本發(fā)明涉及微生物菌劑的生產(chǎn)方法，尤其是涉及一種煤礦區(qū)叢枝菌根真菌菌劑的擴(kuò)繁方法。

背景技術(shù)：

菌根(Mycorrhiza)是菌根真菌與植物根系形成的共生，自然界中93％以上的植物都能形成菌根。叢枝菌根真菌又稱(chēng)AM真菌(Arbuscular mycorrhiza Fungi，簡(jiǎn)稱(chēng)AMF)。前人研究認(rèn)為，AM真菌能夠促進(jìn)植物對(duì)礦質(zhì)養(yǎng)分尤其是磷和微量元素的吸收，增強(qiáng)植物抵抗養(yǎng)分脅迫的能力，減少氮、磷肥的使用量和流失，從而避免水體富營(yíng)養(yǎng)化。同時(shí)，其菌絲可以形成菌絲橋，在不同植株間傳遞養(yǎng)分，成為生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)的重要通道。AM真菌能夠提高植物的抗逆性：能改善植物的水分狀況，提高植物的抗旱能力；能提高植物抗鹽脅迫的能力；能夠提高植物抗有機(jī)污染能力；能提高植物的抗病能力；能提高植物對(duì)重金屬污染的抵御能力。

鑒于AM真菌在農(nóng)林業(yè)及植被恢復(fù)方面的有益作用，開(kāi)發(fā)叢枝菌根真菌“生物肥料”很有應(yīng)用前景，其首要解決的問(wèn)題就是實(shí)現(xiàn)AM真菌的高純度培養(yǎng)。目前較為理想的純培養(yǎng)的方法AM真菌菌劑的培養(yǎng)方法主要有盆栽培養(yǎng)法、玻璃珠分室法，玻璃珠分室培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)是能夠?qū)⑴囵B(yǎng)基質(zhì)與AM真菌分開(kāi)，獲得純凈的AM真菌菌體，但是其成本較高，生產(chǎn)技術(shù)不夠成熟，僅供科學(xué)研究和小規(guī)模接種劑的生產(chǎn)使用；活體宿主植物盆載培養(yǎng)法培養(yǎng)AM真菌的優(yōu)點(diǎn)是操作方便、簡(jiǎn)單可靠，缺點(diǎn)是培養(yǎng)周期長(zhǎng)、質(zhì)量不穩(wěn)定、繁殖體的產(chǎn)量少，但目前它仍是AM真菌菌劑培養(yǎng)的主要方法。結(jié)合叢枝菌根(AM)真菌純培養(yǎng)研究方法的最新研究成果，AM真菌單孢無(wú)菌的分室Ri-T-DNA轉(zhuǎn)型胡蘿卜根雙重離體培養(yǎng)法，將這種方法加以改進(jìn)，可獲得目前最為高效安全的AM真菌孢子菌劑的生產(chǎn)方法，但容器要求高，技術(shù)含量較高，僅供科學(xué)研究，然而，要實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的菌劑生產(chǎn)，需在大田(露天開(kāi)放)條件下擴(kuò)繁。

目前有關(guān)叢枝菌根擴(kuò)繁所公開(kāi)的專(zhuān)利技術(shù)內(nèi)容大多只涉及AM真菌廣譜性的培養(yǎng)方法(例如，研制特定的培養(yǎng)裝置、采用混合化的培養(yǎng)基質(zhì))和AM真菌在農(nóng)田生產(chǎn)中的應(yīng)用(例如，某一種AM真菌實(shí)現(xiàn)植物的高效定植、栽焙方注的改良等等)。

