殖體的誘導(dǎo)步驟、增殖步驟及分化培養(yǎng)步驟，所述的根狀莖中間繁殖體的誘導(dǎo)步驟，即將外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；
其中，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括：MS、0.5～3.0mg/L 6-芐氨基腺嘌呤、0.1～1.0mg/L萘乙酸、0.05～0.1μmol/L La(NO3)3、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L瓊脂、50～100ml/L椰子汁，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為5.4～5.8。
需要說明的是，所述的增殖步驟為將誘導(dǎo)所得的根狀莖接種到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；
其中，所述的增殖培養(yǎng)基包括：MS、1.0～1.5mg/L 6-芐氨基腺嘌呤、0.1～0.5mg/L萘乙酸、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L瓊脂、50～100ml/L椰子汁、0.2～0.5g/L活性炭，所述的增殖培養(yǎng)基的pH為5.4～5.8。
需要說明的是，所述的分化培養(yǎng)步驟為將增殖培養(yǎng)所得的根狀莖接種到分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；
其中，所述的分化培養(yǎng)基包括：MS、0.5～1.5mg/L萘乙酸、0.01～0.05μmol/L La(NO3)3、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L瓊脂、0.2～0.5g/L活性炭，所述的分化培養(yǎng)基的pH為5.4～5.8。
需要說明的是，在分化培養(yǎng)步驟之后還包括壯苗培養(yǎng)步驟，即將分化培養(yǎng)所得的小苗接種到壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；
其中，所述的壯苗培養(yǎng)基包括：1/2MS、0.1～0.5mg/L萘乙酸、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L瓊脂、50～100g/L香蕉汁、0.2～0.5g/L活性炭，所述的壯苗培養(yǎng)基的pH為5.4～5.8。
需要說明的是，在壯苗培養(yǎng)步驟之后還包括煉苗和移栽步驟，即將試管苗根部放于自然光下至根系發(fā)白，將其放入混合基質(zhì)中栽培成苗；
所述的混合基質(zhì)為：體積比為2:2:1的樹皮、蘭石、泥巖。
需要說明的是，所述的根狀莖中間繁殖體的誘導(dǎo)步驟、增殖步驟、分化培養(yǎng)步驟及壯苗培養(yǎng)步驟的培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度為25～28℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)間為12～16小時(shí)/天。
需要說明的是，所述的根狀莖中間繁殖體的誘導(dǎo)步驟的培養(yǎng)時(shí)間為60～90天，所述的根狀莖的增殖步驟的培養(yǎng)時(shí)間為30～60天，所述的分化培養(yǎng)步驟的培養(yǎng)時(shí)間為40～60天，所述的壯苗培養(yǎng)步驟的培養(yǎng)時(shí)間為30～45天，所述的煉苗和移栽步驟的煉苗時(shí)間為3～5天。
需要說明的是，所述的根狀莖中間繁殖體的誘導(dǎo)步驟為：將外植體經(jīng)清水沖洗、升汞消毒、無菌水漂洗后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)60～90天即可誘導(dǎo)形成根狀莖中間繁殖體。
需要說明的是，所述的消毒方法包括以下步驟：
步驟1：將采取回實(shí)驗(yàn)室的外植體先在自來水沖洗下剝?nèi)ネ饷娴娜~鞘至僅剩三層葉鞘，將包裹有三層葉鞘的營養(yǎng)芽置于超凈工作臺(tái)中；
步驟2：于0.1％的升汞溶液中消毒30～60分鐘，無菌水沖洗2～3次后剝?nèi)ヒ粚尤~鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒10～20分鐘，無菌水沖洗3～5次后再剝?nèi)ヒ粚尤~鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒5～10分鐘，無菌水沖洗3～5次后剝?nèi)ヒ粚尤~鞘；
步驟3：立即置于0.1％的升汞溶液中消毒1～3分鐘，無菌水沖洗5～7次后用無菌濾紙吸干外植體表面的水分，迅速將外植體剪切成0.3～0.5cm左右的芽點(diǎn)并接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。
需要說明的是，所述的根狀莖中間繁殖體的誘導(dǎo)步驟之前還包括外植體采集步驟。
本發(fā)明的有益效果為：
