本發(fā)明屬于植物細(xì)胞培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛是珍稀名貴中藥材，素有“千金草”、“植物黃金”、“健康軟黃金”之稱，因其藥效如神、極其稀少、生存環(huán)境特殊和極佳的滋補(bǔ)功效，而名列“中華九大仙草”之首，被國(guó)際藥用植物界稱為“藥界大熊貓”。鐵皮石斛的主要成分是多糖和生物堿，還富含氨基酸，其中包括7種人體必需氨基酸(除色氨酸外)和3種人體必須氨基酸，還含有豐富的微量元素，尤以Se(硒)和Fe(鐵)的含量較高?，F(xiàn)代臨床應(yīng)用和藥理研究證實(shí)：鐵皮石斛對(duì)咽喉疾病、腸胃疾病、白內(nèi)障、心血管疾病、糖尿病及抑制腫瘤生長(zhǎng)具有顯著療效；對(duì)增強(qiáng)免疫力、擴(kuò)張血管、抗血小板凝集、提高肌體免疫機(jī)能有極好的效果。同時(shí)，還具有抗衰老、刺激唾液分泌、抗疲勞、耐缺氧、養(yǎng)顏美發(fā)、明目強(qiáng)身等作用。特別是滋陰潤(rùn)肺、養(yǎng)胃生津、健腦明目、補(bǔ)五臟之虛勞；對(duì)煙酒過(guò)度、勞累過(guò)度、夜生活過(guò)度、用眼用腦過(guò)度、聲帶嘶啞等有特殊療效；對(duì)人的肺癌細(xì)胞、萎縮性胃炎、糖尿病有極大的抑制作用。對(duì)于我國(guó)上千萬(wàn)咽喉炎、氣管炎、肺癌患者和4000多萬(wàn)糖尿病患者，1千多萬(wàn)教師隊(duì)伍，3億多煙民來(lái)說(shuō)是極好的防病、治病、保健良藥。石斛對(duì)抗氧化和延緩衰老也有顯著作用，能顯著提高SOD的水平，使LPO顯著下降，并能有效地降低血糖，為眾多糖尿病患者開(kāi)辟了一條天然全新的治療途徑，受到醫(yī)學(xué)界的重視。
中國(guó)專利申請(qǐng)CN103875533A公開(kāi)了一種鐵皮石斛體細(xì)胞胚增殖保存的方法及培養(yǎng)基，包括以下步驟：1)外植體的消毒；2)原球莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)；3)體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)；4)體細(xì)胞胚的增殖保存培養(yǎng)；5)體細(xì)胞胚的恢復(fù)生長(zhǎng)與增殖培養(yǎng)；6)體細(xì)胞胚的萌發(fā)；7)試管苗的壯苗生根培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基的配方是：MS基本培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤0.5～1.5mg/L，6-糖基氨基嘌呤0.2～0.8mg/L，萘乙酸0.2～0.6mg/L，水解酪蛋白0.4～0.8g/L，活性炭0.3～0.6g/L，蔗糖2～4％，瓊脂粉6～7g/L。
中國(guó)專利申請(qǐng)CN105123513A公開(kāi)了一種鐵皮石斛厭氧發(fā)酵殘留物培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基由下列質(zhì)量百分比的原料組成：厭氧發(fā)酵殘留物5～30％，MS基本培養(yǎng)基10～40％，1/2MS基本培養(yǎng)10～40％，蔗糖2～3％，香蕉5～10％，洋芋5～10％，瓊脂粉0.35～0.5％，生長(zhǎng)素1.5×10-5～1×10-4％，細(xì)胞分裂素2×10-5～2×10-4％，活性炭0.2～0.4％，余量為蒸餾水，厭氧發(fā)酵殘留物含有豐富的氮、磷、鉀、鈣、銅、鐵、鎂、錳和鋅等營(yíng)養(yǎng)元素以及氨基酸類、水解酶類、B族維生素和激素等。
鐵皮石斛因具有獨(dú)特而神奇的功效，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)供不應(yīng)求。長(zhǎng)期以來(lái)，人們用此藥都是依靠采挖收集野生資源。高額利潤(rùn)的誘惑，使野生鐵皮石斛成為世界珍稀瀕危植物，受到國(guó)家的重視和保護(hù)。石斛是目前《中華人民共和國(guó)藥典》記載中藥材涉及植物來(lái)源最為眾多、應(yīng)用最為廣泛、使用最為頻繁的一種極為珍稀名貴的中藥材。因此，研制出一種適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，使鐵皮石斛得以延續(xù)迫在眉睫。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其制備方法。本發(fā)明提供的適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，能夠?qū)崿F(xiàn)鐵皮石斛的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，能夠使細(xì)胞培養(yǎng)和育苗實(shí)現(xiàn)規(guī)?；S生產(chǎn)，可明顯縮短鐵皮石斛的生長(zhǎng)繁殖周期，更宜于后期的有效成分提取等工業(yè)生產(chǎn)步驟，對(duì)解決鐵皮石斛資源短缺問(wèn)題具有重大意義。
本發(fā)明的技術(shù)方案是：
一種適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：鹽酸硫胺素0.02-0.08mg/L，麥芽糖15-22g/L，活性炭0.04-0.08g/L，氯化鎂5-10mM，谷胱甘肽13-21μg/L，水楊酸15-25mg/L，腺嘌呤1-3mg/L，玉米素3-7mg/L，葛根素32-45μg/L，苯丙氨酸60-70mg/L和硫酸銨0.5-1.2μM。
