本發(fā)明提供一種莼菜叢生芽的誘導(dǎo)方法，屬于植物組織培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：莼菜，屬睡蓮科的一種水草，列入中國國家Ⅰ級重點(diǎn)保護(hù)野生植物（國務(wù)院1999年8月4日批準(zhǔn)），是珍貴的野生水生蔬菜，含有酸性多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、組胺和微量元素等，其價(jià)值主要體現(xiàn)在醫(yī)用價(jià)值和食用價(jià)值。莼菜含有豐富的膠質(zhì)蛋白、碳水化合物，脂肪、多種維生素和礦物質(zhì)，常食莼菜具有藥食兩用的保健作用，是珍貴的水生蔬菜之一。但是由于多年未做有效的品種提純復(fù)壯和品種保護(hù)，莼菜種性退化已經(jīng)比較嚴(yán)重，質(zhì)量和產(chǎn)量都在下降。目前尚缺乏成熟技術(shù)，可以大規(guī)模擴(kuò)繁莼菜優(yōu)質(zhì)工程苗，同時(shí)克服該物種在自然環(huán)境中種源有限且品種逐漸退化的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種莼菜叢生芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基及誘導(dǎo)方法，該方法是在無菌條件下，采取控溫措施，給予固定光照，誘導(dǎo)莼菜叢生芽，逐步成績無菌苗體系，后期可常年提供大量無菌幼苗。方法易行，操作方便，產(chǎn)量高。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：一種莼菜叢生芽的誘導(dǎo)方法，包括以下步驟：A、外植體選擇與預(yù)處理：選擇顏色鮮綠、淤泥覆蓋少的可萌發(fā)腋芽的莼菜莖段作為外植體，用堿性洗滌劑浸泡10min，用軟毛刷輕輕刷掉表面淤泥至莖段呈綠色，用自來水沖洗1小時(shí)，用蒸餾水反復(fù)沖洗4-5次，用無菌水再反復(fù)清洗4-5次，待用；B、外植體滅菌：在無菌操作臺上首先用75%乙醇浸泡30秒，用無菌水沖洗4-5次，再用0.1%氯化汞(加入幾滴吐溫80)進(jìn)行表面消毒10分鐘，無菌水沖洗4-5次，在無菌濾紙上將水吸干，待用；C、芽誘導(dǎo)：選擇1.0mg/L6-BA和0.15mg/LNAA的MS固體培養(yǎng)基，蔗糖質(zhì)量濃度為3%，活性炭質(zhì)量濃度為0.4%，pH調(diào)至5.8-6.0，固體培養(yǎng)基裝于組培瓶中；固體培養(yǎng)基經(jīng)過120℃滅菌處理20min，冷卻后，接入滅菌后的1-1.5cm的莼菜外植體，加入無菌水超過固體培養(yǎng)基面3-4cm，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待幼芽長至2.0-3.0cm進(jìn)行增殖培養(yǎng)；D、芽增殖培養(yǎng)：選擇蔗糖質(zhì)量濃度3%，活性炭質(zhì)量濃度為0.4%的MS固體培養(yǎng)基，添加0.5-2.00mg/L6-BA、2-4mg/L2,4-D、0.1-0.50mg/LNAA的激素；培養(yǎng)基分裝、培養(yǎng)基滅菌方式與芽誘導(dǎo)相同，加入無菌水超過固體培養(yǎng)基面3-4cm，接入長2.0-3.0cm的幼芽于光照培養(yǎng)箱中，進(jìn)行增殖培養(yǎng)；所述的步驟C、D均為無菌環(huán)境，光照60-70μE/（m2·s），光照周期為12h/d，室內(nèi)溫度（25±2）℃。優(yōu)選的，步驟B中，用0.1%氯化汞（加入幾滴吐溫80）進(jìn)行表面消毒10min，步驟C中，6-BA的濃度為1.0mg/L，NAA的濃度為0.15mg/L。本發(fā)明具有以下有益效果：目前關(guān)于莼菜組織培養(yǎng)的技術(shù)未見報(bào)道，也沒有系統(tǒng)的對莼菜作出研究。該技術(shù)能直接誘導(dǎo)莼菜幼芽的生長，不斷產(chǎn)生叢生芽，為莼菜無菌繁殖體系的建立提供技術(shù)攻關(guān)。莼菜一年四季均可栽植，尤以春季萌發(fā)前移栽成活率最高，又可當(dāng)年收獲，利用本發(fā)明可以不受季節(jié)、溫度、地域影響，獲得大量的叢生芽，后期再進(jìn)行生根培養(yǎng)等，可快速建立莼菜的無菌繁殖體系，為保持莼菜優(yōu)良的種性提供技術(shù)支持，可為廣大的養(yǎng)殖戶提供源源不斷地?zé)o菌種苗。一個(gè)為長1.5cm的外植體經(jīng)過一個(gè)月的培養(yǎng)芽增殖系數(shù)最高可達(dá)到8倍。以一個(gè)芽30d繼代一次，每次的芽增殖系數(shù)為8計(jì)算，預(yù)期結(jié)果如下表1所示。表1天數(shù)/d3090150210270330360苗數(shù)/棵883858789811812附圖說明圖1是實(shí)施例一中莼菜30d增殖情況，圖2是實(shí)施例二中莼菜30d增殖情況。具體實(shí)施方式本發(fā)明實(shí)施例所使用的試劑，如未特別說明，市售的均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所涉及的技術(shù)方案，如未特別說明，均可采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。