1.通過誘導(dǎo)、增殖、分化、壯苗、煉苗移栽等過程成功獲得了優(yōu)質(zhì)的緣毛鳥足蘭組培苗，建立無緣毛鳥足蘭組培快速繁殖技術(shù)體系；
2.通過本發(fā)明培養(yǎng)獲得的緣毛鳥足蘭組培苗的存活率可達(dá)95％以上。
具體實(shí)施例
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對權(quán)利要求書做進(jìn)一步說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何人在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)。
實(shí)施例1
(1)外植體采集：2013年春季當(dāng)緣毛鳥足蘭營養(yǎng)芽萌動(dòng)時(shí)，在云南麗江縣野外采集健壯無明顯蟲害的緣毛鳥足蘭的葉鞘未打開的營養(yǎng)芽，采集后用濕潤的白紗布包裹后立即置于保鮮盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。將采集回實(shí)驗(yàn)室的營養(yǎng)芽先在自來水沖洗下剝?nèi)ネ饷娴娜~鞘至僅剩三層葉鞘，將包裹有三層葉鞘的營養(yǎng)芽置于超凈工作臺(tái)中；于0.1％的升汞溶液中消毒30分鐘，述的壯苗培養(yǎng)步驟的培養(yǎng)時(shí)間為30～45天，所述的煉苗和移栽步驟的煉苗時(shí)間為3～5天。
需要說明的是，所述的根狀莖中間繁殖體的誘導(dǎo)步驟為：將外植體經(jīng)清水沖洗、升汞消毒、無菌水漂洗后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)60～90天即可誘導(dǎo)形成根狀莖中間繁殖體。
需要說明的是，所述的消毒方法包括以下步驟：
步驟1：將采取回實(shí)驗(yàn)室的外植體先在自來水沖洗下剝?nèi)ネ饷娴娜~鞘至僅剩三層葉鞘，將包裹有三層葉鞘的營養(yǎng)芽置于超凈工作臺(tái)中；
步驟2：于0.1％的升汞溶液中消毒30～60分鐘，無菌水沖洗2～3次后剝?nèi)ヒ粚尤~鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒10～20分鐘，無菌水沖洗3～5次后再剝?nèi)ヒ粚尤~鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒5～10分鐘，無菌水沖洗3～5次后剝?nèi)ヒ粚尤~鞘；
步驟3：立即置于0.1％的升汞溶液中消毒1～3分鐘，無菌水沖洗5～7次后用無菌濾紙吸干外植體表面的水分，迅速將外植體剪切成0.3～0.5cm左右的芽點(diǎn)并接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。
需要說明的是，所述的根狀莖中間繁殖體的誘導(dǎo)步驟之前還包括外植體采集步驟。
本發(fā)明的有益效果為：
1.通過誘導(dǎo)、增殖、分化、壯苗、煉苗移栽等過程成功獲得了優(yōu)質(zhì)的緣毛鳥足蘭組培苗，建立無緣毛鳥足蘭組培快速繁殖技術(shù)體系；
2.通過本發(fā)明培養(yǎng)獲得的緣毛鳥足蘭組培苗的存活率可達(dá)95％以上。
具體實(shí)施例
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對權(quán)利要求書做進(jìn)一步說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何人在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)。
實(shí)施例1
(1)外植體采集：2013年春季當(dāng)緣毛鳥足蘭營養(yǎng)芽萌動(dòng)時(shí)，在云南麗江縣野外采集健壯無明顯蟲害的緣毛鳥足蘭的葉鞘未打開的營養(yǎng)芽，采集后用濕潤的白紗布包裹后立即置于保鮮盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。將采集回實(shí)驗(yàn)室的營養(yǎng)芽先在自來水沖洗下剝?nèi)ネ饷娴娜~鞘至僅剩三層葉鞘，將包裹有三層葉鞘的營養(yǎng)芽置于超凈工作臺(tái)中；于0.1％的升汞溶液中消毒30分鐘，無菌水沖洗2次后剝?nèi)ヒ粚尤~鞘；再置于0.1％的升汞溶液中消毒10分鐘，無菌水沖洗3次后再剝?nèi)ヒ粚尤~鞘；再置于0.1％的升汞溶液中消毒5分鐘，無菌水沖洗3次后剝?nèi)ヒ粚尤~鞘并立即置于0.1％的升汞溶液中消毒1分鐘，無菌水沖洗5次后備用。
(2)根狀莖中間繁殖體的誘導(dǎo)：將步驟(1)處理后的外植體用無菌濾紙吸干外植體表面的水分，迅速將外植體剪切成0.3～0.5cm左右的芽點(diǎn)并接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)60天即可誘導(dǎo)形成根狀莖中間繁殖體，誘導(dǎo)率達(dá)86.1％，污染率低于3.0％；
