技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物抗旱性鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及苜蓿品種抗旱能力的高效鑒定方法。

背景技術(shù)：

苜?？购敌澡b定常伴隨苜蓿引種與選育進行。通常把抗旱性不同的苜蓿品種在田間栽培或室內(nèi)培養(yǎng)，在正常水分條件(對照)或脅迫強度增大的干旱脅迫下，使其幼苗生長或處理一定的時間，比較各苜蓿品種受不同干旱脅迫影響后其形態(tài)和生理指標(biāo)的變化，通過二者的相關(guān)分析，對其抗旱性作綜合評定。在紫花苜蓿的抗旱性鑒定中，重點在于抗旱性指標(biāo)的選擇，歸納起來有形態(tài)指標(biāo)、生理指標(biāo)、生長發(fā)育指標(biāo)、生產(chǎn)性能指標(biāo)等四大類。一般包括根、葉形態(tài)指標(biāo)、相對含水量、葉水勢、質(zhì)膜透性、 脯氨酸含量、酶活力、根冠比、產(chǎn)量等。也可先利用限制性片段長度多態(tài)性(RFIP)甄別抗旱基因的存在并進行抗旱基因定位，建立RELP遺傳連鎖來鑒定其抗旱性。目前較常見的多以田間指標(biāo)或者結(jié)合若干生理指標(biāo)對紫花苜蓿的抗旱性作出評價，但與抗旱性相關(guān)的生理生化指標(biāo)有許多，隨著研究的進一步深入，人們對于某些指標(biāo)與抗旱性的關(guān)系產(chǎn)生了疑問，某些指標(biāo)與抗旱性并非呈簡單的線性關(guān)系，且不同脅迫程度下，與苜?？购敌悦芮邢嚓P(guān)的指標(biāo)也不確定。由于苜蓿的抗旱性受多因素的影響，適當(dāng)?shù)蔫b定指標(biāo)是準(zhǔn)確評價苜蓿抗旱性的關(guān)鍵。因此，簡單、可靠的抗旱鑒定方法和準(zhǔn)確高效的鑒定指標(biāo)的正確選擇在苜?？购的芰﹁b定中具有重要意義。

現(xiàn)有技術(shù)中，有關(guān)苜?？购敌澡b定的技術(shù)較多，主要是采用溫室盆栽模擬旱境或不同水勢PEG-6000模擬干旱脅迫結(jié)合測定若干生理指標(biāo)的方法鑒定不同苜蓿品種的抗旱性能，并采用相應(yīng)的評定方法，如直接比較法、總抗旱性評價法、隸屬函數(shù)法、層次分析法 (AHP)、主成分分析法和灰色關(guān)聯(lián)度模型綜合評價苜蓿品種的抗旱能力。李慥哲（1991）用聚乙二醇 (PEG-6000) 溶液模擬干旱脅迫條件，測定了10個苜蓿品種組織相對含水量、地上部干物質(zhì)產(chǎn)量、相對生長率、細(xì)胞膜透性、過氧化物酶活性、游離脯氨酸含量、葉片持水力、高滲溶液下種子的發(fā)芽率、反復(fù)干旱幼苗成活率。應(yīng)用主成分分析對這些苜蓿品種幼苗的抗旱性進行了綜合評定，使其歸屬于強抗旱、中抗旱和弱抗旱3 個抗旱等級。康俊梅等（2004）對來自國內(nèi)外不同種質(zhì)的 41 個紫花苜蓿品種進行盆栽試驗，測定了水分飽和虧缺、死亡率、干物質(zhì)脅迫指數(shù)、根系脅迫指數(shù)、地上生物量、地下生物量等7個抗旱鑒定指標(biāo)，應(yīng)用系統(tǒng)聚類的方法對數(shù)據(jù)進行分級聚類，使其歸屬于強抗旱、中抗旱和弱抗旱3 個抗旱等級。孟林等（2008）對17 個苜蓿品種苗期干旱后的葉片相對含水量、脯氨酸含量和質(zhì)膜透性 3 個抗旱生理指標(biāo)進行了分析評價，并將17 個苜蓿品種劃分為抗旱性較強、中等、較弱 3 類。

以上采用溫室盆栽模擬旱境或PEG模擬干旱結(jié)合測定抗旱生理指標(biāo)評價苜蓿幼苗抗旱能力時，其評價方法均為統(tǒng)一指標(biāo)體系下的綜合評價，僅考慮不同抗旱級別苜蓿的相同抗旱生理指標(biāo)類別對干旱脅迫的敏感性存在差異，但未考慮不同脅迫強度下不同抗旱級別苜蓿的敏感性生理指標(biāo)類別群存在差異性的特征，故選擇的抗旱生理指標(biāo)缺乏特殊性和代表性，進而影響了苜?？购敌跃C合評價結(jié)果的準(zhǔn)確度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種苜蓿品種抗旱能力的高效鑒定方法，是采用不同濃度PEG-6000模擬干旱脅迫，分別測定不同抗旱脅迫程度下苜蓿品種最敏感的生理指標(biāo)；并根據(jù)各脅迫程度下敏感性生理指標(biāo)類別群差異特征，將苜蓿品種劃分為強抗旱、中抗旱和弱抗旱苜蓿，以便簡單、準(zhǔn)確高效地鑒定苜蓿品種的抗旱能力。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：苜蓿品種抗旱能力的高效鑒定方法，包括以下步驟：

