本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種霍山石斛的育種方法。

背景技術(shù)：

中藥石斛目前主要為藥用石斛栽培品的新鮮或干燥莖，常見商品有霍山米斛、金釵楓斗、鐵皮楓斗和銅皮楓斗等。石斛性甘，微寒，歸胃、腎經(jīng)，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，主治熱病津傷、胃陰不足、病后虛熱不退、骨蒸癆熱、筋骨痿軟等癥。

米斛，又稱：霍山石斛，學(xué)名：Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng，為蘭科多年生附生草本植物，形曲不直，似蚱蜢髀，是米斛中的極品，為霍山縣獨(dú)有，擁有原產(chǎn)地地理保護(hù)標(biāo)志和瀕臨滅絕的國家級珍惜名貴中藥材，是國家野生中藥材二級保護(hù)品種，有“植物大熊貓”之稱，《本草綱目》記載：米斛生于懸崖峭壁之間、性微寒，有養(yǎng)胃生津、滋陰除熱、補(bǔ)腎益精、明目之功效。以之代茶可開胃健脾，霍山米斛具有益精填髓、補(bǔ)五臟內(nèi)絕不足，平胃氣、長肌肉、益智除煩、清虛熱、輕身延年之功效，清趙學(xué)敏、趙學(xué)凱《本草綱目拾遺》《百草經(jīng)》語曰：米斛近時(shí)有一種形短祗寸許細(xì)如燈芯，色青黃、嚼之味甘，微有滑涎。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種霍山石斛的育種方法，采用米斛的種子和培養(yǎng)基進(jìn)行種子的繁殖培育，種子通過吸收培植基提供的養(yǎng)料，能夠快速萌發(fā)，長成具有莖和葉的種苗。本發(fā)明提高了種子的發(fā)芽率，同時(shí)解決了野外的種植環(huán)境因素制約，如受氣候影響較大，且病蟲害嚴(yán)重且難以防治的問題，保護(hù)了米斛的繁殖。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種霍山石斛的育種方法，包括如下步驟：

S1、將成熟后的米斛種子采收、曬干后置于浸種劑消毒浸泡20～40min，所述浸種劑由以下重量份的原料制備而成：

0.1-0.3份MnSO₄粉末、0.05-0.15份CuSO₄粉末、0.1-0.3份ZnSO₄粉末、0.2-0.4份NiSO₄粉末、0.2-0.5份(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O粉末、10～20份EM原露100倍稀釋液；

S2、將消毒浸種完成后的種子播種于自制培養(yǎng)基中培養(yǎng)15-20天，經(jīng)過種胚膨大、萌發(fā)形成綠色圓球莖；培養(yǎng)條件為：每日光照10-15小時(shí)，光照度1000-3000lx，溫度為20-27℃，空氣濕度為80-90％；

S3、搭建由若干10×10cm的育苗槽構(gòu)成的育苗床，并在每個育苗槽內(nèi)填充加蕨根發(fā)酵粉的自制培養(yǎng)基，將圓球莖轉(zhuǎn)入加蕨根發(fā)酵粉的自制培養(yǎng)基中培養(yǎng)23-28天，使得圓球莖堆積在培養(yǎng)基中，并出現(xiàn)葉原基和分化苗；培養(yǎng)條件：溫度20-25℃，光照度1100-1900lx，光照時(shí)間為13-14h/d；

S4、將圓球莖分化苗用清水沖洗后轉(zhuǎn)入改良1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-30天，經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生葉原基；

S5、將步驟S4中產(chǎn)生的小苗轉(zhuǎn)入改良MS培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗，經(jīng)過60-70天壯苗培養(yǎng)，高度達(dá)到1.5-2.5cm的幼苗出現(xiàn)，培養(yǎng)條件：溫度25-26℃，光照度1700-2100lx，光照時(shí)間為13-14h/d；

S6、將步驟S5得到的幼苗轉(zhuǎn)入加花寶1號和2號的改良培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)生根；

S7、將步驟S6得到的生根苗進(jìn)行煉苗馴化。

優(yōu)選地，所述自制培養(yǎng)基通過以下步驟制備所得：

步驟一、取苔蘚泥炭土36-48份、浮萍超微粉8-10份、樹皮塊18-22份、硝酸鉀0.5-0.9份、碳酸鈣纖維2-3份、蔗糖1-2份、磷酸二氫鉀0.5-1.5份、硼酸0.2-0.4份、醋糟8-12份、豆餅粉8-12份分別進(jìn)行粉碎后混合攪拌均勻，加水，使其含水量達(dá)60％-70％，攪拌20-40分鐘，pH控制在7.0-7.5，其顆粒大小在5mm以下，顆粒粗細(xì)度均勻；

步驟二、將拌勻后的原料堆積發(fā)酵，做成高1.1-1.3米、底寬1.3-1.7米、長度不限的梯形堆，在其上打一些通氣孔，發(fā)酵9-10天，發(fā)酵結(jié)束后再加入適量的水，拌勻，調(diào)節(jié)含水量在60-70％之間；

