一種霍山石斛的快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種霍山石斛的組培方法，尤其涉及一種霍山石斛的組織培養(yǎng)快繁方法。
【背景技術(shù)】
[0002]霍山石斛為蘭科多年生附生草本植物。形曲不直，似蚱蜢髀，是石斛中的極品。為我縣獨有，擁有原產(chǎn)地地理保護標(biāo)志和瀕臨滅絕的國家級珍惜名貴中藥材，是國家野生中藥材二級保護品種，有“植物大熊貓”之稱?！侗静菥V目》記載:石斛生于懸崖峭壁之間、性微寒，有養(yǎng)胃生津、滋陰除熱、補腎益精、明目之功效。以之代茶可開胃健脾。霍山石斛具有益精填髓、補五臟內(nèi)絕不足，平胃氣、長肌肉、益智除煩、清虛熱、輕身延年之功效。經(jīng)中國科技大學(xué)和中山醫(yī)科大學(xué)研究證明:霍山石斛具有增強T細胞B細胞WK細胞和巨噬細胞的作用。對抑制腫瘤和降血糖有非常好的療效?？纱龠M血液循環(huán)，增強心臟功能，促進胃腸蠕動增強消化功能。顯著提高人體的sop (超氧岐化酶)水平。降低LPO (過氧化脂質(zhì))，起到顯著的抗衰老作用。藥用石斛有50種之多，品質(zhì)最佳的是霍山石斛，為石斛中的珍品，野生石斛與黃金等價。
[0003]石斛種子極為細小，胚胎發(fā)育不完全，缺乏胚乳組織，萌發(fā)率極低(不足5%)，且自然條件下必須與蘭菌共生才能萌發(fā)。因此無法在大田或苗床上播種，很難生產(chǎn)足夠的實生苗用于栽培?；羯绞鷮ιL環(huán)境要求苛刻。傳統(tǒng)人工繁殖方式如分株，扦插等，繁殖速度慢，增值率低。霍山石斛具有極高的藥用價值和經(jīng)濟價值，長期依賴采挖野生資源來滿足市場需求，目前霍山石斛野生資源極其稀少，已被列入國家重點保護藥用植物。
[0004]所以現(xiàn)在利用組培快繁技術(shù)試管苗，不僅是解決霍山石斛野生資源緊缺的有效方法，也對該物種的種質(zhì)資源保護起到積極作用。雖然近年針對霍山石斛組培快繁的組培技術(shù)得到長足的發(fā)展，但無外乎是MS基本培養(yǎng)基再添加一些生物激素這種常規(guī)的方法，存在誘導(dǎo)發(fā)芽率低，根系不發(fā)達，莖偏西，出瓶后種植存活率低等問題。本發(fā)明就是在長期實踐過程中對原有配方進行改進，對快繁技術(shù)中一些元素的量尤其是N元素的量進行調(diào)整，大大提高了霍山石斛組培苗的質(zhì)量，從而提高了種植存活率，保證了霍山石斛的原種性，為霍山石斛建立穩(wěn)定的組培快繁體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種霍山石斛的快繁方法，它在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上對配方進行改進，培養(yǎng)出質(zhì)量更好，存活率更高的霍山石斛種苗。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種霍山石斛的快繁方法，包括以下步驟:
(1)采集石斛蒴果種子，不同種齡的種子萌發(fā)率不一樣，種齡越長，萌發(fā)率越高，最好選擇4-6月種齡的種子，必須注意要是未開裂的蒴果，種胚的顏色最好是黃色或白色；
(2)種子消毒:剪下選好的同一成熟度鐵皮石斛蒴果，先用洗衣粉液浸泡1min后用自來水反復(fù)沖洗6次，再在超凈工作臺的無菌條件下，將經(jīng)過預(yù)處理的蒴果用75%的酒精溶液滅菌30s，然后用1%的升汞水處理8-10min，最后用無菌水反復(fù)沖洗6次,放在消毒好的無菌濾紙上吸干果實表面水分；
(3)在無菌條件下將處理好的果莢用滅菌好的刀片切開一小口，用鑷子將粉末狀的種粒播于準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基A中，在無光照條件下培養(yǎng)30天，再放置到有光照組培室條件下培養(yǎng)45天，保持組培室溫度在25 °C ；
(4)原球莖的增值及分化培養(yǎng):將萌發(fā)的種子均勻播撒在培養(yǎng)基B中，培養(yǎng)60天，直至萌發(fā)的種子全部分化成Icm的幼芽；
(5)生根壯苗培養(yǎng)；采用的生根壯苗培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)基C，將分化成幼芽的石斛幼苗一株株的接種到培養(yǎng)基C中，培養(yǎng)90至120天，幼苗會長粗變長，每株會長出3到4根根系，即成生命力強，生長健壯的石斛組培苗。
[0007]上述的A培養(yǎng)基是霍山石斛種子的萌發(fā)培養(yǎng)，A培養(yǎng)基的兀素組成為=KNO32.5g/L、CaCl2.2H20 0.44g/L、MgSO4.7H20 0.37g/L、KH2PO4 0.2 g/L、NH4NO3 1.5g/L、KI 0.00083 g/L、H3BO3 0.0062g/L、MnSO4.4H20 0.0223g/L、ZnSO4.7H20 0.008g/L、Na2MoO4.2H20 0.00025 g/L、CuSO4.5H20 0.000025 g/L、CoCl2.6H20 0.000025 g/L、FeSO4.7H20 0.0278 g/L、Na2-EDTA.2H20 0.0373 g/L、肌醇 0.1 g/L、IV B 0.0005 g/L、維生素 B6 0.0005 g/L、維生素 BI 0.0001 g/L、甘氨酸 0.002 g/L,AC 0.5g/L、NAA 0.5mg/L0