專(zhuān)利號(hào)為CN1511944A的“生產(chǎn)叢枝菌根真菌菌劑的萬(wàn)法”，主要涉及一種采用混合培養(yǎng)基質(zhì)，選擇多種宿主植物混播混作的方式來(lái)生產(chǎn)叢枝菌根真菌菌劑的方法，專(zhuān)利號(hào)為CN1548524A的“一種高效抗旱、耐高磷營(yíng)養(yǎng)叢植菌根真菌及其生產(chǎn)方法”，主要涉及一種選用高粱作為宿主植物，采用沸石、河沙混合物作為培養(yǎng)基質(zhì)來(lái)生產(chǎn)高效抗旱、耐高磷營(yíng)養(yǎng)的叢枝菌根真菌摩西球囊霉(Glomus mosseae)93-6菌株的生產(chǎn)方法；以及專(zhuān)利號(hào)為CN103329743的“一種提高玉米產(chǎn)量的方法”，主要涉及通過(guò)在隔溝灌溉條件下對(duì)玉米接種叢枝菌根真菌地表球囊霉(G1omus verszforme)菌劑，公開(kāi)了一種提高玉米產(chǎn)量的方法。專(zhuān)利號(hào)為CN1354252A的“以玻璃珠為培養(yǎng)基質(zhì)的從枝菌根真菌的培養(yǎng)”，主要涉及一種使用特定的培養(yǎng)裝置及培養(yǎng)介質(zhì)開(kāi)展叢枝菌根真菌的培養(yǎng)方法；專(zhuān)利號(hào)為CN104371932A.的“一種AM真菌菌劑的生產(chǎn)方法”，主要通過(guò)對(duì)摩西球囊霉、縮球囊霉、根內(nèi)球囊霉和地表球囊霉四種AM真菌的擴(kuò)繁，生產(chǎn)出高質(zhì)量的AM真菌菌劑，并通過(guò)自繁菌劑實(shí)現(xiàn)了構(gòu)祀的菌根化育苗，馬鈴薯和芹菜的大田接種，取得了很好效果。

利用上述方法常常需要購(gòu)買(mǎi)培養(yǎng)基質(zhì)，很難利用本地化易得的基質(zhì)進(jìn)行有效的擴(kuò)繁，對(duì)生態(tài)脆弱區(qū)應(yīng)用性不強(qiáng)，目前，尚沒(méi)有專(zhuān)一性、標(biāo)準(zhǔn)化的礦區(qū)本地化的擴(kuò)繁技術(shù)。截止2010年，我國(guó)煤礦開(kāi)采的破壞面積已達(dá)到全國(guó)露天采煤挖損土地總面積3萬(wàn)hm²以上；我國(guó)露天開(kāi)采大多使用外排土場(chǎng)方式，其壓占面積是挖損土地量的1.5—2.0倍，全國(guó)累計(jì)占用土地約5.6萬(wàn)hm²，因而迫切需要針對(duì)礦區(qū)建立其專(zhuān)用的AM真菌擴(kuò)繁技術(shù)和方法，為礦區(qū)土地復(fù)墾和生態(tài)恢復(fù)提供技術(shù)指導(dǎo)和奠定應(yīng)用基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

目前克服上述缺陷的良好方法，本發(fā)明采用不同基質(zhì)配比進(jìn)行盆載培養(yǎng)法，克服了現(xiàn)有方法周期長(zhǎng)、基質(zhì)不易獲取、成本高的缺陷，提供一種煤礦區(qū)叢枝菌根真菌菌劑的擴(kuò)繁方法，環(huán)境友好型易得基質(zhì)、菌劑體積小、質(zhì)量輕易運(yùn)儲(chǔ)、菌劑純度高，本發(fā)明的AM真菌的菌劑配方，尤其是為煤礦區(qū)優(yōu)質(zhì)AM菌劑的擴(kuò)繁提供技術(shù)指導(dǎo)。

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種AM真菌菌劑的制備方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟A：將AM真菌的宿主植物在施加了AM真菌的培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)后所述宿主植物的根系及培養(yǎng)基質(zhì)，即得到AM真菌菌劑；

所述培養(yǎng)基質(zhì)為如下1)或2)：

1)所示的培養(yǎng)基質(zhì)由沙土、蛭石和珍珠巖組成；

2)所示的培養(yǎng)基質(zhì)由沙土、蛭石、珍珠巖和風(fēng)化煤組成。

上述方法中，1)所示的培養(yǎng)基質(zhì)中，所述沙土、所述蛭石和所述珍珠巖的體積比為2-3:1:1；

2)所示的培養(yǎng)基質(zhì)中，所述沙土、所述蛭石、所述珍珠巖和所述風(fēng)化煤的體積比為1-2:1:1:1。

上述方法中，

所述收集培養(yǎng)后宿主植物的根系及培養(yǎng)基質(zhì)的時(shí)間為形成每克所述培養(yǎng)后宿主植物的根系及培養(yǎng)基質(zhì)的AM真菌孢子數(shù)量達(dá)到40-50個(gè)的量的時(shí)候；