步驟三、常壓下先將溫度升至110-115℃，保溫20-25min；然后將溫度上升至120-125℃，保溫60-70min；再將溫度升至130-145℃，在壓力為0.13-0.14MPa的情況下保溫60-70min，最后再悶置30-35min，停止加熱，讓其自然冷卻到25℃以下，得自制培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，所述加蕨根發(fā)酵粉的自制培養(yǎng)基由以下重量份的原料制備而成：

苔蘚泥炭土36-48份、浮萍超微粉8-10份、樹皮塊18-22份、硝酸鉀0.5-0.9份、碳酸鈣纖維2-3份、蔗糖1-2份、磷酸二氫鉀0.5-1.5份、硼酸0.2-0.4份、醋糟8-12份、豆餅粉8-12份、蕨根發(fā)酵粉為10-20份。

優(yōu)選地，所述步驟S4中的改良1/2MS培養(yǎng)基的配方為硝酸鉀19000mg/L、硝酸銨16500mg/L、磷酸二氫鉀1700mg/L、氨基酸螯合鎂3700mg/L、碘酸鈣4400mg/L、碘化鉀166mg/L、硼酸1240mg/L、硫酸錳2230mg/L、硫酸鋅860mg/L、鉬酸鈉50mg/L、硫酸銅5mg/L、三氯化六氨合鈷5mg/L、硫酸亞鐵2780mg/L、乙二胺四乙酸二鈉3730mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、鹽酸硫胺素100mg/L、鹽酸吡哆醇100mg/L、煙酸100mg/L、蕨根發(fā)酵粉15g/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.5-8g/L。

優(yōu)選地，所述步驟S5中的改良MS培養(yǎng)基的配方為：硝酸鉀38000mg/L、硝酸銨33000mg/L、磷酸二氫鉀3400mg/L、氨基酸螯合鎂7400mg/L、碘酸鈣8800mg/L、碘化鉀166mg/L、硼酸1240mg/L、硫酸錳4460mg/L、硫酸鋅1720mg/L、鉬酸鈉50mg/L、硫酸銅5mg/L、三氯化六氨合鈷5mg/L、硫酸亞鐵5560mg/L、乙二胺四乙酸二鈉7460mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、鹽酸硫胺素100mg/L、鹽酸吡哆醇100mg/L、煙酸100mg/L、NAA6ml/L、蕨根發(fā)酵粉15g/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.5-8g/L。

優(yōu)選地，所述步驟S6中的加花寶1號和2號的改良培養(yǎng)基的配方為：花寶1號2000mg/L、花寶2號2000mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、鹽酸硫胺素100mg/L、鹽酸吡哆醇100mg/L、煙酸100mg/L、碘酵母100g/L、NAA5ml/L、IBA5ml/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.5-8g/L。

優(yōu)選地，所述蕨根發(fā)酵粉通過以下步驟制備所得：

將洗凈后的蕨根瀝干，置于汽爆罐內(nèi)，先通入氮?dú)庵疗迌?nèi)壓力為0.7-1.5MPa，爆破處理7-23min；然后迅速通入蒸汽至汽爆罐內(nèi)壓力為1.5-2.1MPa，蒸汽爆破處理0.8-2.8min后，按照接種量1.5-1.7％的比例接種微生物發(fā)酵劑，保持溫度25-35℃，發(fā)酵48-54小時(shí)后，高溫滅菌，冷凍干燥，得蕨根發(fā)酵粉。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明通過優(yōu)化和改進(jìn)各個步驟的培養(yǎng)基對霍山石斛組織培養(yǎng)，可促進(jìn)種子萌發(fā)并縮短萌發(fā)時(shí)間，為種子萌發(fā)提供充足的營養(yǎng)，霍山石斛萌發(fā)率高，且萌發(fā)時(shí)間短，加快了苗的生長速率，減少時(shí)間消耗，降低成本，且提高了所得霍山石斛的品質(zhì)。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種霍山石斛的育種方法，包括如下步驟：

S1、將成熟后的米斛種子采收、曬干后置于浸種劑消毒浸泡20～40min，所述浸種劑由以下重量份的原料制備而成：

0.1-0.3份MnSO₄粉末、0.05-0.15份CuSO₄粉末、0.1-0.3份ZnSO₄粉末、0.2-0.4份NiSO₄粉末、0.2-0.5份(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O粉末、10～20份EM原露100倍稀釋液；

S2、將消毒浸種完成后的種子播種于自制培養(yǎng)基中培養(yǎng)15-20天，經(jīng)過種胚膨大、萌發(fā)形成綠色圓球莖；培養(yǎng)條件為：每日光照10-15小時(shí)，光照度1000-3000lx，溫度為20-27℃，空氣濕度為80-90％；

S3、搭建由若干10×10cm的育苗槽構(gòu)成的育苗床，并在每個育苗槽內(nèi)填充加蕨根發(fā)酵粉的自制培養(yǎng)基，將圓球莖轉(zhuǎn)入加蕨根發(fā)酵粉的自制培養(yǎng)基中培養(yǎng)23-28天，使得圓球莖堆積在培養(yǎng)基中，并出現(xiàn)葉原基和分化苗；培養(yǎng)條件：溫度20-25℃，光照度1100-1900lx，光照時(shí)間為13-14h/d；