所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+3.0mg/L 6-芐氨基腺嘌呤+1.0mg/L萘乙酸+0.05μmol/LLa(NO3)3+15g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+50ml/L椰子汁，pH為5.4。
(3)根狀莖的增殖：將步驟(2)所得的根狀莖切成長約0.5cm的莖段并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天即可得到長度約為3.5～5.0cm的根狀莖，增殖系數(shù)達(dá)到6.5；
根據(jù)需要，新獲得的根狀莖可切成長約0.5cm的增殖材料并在相同的培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖；
所述的增殖培養(yǎng)基為：MS+1.5mg/L 6-芐氨基腺嘌呤+0.5mg/L萘乙酸+15g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+50ml/L椰子汁+0.2g/L活性炭，pH為5.4。
(4)分化培養(yǎng)：將步驟(3)所得的根狀莖接種到分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)40天即能分化出小苗，分化率達(dá)到91.8％。
所述的分化培養(yǎng)基為：MS+1.5mg/L萘乙酸+0.01μmol/L La(NO3)3+15g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+0.2g/L活性炭，pH為5.4。
(5)壯苗培養(yǎng)：將步驟(4)得到的小苗轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天即能形成試管苗。
所述的壯苗培養(yǎng)基為：1/2MS+0.5mg/L萘乙酸+15g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+50g/L香蕉汁+0.2g/L活性炭，pH為5.4。
(6)移栽：將步驟(5)所得健壯的試管苗在溫室的自然光下煉苗3天，洗凈根部的培養(yǎng)基后在溫室的自然光放置至根系發(fā)白，在體積比為2:2:1的樹皮、蘭石、泥巖的混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率達(dá)到95.9％。
上述步驟(2)～(5)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為1500lx，光照時(shí)間為12小時(shí)/天。
實(shí)施例2
(1)外植體采集：2014春季當(dāng)緣毛鳥足蘭營養(yǎng)芽萌動(dòng)時(shí)，于云南大理野外采集健壯無明顯蟲害的緣毛鳥足蘭的葉鞘未打開的營養(yǎng)芽，采集后用濕潤的白紗布包裹后立即置于保鮮盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。將采集回實(shí)驗(yàn)室的營養(yǎng)芽先在自來水沖洗下剝?nèi)ネ饷娴娜~鞘至僅剩三層葉鞘；將包裹有三層葉鞘的營養(yǎng)芽置于超凈工作臺(tái)中于0.1％的升汞溶液中消毒45分鐘，無菌水沖洗3次后剝?nèi)ヒ粚尤~鞘；再置于0.1％的升汞溶液中消毒15分鐘，無菌水沖洗4次后再剝?nèi)ヒ粚尤~鞘；再置于0.1％的升汞溶液中消毒8分鐘，無菌水沖洗4次后剝?nèi)ヒ粚尤~鞘并立即置于0.1％的升汞溶液中消毒2分鐘，無菌水沖洗6次后備用。
(2)根狀莖中間繁殖體的誘導(dǎo)：將步驟(1)獲得的外植體用無菌濾紙吸干外植體表面的水分，迅速將外植體剪切成0.3～0.5cm左右的芽點(diǎn)并接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)80天即可誘導(dǎo)形成根狀莖中間繁殖體，誘導(dǎo)率達(dá)到89.7％，污染率低于3％以下。
所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+1.5mg/L 6-芐氨基腺嘌呤+0.6mg/L萘乙酸+0.07μmol/L La(NO3)3+23g/L蔗糖+4.2g/L瓊脂+65ml/L椰子汁，pH為5.6。
(3)根狀莖的增殖：將步驟(2)所得的根狀莖切成長約0.5cm的莖段并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)50天即可得到長度約為3.5～5.0cm的根狀莖,增殖系數(shù)達(dá)到7.1；
根據(jù)需要，新獲得的根狀莖可切成長約0.5cm的增殖材料并在相同的培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖；
所述的增殖培養(yǎng)基為：MS+1.2mg/L 6-芐氨基腺嘌呤+0.35mg/L萘乙酸+24g/L蔗糖+4.5g/L瓊脂+68ml/L椰子汁+0.3g/L活性炭，pH為5.6。
(4)分化培養(yǎng)：將步驟(3)所得的根狀莖接種到分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)55天即能分化出小苗，分化率為94.2％。