或所述培養(yǎng)時(shí)間不少于3個(gè)月；

或所述培養(yǎng)時(shí)間為3-5個(gè)月。或所述培養(yǎng)時(shí)間為3個(gè)月。

上述方法中，所述方法中，在培養(yǎng)前還包括將所述宿主植物種子進(jìn)行催芽的步驟。

上述方法中，所述催芽的條件為28-30℃暗培養(yǎng)3天。

上述方法中，所述宿主植物為能與AM真菌共生的植物；

或，所述能與AM真菌共生的植物為玉米、高粱、苜蓿。

上述方法中，所述AM真菌為摩西管柄囊霉菌或根內(nèi)球囊霉菌。

上述方法中，所述摩西管柄囊霉菌對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基質(zhì)為所述2)所示的培養(yǎng)基質(zhì)；

所述根內(nèi)球囊霉菌對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基質(zhì)為所述1)所示的培養(yǎng)基質(zhì)。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種適用于煤礦區(qū)的基質(zhì)廉價(jià)易得、體積小、質(zhì)量輕、易運(yùn)儲(chǔ)、菌劑純度高的AM真菌菌劑擴(kuò)繁方法。

本發(fā)明提供的方法包括上述方法中的步驟A，實(shí)現(xiàn)AM真菌菌劑擴(kuò)繁。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明采用盆載培養(yǎng)法，克服了現(xiàn)有培養(yǎng)法周期長(zhǎng)、基質(zhì)不易獲取成本高的缺陷，本發(fā)明方法擴(kuò)繁的AM真菌菌劑具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1)環(huán)境友好型基質(zhì)：本發(fā)明采用的珍珠巖、蛭石廉價(jià)易得，與煤礦區(qū)有機(jī)質(zhì)高的風(fēng)化煤結(jié)合起來(lái)，體積小，易運(yùn)輸儲(chǔ)存；風(fēng)化煤、沙土等屬于煤礦區(qū)常見(jiàn)材料，變廢為寶，提高了資源利用率，符合節(jié)約資源的基本國(guó)策，用于大規(guī)模擴(kuò)繁的，尤其適用于煤礦區(qū)生態(tài)修復(fù)，也可廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)發(fā)展；

2)周期短、材料常見(jiàn)：本發(fā)明提供的AM真菌菌劑的生產(chǎn)方法，其包括基質(zhì)滅菌、玉米催芽、接種、苗期管理、菌劑質(zhì)量分析；通過(guò)對(duì)摩西管柄囊霉(Glomus mo sseae，簡(jiǎn)稱(chēng)Gm)、根內(nèi)球囊霉(Glomus intraradices,簡(jiǎn)寫(xiě)Gi)菌種的擴(kuò)繁，生產(chǎn)出的AM真菌菌劑侵染程度高，孢子量大。

3)侵染強(qiáng)度高

根內(nèi)球囊霉對(duì)玉米的菌根侵染強(qiáng)度均在72％以上，摩西管柄囊霉對(duì)玉米的菌根侵染強(qiáng)度均在91％以上，Gm、Gi在沙土2：蛭石1：珍珠巖1(Z配方)的組成基質(zhì)中對(duì)玉米的菌根侵染強(qiáng)度比以往研究純沙土(S配方)的分別提高了6.64％、15.51％，Gm、Gi在沙土1∶蛭石1∶珍珠巖1：風(fēng)化煤1(W配方)的基質(zhì)中對(duì)玉米的菌根侵染強(qiáng)度比以往研究純沙土(S配方)的分別提高了6.72％、8.19％。