一種適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，優(yōu)選的方案是，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：鹽酸硫胺素0.05mg/L，麥芽糖18g/L，活性炭0.06g/L，氯化鎂7mM，谷胱甘肽17μg/L，水楊酸22mg/L，腺嘌呤2mg/L，玉米素4mg/L，葛根素36μg/L，苯丙氨酸64mg/L和硫酸銨0.8μM。
優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為White培養(yǎng)基或B5培養(yǎng)基。
另外，本發(fā)明還提供了所述適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基的制備方法，步驟如下：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入鹽酸硫胺素、谷胱甘肽、腺嘌呤、玉米素和葛根素，攪拌20-30分鐘，加入麥芽糖、活性炭、氯化鎂、水楊酸、苯丙氨酸和硫酸銨，繼續(xù)攪拌15-21分鐘，得混合物；
S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至5.7-6.1，滅菌溫度為115-120℃，滅菌時(shí)間為30分鐘，即得。
優(yōu)選地，所述步驟S1攪拌26分鐘。
優(yōu)選地，所述步驟S1繼續(xù)攪拌17分鐘。
優(yōu)選地，所述步驟S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至5.9。
優(yōu)選地，所述步驟S2滅菌溫度為118℃。
本發(fā)明所用主要原料的作用：
鹽酸硫胺素：鹽酸硫胺素又稱維生素B1鹽酸鹽、3-[(4-氨基-2-甲基吡啶-5-基)甲基]-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑氯化鎓合單鹽酸。白色至淺黃色單斜晶系片狀結(jié)晶(α型)，或斜方晶系針狀結(jié)晶(β型)。相對(duì)分子質(zhì)量337.28。無(wú)嗅或有米糠氣味，有苦味，分解溫度248℃。不溶于乙醚、乙烷、氯仿和苯，溶于水、丙二醇、95％乙醇、100％乙醇。有一定的吸濕性，曝露在濕空氣中，可吸收一定量的水，而成為水合物。用途：用作營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑。
活性炭：活性炭可以降低組織培養(yǎng)物的有害代謝物濃度，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有利。活性炭為木炭粉碎經(jīng)加工形成的粉末結(jié)構(gòu)，它結(jié)構(gòu)疏松，孔隙大，吸水力強(qiáng)，有很強(qiáng)的吸附作用，它的顆粒大小決定著吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時(shí)產(chǎn)生的5-羥甲基糖醛及激素等。
谷胱甘肽：谷胱甘肽(分子式C10H17O6N3S)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結(jié)合，含有巰基的的三肽，具有抗氧化作用和解毒作用。谷胱甘肽在生命體內(nèi)的作用機(jī)理和四大生理功能：1、清除人體細(xì)胞內(nèi)的自由基，是細(xì)胞內(nèi)最主要的抗氧化劑。2、與人體內(nèi)的有毒物質(zhì)結(jié)合并排出體外，是人體內(nèi)重要的解毒劑。3、激活和保護(hù)免疫細(xì)胞，增強(qiáng)人體免疫功能，是重要的免疫增強(qiáng)劑。4、影響皮膚細(xì)胞酪氨酸酶活性、抑制黑色素生成，防止皮膚色斑的產(chǎn)生。
腺嘌呤：腺嘌呤分子式：C5H5N5，分子量：135.127，其性狀為：白色針狀結(jié)晶。220℃開(kāi)始升華，360-365℃分解。溶于酸和堿，微溶于醇，不溶于醚及氯仿。主要用于參加DNA和RNA的合成，用于放射治療、苯中毒和抗腫瘤等引起的白細(xì)胞減少癥，用于急性粒細(xì)胞減少癥，醫(yī)藥及生化研究。
玉米素：中文名：6-反式-4-羥基-3-甲基-丁-2-烯基氨基嘌呤。CAS號(hào)：1637-39-4，分子式：C10H13N5O，分子量：219.24。玉米素是白色結(jié)晶或粉末，溶于水，溶于醇和DMF。玉米素是一種天然的細(xì)胞分裂素。它是從甜玉米灌漿期的籽粒中提取并結(jié)晶出的第1個(gè)天然細(xì)胞分裂素。
葛根素：葛根素存在于豆科植物野葛的根中。CAS號(hào)：3681-99-0。分子式：C21H20O9，分子量：416.38。藥理作用：具有提高免疫，增強(qiáng)心肌收縮力，保護(hù)心肌細(xì)胞，降低血壓，抗血小板聚集等作用。
本發(fā)明提供的適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，添加的添加劑包括鹽酸硫胺素、麥芽糖、活性炭、氯化鎂和葛根素等。在本發(fā)明的各種培養(yǎng)基的成分中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基能夠提供鐵皮石斛細(xì)胞的生存和最低的生理活動(dòng)。在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的鹽酸硫胺素，是所有細(xì)胞和組織必需的基本維生素，在培養(yǎng)基中加入鹽酸硫胺素，有利于鐵皮石斛的發(fā)育。在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的谷胱甘肽，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖，避免過(guò)氧化物對(duì)鐵皮石斛細(xì)胞的損害。