1）進行聚乙二醇PEG-6000模擬干旱脅迫處理：在室溫25℃下，用等量含不同濃度聚乙二醇PEG-6000的Hoagland’s營養(yǎng)液根際脅迫苜蓿幼苗7d；

2）測定不同脅迫強度下，不同抗旱級別苜蓿品種響應(yīng)各脅迫強度時變化最敏感的生理指標(biāo)及其敏感閾值；

3）選取與不同抗旱級別苜蓿密切相關(guān)的生理指標(biāo)及其敏感閾值作為鑒定依據(jù)，建立與苜?？购导墑e相對應(yīng)的敏感性生理指標(biāo)群及敏感閾值指標(biāo)體系；

4）根據(jù)建立的與苜?？购导墑e相對應(yīng)的敏感性生理指標(biāo)群及敏感閾值指標(biāo)體系，將待鑒定的苜蓿品種劃分為抗旱性強、中、弱3 類。

進一步的，上述的苜蓿品種抗旱能力的高效鑒定方法，所述步驟2）中，測定得到不同抗旱級別苜蓿對應(yīng)的生理指標(biāo)群所包含的最敏感的生理指標(biāo)分別為：

a）0-0.18g/mL的PEG-6000輕度脅迫下，最敏感的生理指標(biāo)為脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、過氧化氫酶活性、過氧化氫含量和羥自由基濃度；

b）0.18-0.33 g/mL的PEG-6000中度脅迫下，最敏感的生理指標(biāo)為過氧化氫含量、葉片相對含水量、還原性抗壞血酸含量和SOD活性；

c）0.33-0.43g/mL的PEG-6000重度脅迫下，最敏感的生理指標(biāo)為還原性抗壞血酸含量、丙二醛含量、還原性谷胱甘肽含量、過氧化氫酶活性、超氧陰離子自由基含量和葉綠素含量。

進一步的，上述的苜蓿品種抗旱能力的高效鑒定方法，所述步驟3）中，最敏感的生理指標(biāo)閾值及其構(gòu)建的劃分標(biāo)準(zhǔn)體系指標(biāo)的具體劃分方式為：

A）0-0.18g/mL的輕度脅迫，強抗旱苜蓿過氧化氫和羥自由基含量變化最敏感，且分別低于32.12μmol·g^-1和1891.22 A·1000·g^-1；中抗旱苜蓿過氧化氫酶活性變化最敏感，且介于46.59-75.47U·g^-1·min^-1；弱抗旱苜蓿脯氨酸和可溶性蛋白含量變化最敏感，且脯氨酸含量低于288.26μg·g^-1、可溶性蛋白含量高于6.42 mg.g^-1；

B）0.18-0.33 g/mL的中度脅迫，強抗旱苜蓿葉片相對含水量和過氧化氫含量變化最敏感，且葉片相對含水量大于50.43%、過氧化氫含量低于78.27μmol·g^-1；中抗旱苜蓿還原性抗壞血酸含量變化最敏感 ，且介于60.44-215.10μg·g^-1 ；弱抗旱苜蓿葉片相對含水量和SOD活性變化最敏感，且葉片相對含水量小于32.06%、SOD活性低于360.64 U·g^-1；

C）0.33-0.43g/mL的重度脅迫，強抗旱苜蓿還原性抗壞血酸和還原性谷胱甘肽含量變化最敏感，且分別高于432.95μg·g^-1和5280.17μmol·g^-1；中抗旱苜蓿丙二醛含量變化最敏感，且介于 0.13-0.15μmol·g^-1；弱抗旱苜蓿過氧化氫酶活性、還原性谷胱甘肽含量、葉綠素含量和超氧陰離子自由基含量變化最敏感，且過氧化氫酶活性低于297.45 U·g^-1·min^-1、還原性谷胱甘肽含量低于2394.42μmol·g^-1、葉綠素含量低于2.46 mg.g^-1、超氧陰離子自由基含量高于152.92 nmol·g^-1·min^-1；