4)菌劑質(zhì)量高

與純沙土的孢子密度相比，基質(zhì)W配方摩西管柄囊霉、根內(nèi)球囊霉對(duì)玉米的菌根侵染強(qiáng)度比以往研究純沙土S配方基質(zhì)的分別提高了32個(gè)/g、4個(gè)/g，基質(zhì)Z摩西管柄囊霉、根內(nèi)球囊霉對(duì)玉米的菌根侵染強(qiáng)度比以往研究純沙土S配方基質(zhì)的分別提高了20個(gè)/g、10個(gè)/g。

5)菌劑體積小、質(zhì)量輕易運(yùn)儲(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為侵染等級(jí)的確定。

圖2為沙土基質(zhì)玉米根系中摩西管柄囊霉的叢枝和泡囊結(jié)構(gòu)。

圖3為風(fēng)化煤基質(zhì)玉米根系中摩西管柄囊霉的叢枝和泡囊結(jié)構(gòu)。

圖4為接菌玉米根系中根內(nèi)球囊霉的泡囊結(jié)構(gòu)和孢子。

圖5為未接種的玉米根系。

圖6為室內(nèi)三種處理玉米培養(yǎng)2個(gè)半月后的生長(zhǎng)狀況，左圖為Z配方的不同接菌處理，右圖為W配方的不同接菌處理，可以看出，接菌明顯高于對(duì)照處理，且Gm-Z長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于Gi-Z、Gi-S，而Gi-W長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于Gm-W、Gi-S。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、AM真菌菌劑擴(kuò)繁的方法建立

一、AM真菌擴(kuò)繁的方法建立

AM真菌菌劑的擴(kuò)繁方法流程：基質(zhì)配比—玉米催芽—菌劑接種—苗期管理

1、培養(yǎng)基質(zhì)配比：將沙土、蛭石、珍珠巖過(guò)2mm篩后高壓蒸汽滅菌(121℃，1h)，用薄膜覆蓋晾曬3天干后晾曬備用；沙土、風(fēng)化煤過(guò)2mm篩，適量的1-2mm粒徑的蛭石、珍珠巖(本試驗(yàn)中沙土于北沙灘購(gòu)買(mǎi)，風(fēng)化煤采自?xún)?nèi)蒙煤礦區(qū)，蛭石、珍珠巖于購(gòu)買(mǎi)于基質(zhì)廠(chǎng))

根據(jù)如下配比混勻備用(括號(hào)內(nèi)為體積比)：

S配方＝＝純沙土；

Z配方＝沙土(2)∶蛭石(1)∶珍珠巖(1)；

W配方＝＝沙土(1)∶蛭石(1)∶珍珠巖(1)：風(fēng)化煤(1)。

2、宿主植物種子催芽

挑選籽粒飽滿(mǎn)、無(wú)破損、無(wú)蟲(chóng)咬的栽培用玉米種子和三葉草種子，分別先用體積百分含量為10％H₂O₂水溶液滅菌10min，再用無(wú)菌水沖洗5次，再置于濕潤(rùn)的培養(yǎng)皿中放置，在溫度為28℃恒溫培養(yǎng)箱中暗催芽3d，得到催芽后玉米種子和催芽后三葉草種子。

3、接種擴(kuò)繁

容器的消毒：75％的乙醇溶液擦拭18cm×24cm的塑料花盆。

接種：每個(gè)花盆中先分別填充2/3的上述1的3種培養(yǎng)基質(zhì)，采用條施法添加50g叢枝菌根真菌菌劑(用純沙土作為培養(yǎng)基質(zhì)，玉米為宿主植物，接種叢枝菌后培養(yǎng)100天，收集得到培養(yǎng)后宿主植物根系及其根際土得到的叢枝菌根真菌菌劑)，接著每盆分別撒3粒催芽后玉米種子或20-25粒催芽后三葉草種子，盆中用剩余基質(zhì)填充，澆水至最大持水量；培養(yǎng)。

S、Z、W配方澆水量分別為基質(zhì)體積的25％、50％和70％。

根據(jù)天氣情況、室溫高低、蒸發(fā)快慢稱(chēng)重或測(cè)定含水率對(duì)澆水量進(jìn)行調(diào)整，300-500ml為宜；溫度調(diào)控在22-30℃之間。視病蟲(chóng)害情況進(jìn)行適當(dāng)防治。