S4、將圓球莖分化苗用清水沖洗后轉(zhuǎn)入改良1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-30天，經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生葉原基；

S5、將步驟S4中產(chǎn)生的小苗轉(zhuǎn)入改良MS培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗，經(jīng)過60-70天壯苗培養(yǎng)，高度達(dá)到1.5-2.5cm的幼苗出現(xiàn)，培養(yǎng)條件：溫度25-26℃，光照度1700-2100lx，光照時(shí)間為13-14h/d；

S6、將步驟S5得到的幼苗轉(zhuǎn)入加花寶1號和2號的改良培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)生根；

S7、將步驟S6得到的生根苗進(jìn)行煉苗馴化。

所述自制培養(yǎng)基通過以下步驟制備所得：

步驟一、取苔蘚泥炭土36-48份、浮萍超微粉8-10份、樹皮塊18-22份、硝酸鉀0.5-0.9份、碳酸鈣纖維2-3份、蔗糖1-2份、磷酸二氫鉀0.5-1.5份、硼酸0.2-0.4份、醋糟8-12份、豆餅粉8-12份分別進(jìn)行粉碎后混合攪拌均勻，加水，使其含水量達(dá)60％-70％，攪拌20-40分鐘，pH控制在7.0-7.5，其顆粒大小在5mm以下，顆粒粗細(xì)度均勻；

步驟二、將拌勻后的原料堆積發(fā)酵，做成高1.1-1.3米、底寬1.3-1.7米、長度不限的梯形堆，在其上打一些通氣孔，發(fā)酵9-10天，發(fā)酵結(jié)束后再加入適量的水，拌勻，調(diào)節(jié)含水量在60-70％之間；

步驟三、常壓下先將溫度升至110-115℃，保溫20-25min；然后將溫度上升至120-125℃，保溫60-70min；再將溫度升至130-145℃，在壓力為0.13-0.14MPa的情況下保溫60-70min，最后再悶置30-35min，停止加熱，讓其自然冷卻到25℃以下，得自制培養(yǎng)基。

所述加蕨根發(fā)酵粉的自制培養(yǎng)基由以下重量份的原料制備而成：

苔蘚泥炭土36-48份、浮萍超微粉8-10份、樹皮塊18-22份、硝酸鉀0.5-0.9份、碳酸鈣纖維2-3份、蔗糖1-2份、磷酸二氫鉀0.5-1.5份、硼酸0.2-0.4份、醋糟8-12份、豆餅粉8-12份、蕨根發(fā)酵粉為10-20份。

所述步驟S4中的改良1/2MS培養(yǎng)基的配方為硝酸鉀19000mg/L、硝酸銨16500mg/L、磷酸二氫鉀1700mg/L、氨基酸螯合鎂3700mg/L、碘酸鈣4400mg/L、碘化鉀166mg/L、硼酸1240mg/L、硫酸錳2230mg/L、硫酸鋅860mg/L、鉬酸鈉50mg/L、硫酸銅5mg/L、三氯化六氨合鈷5mg/L、硫酸亞鐵2780mg/L、乙二胺四乙酸二鈉3730mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、鹽酸硫胺素100mg/L、鹽酸吡哆醇100mg/L、煙酸100mg/L、蕨根發(fā)酵粉15g/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.5-8g/L。

所述步驟S5中的改良MS培養(yǎng)基的配方為：硝酸鉀38000mg/L、硝酸銨33000mg/L、磷酸二氫鉀3400mg/L、氨基酸螯合鎂7400mg/L、碘酸鈣8800mg/L、碘化鉀166mg/L、硼酸1240mg/L、硫酸錳4460mg/L、硫酸鋅1720mg/L、鉬酸鈉50mg/L、硫酸銅5mg/L、三氯化六氨合鈷5mg/L、硫酸亞鐵5560mg/L、乙二胺四乙酸二鈉7460mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、鹽酸硫胺素100mg/L、鹽酸吡哆醇100mg/L、煙酸100mg/L、NAA6ml/L、蕨根發(fā)酵粉15g/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.5-8g/L。

所述步驟S6中的加花寶1號和2號的改良培養(yǎng)基的配方為：花寶1號2000mg/L、花寶2號2000mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、鹽酸硫胺素100mg/L、鹽酸吡哆醇100mg/L、煙酸100mg/L、碘酵母100g/L、NAA5ml/L、IBA5ml/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.5-8g/L。

所述蕨根發(fā)酵粉通過以下步驟制備所得：

將洗凈后的蕨根瀝干，置于汽爆罐內(nèi)，先通入氮?dú)庵疗迌?nèi)壓力為0.7-1.5MPa，爆破處理7-23min；然后迅速通入蒸汽至汽爆罐內(nèi)壓力為1.5-2.1MPa，蒸汽爆破處理0.8-2.8min后，按照接種量1.5-1.7％的比例接種微生物發(fā)酵劑，保持溫度25-35℃，發(fā)酵48-54小時(shí)后，高溫滅菌，冷凍干燥，得蕨根發(fā)酵粉。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。