D）同時滿足所述A）、B）、C）中，強抗旱苜蓿指標(biāo)群的各指標(biāo)閾值要求，則歸為強抗旱苜蓿；同時滿足所述A）、B）、C）中，中抗旱苜蓿指標(biāo)群的各指標(biāo)閾值要求，則歸為中抗旱苜蓿；同時滿足所述A）、B）、C）中，弱抗旱苜蓿指標(biāo)群的各指標(biāo)閾值要求，則歸為弱抗旱苜蓿品種。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的苜蓿品種抗旱能力的高效鑒定方法，在采用不同濃度PEG-6000模擬干旱脅迫時，在考慮不同抗旱級別苜蓿品種敏感性生理指標(biāo)類別體系存在差異的基礎(chǔ)上，選取不同脅迫程度下與苜蓿抗旱性密切相關(guān)的生理指標(biāo)作為鑒定指標(biāo)，根據(jù)不同脅迫強度相應(yīng)的敏感性生理指標(biāo)群及其指標(biāo)敏感閾值對苜蓿的抗旱能力進行分級，提高苜?？购敌跃C合評價結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而準(zhǔn)確地鑒定苜蓿品種的抗旱能力，具有很好的實用性和可靠性。此外，本發(fā)明的方法可在實驗室完成苜蓿抗旱能力的鑒定，試驗條件易于控制，成本較低，操作性強。

具體實施方式

實施例1：

苜蓿品種抗旱能力的高效鑒定方法，包括以下步驟：

1）進行聚乙二醇PEG-6000模擬干旱脅迫處理：在室溫25℃下，用等量含不同濃度聚乙二醇PEG-6000的Hoagland’s營養(yǎng)液根際脅迫苜蓿幼苗7d；

2）測定不同脅迫強度下，不同抗旱級別苜蓿品種響應(yīng)各脅迫強度時變化最敏感的生理指標(biāo)；測定得到的最敏感的生理指標(biāo)分別為：

a）0-0.18g/mL的輕度脅迫下，最敏感的生理指標(biāo)為脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、過氧化氫酶活性、過氧化氫含量和羥自由基濃度；

b）0.18-0.33 g/mL的中度脅迫下，最敏感的生理指標(biāo)為過氧化氫含量、葉片相對含水量、還原性抗壞血酸含量和SOD活性；

c）0.33-0.43g/mL的重度脅迫下，最敏感的生理指標(biāo)為還原性抗壞血酸含量、還原性谷胱甘肽含量、過氧化氫酶活性、超氧陰離子自由基含量和葉綠素含量；

3）根據(jù)各生理指標(biāo)對干旱脅迫的敏感閾值，將待鑒定的苜蓿品種劃分為抗旱性強、中、弱3 類，劃分的具體方式為：

A）0-0.18g/mL的輕度脅迫，強抗旱苜蓿過氧化氫和羥自由基含量變化最敏感，且分別低于32.12μmol·g^-1和1891.22 A·1000·g^-1；中抗旱苜蓿過氧化氫酶活性變化最敏感，且介于46.59-75.47U·g^-1·min^-1；弱抗旱苜蓿脯氨酸和可溶性蛋白含量變化最敏感，且脯氨酸含量低于288.26μg·g^-1、可溶性蛋白含量高于6.42 mg.g^-1；

B）0.18-0.33 g/mL的中度脅迫，強抗旱苜蓿葉片相對含水量和過氧化氫含量變化最敏感，且葉片相對含水量大于50.43%、過氧化氫含量低于78.27μmol·g^-1；中抗旱苜蓿還原性抗壞血酸含量變化最敏感 ，且介于60.44-215.10μg·g^-1；弱抗旱苜蓿葉片相對含水量和SOD活性變化最敏感，且葉片相對含水量小于32.06%、SOD活性低于360.64 U·g^-1；

C）0.33-0.43g/mL的重度脅迫，強抗旱苜蓿還原性抗壞血酸和還原性谷胱甘肽含量變化最敏感，且分別高于432.95μg·g^-1和5280.17μmol·g^-1；中抗旱苜蓿丙二醛（MDA）含量變化最敏感，且介于 0.13-0.15μmol·g^-1；弱抗旱苜蓿過氧化氫酶活性、還原性谷胱甘肽含量、葉綠素含量和超氧陰離子自由基含量變化最敏感，且過氧化氫酶活性低于297.45 U·g^-1·min^-1、還原性谷胱甘肽含量低于2394.42μmol·g^-1、葉綠素含量低于2.46 mg.g^-1、超氧陰離子自由基含量高于152.92 nmol·g^-1·min^-1；

D）同時滿足所述A）、B）、C）中，強抗旱苜蓿指標(biāo)群的各指標(biāo)閾值要求，則歸為強抗旱苜蓿；同時滿足所述A）、B）、C）中，中抗旱苜蓿指標(biāo)群的各指標(biāo)閾值要求，則歸為中抗旱苜蓿；同時滿足所述A）、B）、C）中，弱抗旱苜蓿指標(biāo)群的各指標(biāo)閾值要求，則歸為弱抗旱苜蓿品種。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。