[0008]上述的B培養(yǎng)基是種子萌發(fā)后的原球莖增值及分化培養(yǎng)，B培養(yǎng)基的元素組成為:(NH4)2SO4 0.134g/L、KN03 2.5g/L、CaCl2.2H20 0.15g/L、MgSO4.7H20 0.25g/L、NaH2PO40.15 g/L、KI 0.00075 g/L、H3BO3 0.003g/L、MnSO4.4H20 0.01g/L、ZnSO4.7H20 0.002g/L、Na2MoO4.2H20 0.00025 g/L、CuSO4.5H20 0.000025 g/L、CoCl2.6H20 0.000025 g/L、FeSO4.7H20 0.0278g/L、Na2-EDTA.2H20 0.0373 g/L、肌醇 0.1 g/L, IV B 0.001g/L、維生素 B6 0.001 g/L、維生素 B1.01 g/L、AC 0.5g/L、NAA 0.3mg/L、KTl mg/L。
[0009]上述的C培養(yǎng)基是石斛種苗的生根壯苗培養(yǎng)，C培養(yǎng)基的元素組成為:(NH4)2SO40.134g/L、KN03 2.5g/L、CaCl2.2H20 0.15g/L、MgSO4.7H20 0.25g/L, NaH2PO4 0.15 g/L、KI0.00075 g/L、H3BO3 0.003g/L、MnSO4.4H20 0.01 g/L, ZnSO4.7H20 0.002g/L、Na2MoO4.2H200.00025 g/L、CuSO4.5H20 0.000025 g/L、CoCl2.6H20 0.000025 g/L、FeSO4.7H20 0.0278g/L、Na2-EDTA.2H20 0.0373 g/L、肌醇 0.1 g/L, IV B 0.001g/L、維生素 B6 0.001 g/L、維生素 BI 0.01 g/L、AC 0.5g/L、NAA lmg/L、AC lg/L、N-P-Kl 號 0.8 g/L、6BA 1.5mg/L。
[0010]上述的每一步接種完成后將種苗放入組培室的架子上，將組培室的燈開啟，提供足夠的光照，光照時間為12小時/天，光照強度為20001X，培養(yǎng)室的溫度調(diào)控在25°C，濕度保持在70%_80%，以便種苗能夠正常生長，組培室要每天消毒，地板，組培架等。
[0011]上述的霍山石斛組培苗分級標(biāo)準(zhǔn):(I)合格組培苗標(biāo)準(zhǔn):根2-5條，4片葉，株高彡2.5cm,莖粗彡0.2cm ; (2)優(yōu)質(zhì)苗標(biāo)準(zhǔn):根3-5條，6片葉，株高彡5.0cm,莖粗彡0.3cm。
[0012]本發(fā)明的有益效果:
1、本發(fā)明通過改變種子萌發(fā)培養(yǎng)基(A培養(yǎng)基)中N和銨元素的含量，已經(jīng)通過碳素降低遏化，使種子萌發(fā)率較一般MS培養(yǎng)基提高40% ；
2、本發(fā)明通過原球莖增值及分化培養(yǎng)(B培養(yǎng)基)，可以使萌發(fā)的種子直接增值分化，無需分兩步培養(yǎng)(即增值培養(yǎng)和分化培養(yǎng))，而且添加KT和改變元素含量使增值分化率增高加快，大大縮短了組培石斛苗周期；
3、本發(fā)明通過生根壯苗培養(yǎng)(C培養(yǎng)基)，可以使每株的平均根數(shù)達到4根，石斛苗的粗壯度達到直徑4毫米，高度鐵皮在6至8公分，米斛在3公分左右，出瓶后可以直接種植，存活率高達98%以上。
【附圖說明】
[0013]圖1為種子萌發(fā)培養(yǎng)50天左右的照片，種子萌發(fā)，有小芽抽出；
圖2為原球莖的增值和分化培養(yǎng)，第二次轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)60天左右的照片；
圖3為生根壯苗培養(yǎng)，第三次轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)一個月左右的照片；
圖4為生根壯苗培養(yǎng)3個月左右的照片，此時苗已可出瓶，為成品幼苗。
【具體實施方式】
[0014]實施例
一種霍山石斛的快繁方法，包括以下步驟:
(1)采集石斛蒴果種子，不同種齡的種子萌發(fā)率不一樣，種齡越長，萌發(fā)率越高，最好選擇4-6月種齡的種子，必須注意要是未開裂的蒴果，種胚的顏色最好是黃色或白色；
(2)種子消毒:剪下選好的同一成熟度鐵皮石斛蒴果，先用洗衣粉液浸泡1min后用自來水反復(fù)沖洗6次，再在超凈工作臺的無菌條件下，將經(jīng)過預(yù)處理的蒴果用75%的酒精溶液滅菌30s，然后用1%的升汞水處理8-10min，最后用無菌水反復(fù)沖洗6次,放在消毒好的無菌濾紙上吸干果實表面水分；
(3)在無菌條件下將處理好的果莢用滅菌好的刀片切開一小口，用鑷子將粉末狀的種粒播于準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基A中，在無光照條件下培養(yǎng)30天，再放置到有光照組培室條件下培養(yǎng)45天，保持組培室溫度在25 °C ；
(4)原球莖的增值及分化培養(yǎng):將萌發(fā)的種子均勻播撒在培養(yǎng)基B中，培養(yǎng)60天，直至萌發(fā)的種子全部分化成Icm的幼芽；
(5)生根壯苗培養(yǎng)；采用的生根壯苗培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)基C，將分化成幼芽的石斛幼苗一株株的接種到培養(yǎng)基C中，培養(yǎng)90至120天，幼