所述的分化培養(yǎng)基為：MS+0.85mg/L萘乙酸+0.04μmol/L La(NO3)3+25g/L蔗糖+4.0g/L瓊脂+0.3g/L活性炭，pH為5.6。
(5)壯苗培養(yǎng)：將步驟(4)得到的小苗轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)37天即能形成試管苗。
所述的壯苗培養(yǎng)基為：1/2MS+0.4mg/L萘乙酸+22g/L蔗糖+4.7g/L瓊脂+80g/L香蕉汁+0.4g/L活性炭，pH為5.6。
(6)移栽：將步驟(5)所得健壯的試管苗在溫室的自然光下煉4天，洗凈根部的培養(yǎng)基后在溫室的自然光放置至根系發(fā)白，在體積比為2:2:1的樹皮、蘭石、泥巖的混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗，移栽30后成活率達(dá)到100％。
上述步驟(2)～(5)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為27℃，光照強(qiáng)度為1700lx，光照時(shí)間為14小時(shí)/天。
實(shí)施例3
(1)外植體采集：2015年春季當(dāng)營養(yǎng)芽萌動(dòng)時(shí)，在云南賓川縣野外采集健壯無明顯蟲害的緣毛鳥足蘭的葉鞘未打開的營養(yǎng)芽，采集后用濕潤的白紗布包裹后立即置于保鮮盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。將采集回實(shí)驗(yàn)室的營養(yǎng)芽先在自來水沖洗下剝?nèi)ネ饷娴娜~鞘至僅剩三層葉鞘；將包裹有三層葉鞘的營養(yǎng)芽置于超凈工作臺(tái)中于0.1％的升汞溶液中消毒60分鐘，無菌水沖洗3次后剝?nèi)ヒ粚尤~鞘；再置于0.1％的升汞溶液中消毒20分鐘，無菌水沖洗5次后再剝?nèi)ヒ粚尤~鞘；再置于0.1％的升汞溶液中消毒10分鐘，無菌水沖洗5次后剝?nèi)ヒ粚尤~鞘并立即置于0.1％的升汞溶液中消毒3分鐘，無菌水沖洗7次后備用。
(2)根狀莖中間繁殖體的誘導(dǎo)：將步驟(1)獲得的外植體用無菌濾紙吸干外植體表面的水分，迅速將外植體剪切成0.3～0.5cm左右的芽點(diǎn)并接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)90天即可誘導(dǎo)形成根狀莖中間繁殖體，誘導(dǎo)率為70.8％，污染率低于1％。
所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+0.5mg/L 6-芐氨基腺嘌呤+0.1mg/L萘乙酸+0.1μmol/L La(NO3)3+30g/L蔗糖+6.0g/L瓊脂+100ml/L椰子汁，pH為5.8。
(3)根狀莖的增殖：將步驟(2)所得的根狀莖切成長約0.5cm的莖段并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)60天即可得到長度約為3.5～5.0cm的根狀莖，增殖系數(shù)達(dá)到6.8；
根據(jù)需要，新獲得的根狀莖可切成長約0.5cm的增殖材料并在相同的培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖；
所述的增殖培養(yǎng)基為：MS+1.0mg/L 6-芐氨基腺嘌呤+0.1mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+6.0g/L瓊脂+100ml/L椰子汁+0.5g/L活性炭，pH為5.8。
(4)分化培養(yǎng)：將步驟(3)所得的根狀莖接種到分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)60天即能分化出小苗，分化率達(dá)到96.4％。
所述的分化培養(yǎng)基為：MS+0.5mg/L萘乙酸+0.05μmol/L La(NO3)3+30g/L蔗糖+6.0g/L瓊脂+0.5g/L活性炭，pH為5.8。
(5)壯苗培養(yǎng)：將步驟(4)得到的小苗轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)45天即能形成試管苗，
所述的壯苗培養(yǎng)基為：1/2MS+0.1mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+6.0g/L瓊脂+100g/L香蕉汁+0.5g/L活性炭，pH為5.8。
(6)移栽：將步驟(5)所得健壯的試管苗在溫室的自然光下煉苗5天，洗凈根部的培養(yǎng)基后在溫室的自然光放置至根系發(fā)白，在體積比為2:2:1的樹皮、蘭石、泥巖的混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率達(dá)到95％。
上述步驟(2)～(5)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為2000lx，光照時(shí)間為16小時(shí)/天。
以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。