在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的腺嘌呤，對(duì)鐵皮石斛細(xì)胞的分裂起促進(jìn)作用。在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的玉米素，能夠促進(jìn)鐵皮石斛細(xì)胞的分裂，促進(jìn)芽的分化，促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)大，促進(jìn)側(cè)芽發(fā)育，消除頂端優(yōu)勢(shì)，延緩葉片衰老，打破種子休眠。在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的活性炭，能夠吸附鐵皮石斛細(xì)胞生長(zhǎng)中代謝的有毒物質(zhì)，但是，活性炭在吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)的同時(shí)，也能吸附生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和其它培養(yǎng)基中的成分，發(fā)明人在使用活性炭時(shí)，考慮到活性炭的兩面性，經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)，得到合適的活性炭與培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的配比，使其都能更好的發(fā)揮作用。發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用葛根素，能夠與其它物質(zhì)相互作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖。本發(fā)明適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基搭配合理，各成分間協(xié)同作用，能提供鐵皮石斛細(xì)胞生長(zhǎng)增殖所需的充足營(yíng)養(yǎng)與良好環(huán)境，促進(jìn)鐵皮石斛細(xì)胞的增殖。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基具有以下優(yōu)勢(shì)：
(1)本發(fā)明提供的適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基能夠?qū)崿F(xiàn)鐵皮石斛的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，能夠使細(xì)胞培養(yǎng)和育苗實(shí)現(xiàn)規(guī)?；S生產(chǎn)。
(2)本發(fā)明提供的適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可明顯縮短鐵皮石斛的生長(zhǎng)繁殖周期，更宜于后期的有效成分提取等工業(yè)生產(chǎn)步驟，對(duì)解決鐵皮石斛資源短缺問(wèn)題具有重大意義。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)具體實(shí)施方式的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明White培養(yǎng)基可購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；B5培養(yǎng)基可購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；葛根素可購(gòu)自南京廣潤(rùn)生物制品有限公司。
實(shí)施例1、一種適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基
所述適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：鹽酸硫胺素0.02mg/L，麥芽糖15g/L，活性炭0.04g/L，氯化鎂5mM，谷胱甘肽13μg/L，水楊酸15mg/L，腺嘌呤1mg/L，玉米素3mg/L，葛根素32μg/L，苯丙氨酸60mg/L和硫酸銨0.5μM。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為White培養(yǎng)基。
制備方法：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入鹽酸硫胺素、谷胱甘肽、腺嘌呤、玉米素和葛根素，攪拌20分鐘，加入麥芽糖、活性炭、氯化鎂、水楊酸、苯丙氨酸和硫酸銨，繼續(xù)攪拌15分鐘，得混合物；
S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至5.7，115℃滅菌溫度為，滅菌時(shí)間為30分鐘，即得。
實(shí)施例2、一種適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基
所述適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：鹽酸硫胺素0.08mg/L，麥芽糖22g/L，活性炭0.08g/L，氯化鎂10mM，谷胱甘肽21μg/L，水楊酸25mg/L，腺嘌呤3mg/L，玉米素7mg/L，葛根素45μg/L，苯丙氨酸70mg/L和硫酸銨1.2μM。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基。
制備方法：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入鹽酸硫胺素、谷胱甘肽、腺嘌呤、玉米素和葛根素，攪拌30分鐘，加入麥芽糖、活性炭、氯化鎂、水楊酸、苯丙氨酸和硫酸銨，繼續(xù)攪拌21分鐘，得混合物；