實(shí)施例中采用的MS培養(yǎng)基配方如下：單位mg/LKNO31900NH4NO31650MgSO4?7H2O370KH2PO4170CaCl2?2H2O440MnSO4?4H2O22.3ZnSO4?7H2O8.6H3BO36.2KI0.83Na2MoO4?7H2O0.25CuSO4.5H2O0.025CoCL2.6H2O0.025Na2-EDTA37.3FeSO4?7H2O27.8甘氨酸2.0鹽酸吡哆醇0.5鹽酸硫銨素0.1煙酸0.5肌酸100。MS固體培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)配方中加入7g/L瓊脂。實(shí)施例一A、外植體選擇與預(yù)處理：選擇顏色鮮綠、淤泥覆蓋少的可萌發(fā)腋芽的莼菜莖段作為外植體，用堿性洗滌劑浸泡10min，用軟毛刷輕輕刷掉表面淤泥至莖段呈綠色，用自來水沖洗1小時(shí)，用蒸餾水反復(fù)沖洗4-5次，用無菌水再反復(fù)清洗4-5次，待用；B、外植體滅菌：在無菌操作臺上首先用75%乙醇浸泡30秒，用無菌水沖洗4-5次，再用0.1%氯化汞(加入幾滴吐溫80)進(jìn)行表面消毒10分鐘，無菌水沖洗4-5次，在無菌濾紙上將水吸干，待用；C、芽誘導(dǎo)：選擇1.0mg/L6-BA和0.15mg/LNAA的MS固體培養(yǎng)基，蔗糖質(zhì)量濃度為3%，活性炭質(zhì)量濃度為0.4%，pH調(diào)至5.8-6.0，固體培養(yǎng)基裝于組培瓶中；固體培養(yǎng)基經(jīng)過120℃滅菌處理20min，冷卻后，接入滅菌后的1-1.5cm的莼菜外植體，加入無菌水超過固體培養(yǎng)基面3-4cm，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待幼芽長至2.0-3.0cm進(jìn)行增殖培養(yǎng)；D、芽增殖培養(yǎng)：選擇蔗糖質(zhì)量濃度3%，活性炭質(zhì)量濃度為0.4%的MS固體培養(yǎng)基，添加0.5mg/L6-BA、4mg/L2,4-D、0.1mg/LNAA的激素；培養(yǎng)基分裝、培養(yǎng)基滅菌方式與芽誘導(dǎo)相同，加入無菌水超過固體培養(yǎng)基面3-4cm，接入長2.0-3.0cm的幼芽于光照培養(yǎng)箱中，誘導(dǎo)大量叢生芽；所述的步驟C、D、均采用無菌環(huán)境，光照60-70μE/（m2·s），光照周期為12h/d，室內(nèi)溫度（25±2）℃。本方法可以由一個(gè)外植體直接誘導(dǎo)出幼芽，再不斷繁殖得到更多的叢芽，30d的增殖系數(shù)達(dá)到8，存活率大于90%。圖1是實(shí)施例一中莼菜30d增殖情況。實(shí)施例二A、外植體選擇與預(yù)處理：選擇顏色鮮綠、淤泥覆蓋少的可萌發(fā)腋芽的莼菜莖段作為外植體，用堿性洗滌劑浸泡10min，用軟毛刷輕輕刷掉表面淤泥至莖段呈綠色，用自來水沖洗1小時(shí)，用蒸餾水反復(fù)沖洗4-5次，用無菌水再反復(fù)清洗4-5次，待用；B、外植體滅菌：在無菌操作臺上首先用75%乙醇浸泡30秒，用無菌水沖洗4-5次，再用0.1%氯化汞(加入幾滴吐溫80)進(jìn)行表面消毒10分鐘，無菌水沖洗4-5次，在無菌濾紙上將水吸干，待用；C、芽誘導(dǎo)：選擇1.0mg/L6-BA和0.15mg/LNAA的MS固體培養(yǎng)基，蔗糖質(zhì)量濃度為3%，活性炭質(zhì)量濃度為0.4%，pH調(diào)至5.8-6.0，固體培養(yǎng)基裝于組培瓶中；固體培養(yǎng)基經(jīng)過120℃滅菌處理20min，冷卻后，接入滅菌后的1-1.5cm的莼菜外植體，加入無菌水超過固體培養(yǎng)基面3-4cm，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待幼芽長至2.0-3.0cm進(jìn)行增殖培養(yǎng)；D、芽增殖培養(yǎng)：選擇蔗糖質(zhì)量濃度3%，活性炭質(zhì)量濃度為0.4%的MS固體培養(yǎng)基，添加2.00mg/L6-BA、2mg/L2,4-D、0.50mg/LNAA的激素；培養(yǎng)基分裝、培養(yǎng)基滅菌方式與芽誘導(dǎo)相同，加入無菌水超過固體培養(yǎng)基面3-4cm，接入長2.0-3.0cm的幼芽于光照培養(yǎng)箱中，進(jìn)行增殖培養(yǎng)；所述的步驟C、D均采用無菌環(huán)境，光照60-70μE/（m2·s），光照周期為12h/d，室內(nèi)溫度（25±2）℃。本方法由一個(gè)外植體直接誘導(dǎo)出幼苗，30d的增殖系數(shù)可以達(dá)到6倍，存活率大于85%。圖2是實(shí)施例二中莼菜30d增殖情況。本發(fā)明采用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，對莼菜進(jìn)行組織培養(yǎng)誘導(dǎo)叢生芽，逐步建立快速繁殖無菌體系，使優(yōu)良品種能迅速推廣種植，生產(chǎn)成本低，培養(yǎng)周期短，實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)的目的，具有廣闊的應(yīng)用前景和較高的推廣價(jià)值，經(jīng)濟(jì)效益顯著。當(dāng)前第1頁1 2 3