S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至6.1，120℃滅菌溫度為，滅菌時(shí)間為30分鐘，即得。
實(shí)施例3、一種適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基
所述適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：鹽酸硫胺素0.05mg/L，麥芽糖18g/L，活性炭0.06g/L，氯化鎂7mM，谷胱甘肽17μg/L，水楊酸22mg/L，腺嘌呤2mg/L，玉米素4mg/L，葛根素36μg/L，苯丙氨酸64mg/L和硫酸銨0.8μM。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基。
制備方法：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入鹽酸硫胺素、谷胱甘肽、腺嘌呤、玉米素和葛根素，攪拌26分鐘，加入麥芽糖、活性炭、氯化鎂、水楊酸、苯丙氨酸和硫酸銨，繼續(xù)攪拌17分鐘，得混合物；
S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至5.9，118℃滅菌溫度為，滅菌時(shí)間為30分鐘，即得。
對(duì)比例1、一種適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基
所述適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：鹽酸硫胺素0.05mg/L，麥芽糖18g/L，活性炭0.06g/L，氯化鎂7mM，谷胱甘肽17μg/L，水楊酸22mg/L，腺嘌呤2mg/L，玉米素4mg/L，槲皮素36μg/L，苯丙氨酸64mg/L和硫酸銨0.8μM。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基。
制備方法與實(shí)施例3類似。
與實(shí)施例3的區(qū)別在于，將葛根素替換為槲皮素。
對(duì)比例2、一種適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基
所述適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：鹽酸硫胺素0.05mg/L，麥芽糖18g/L，活性炭0.032g/L，氯化鎂7mM，谷胱甘肽17μg/L，水楊酸22mg/L，腺嘌呤2mg/L，玉米素0.032g/L，葛根素36μg/L，苯丙氨酸64mg/L和硫酸銨0.8μM。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基。
制備方法與實(shí)施例3類似。
與實(shí)施例3的區(qū)別在于，將活性炭和玉米素的終濃度均調(diào)整為0.032g/L。
試驗(yàn)例一、本發(fā)明適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛細(xì)胞的培養(yǎng)效果
1、試驗(yàn)對(duì)象：本發(fā)明實(shí)施例1-3所得適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，以及對(duì)比例1和對(duì)比例2所得適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。
2、試驗(yàn)方法：
用移液器移取3mL鐵皮石斛單細(xì)胞懸浮液，分別注入實(shí)施例1-3所得適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，以及對(duì)比例1和對(duì)比例2所得適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，將已接種的三角瓶置于25℃，150r/min的恒溫?fù)u床中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)。不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛細(xì)胞的細(xì)胞增殖結(jié)果如表1所示。
表1：不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛細(xì)胞的細(xì)胞增殖結(jié)果
由表1可以看出，在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，生長(zhǎng)在本發(fā)明實(shí)施例1-3所得適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中鐵皮石斛細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，明顯大于生長(zhǎng)在對(duì)比例1和對(duì)比例2所得適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中鐵皮石斛細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)。這說(shuō)明，本發(fā)明適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以明顯促進(jìn)鐵皮石斛細(xì)胞的增殖，本發(fā)明適用于鐵皮石斛細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基的擴(kuò)增效果好。