出苗4d后，每盆定植玉米1株或三葉草20株，配置Hoagland營(yíng)養(yǎng)液母液(見(jiàn)表1)；

幼苗期，出苗一周后澆一次1/10強(qiáng)度的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液；

成苗后(五葉后)，每周澆一次1/5強(qiáng)度營(yíng)養(yǎng)液；

收獲期(七葉后)，不再澆營(yíng)養(yǎng)液至少2個(gè)月以后，以上針對(duì)沙土培養(yǎng)基質(zhì)。

表1為Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配制

注：最右側(cè)一欄表示配制1L營(yíng)養(yǎng)液所需的母液ml

培養(yǎng)3個(gè)月后，收集培養(yǎng)后所述宿主植物的根系及培養(yǎng)基質(zhì)，即得到不同基質(zhì)獲得的AM真菌菌劑，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)繁。

圖2為沙土基質(zhì)玉米根系中摩西管柄囊霉的叢枝和泡囊結(jié)構(gòu)。圖3為風(fēng)化煤基質(zhì)玉米根系中摩西管柄囊霉的叢枝和泡囊結(jié)構(gòu)。圖4為接菌玉米根系中根內(nèi)球囊霉的泡囊結(jié)構(gòu)和孢子。

二、AM真菌菌劑質(zhì)量分析

采用Trayman Blue染色方法進(jìn)行AM真菌菌劑中AM真菌侵染狀況調(diào)查，用叢枝菌根真菌侵染性的評(píng)估方法(Trourelot.etc，1986)測(cè)定侵染強(qiáng)度，用濕篩傾析法測(cè)定AM真菌的孢子量，根據(jù)此進(jìn)行菌劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1、臺(tái)盼藍(lán)改良染色法測(cè)定侵染強(qiáng)度

1)臺(tái)盼藍(lán)改良染色法染色

將上述一獲得的AM真菌菌劑根系的毛細(xì)根，清洗后剪成l cm長(zhǎng)根段置于培養(yǎng)皿中，加入質(zhì)量百分含量10％KOH水溶液浸泡于90℃水浴鍋中水浴60min，冷卻后棄去堿液，用清水洗去3-5次；加入質(zhì)量百分含量2％HCl室溫下酸化5min后倒去酸液，加入0.05％由利苯藍(lán)染色液于90℃中水浴染色30min，棄去染液冷卻后，用1:1:1乳酸甘油水浸泡除去根樣多余的染料，使菌根的菌絲、泡囊和叢枝保持染色狀態(tài)，制片鏡檢。

2)計(jì)算侵染強(qiáng)度及侵染等級(jí)(Trouvelot A,1986)

a.將上述一獲得的AM真菌菌劑(宿主為玉米)和AM真菌菌劑(宿主為三葉草)中宿主植物根系的15個(gè)根段固定在1張載玻片上，30個(gè)染色后的植物須根根段制2個(gè)片子；

b.在顯微鏡下觀察這些根段，按照?qǐng)D1的分類(lèi)方法確定分級(jí)(詳見(jiàn)https://www2.dijon.inra.fr/mychintec/Mycocalc-prg/download.html)，這種分級(jí)包括對(duì)每個(gè)根段菌根侵染強(qiáng)度水平和叢枝豐度的快速評(píng)估。

c.將觀測(cè)值代入計(jì)算機(jī)軟件“Mycocale”中即可按照以下相關(guān)公式計(jì)算出相關(guān)的菌根侵染度參數(shù)，對(duì)菌劑擴(kuò)繁效果進(jìn)行評(píng)價(jià)：％M,和％A(Trouvelot et.al 1986；下面的檢測(cè)指標(biāo)和計(jì)算公式為現(xiàn)有公知，詳見(jiàn)https://www2.dijon.inra.fr/mychintec/Mycocalc-prg/download.h)

根系中的菌根侵染強(qiáng)度(％M)＝(95*侵染強(qiáng)度90％以上根段數(shù)+70*侵染50％至90％的根段數(shù)+30*侵染強(qiáng)度10％至50％的根段數(shù)+5*侵染強(qiáng)度10％以下1％以上根段數(shù)+侵染強(qiáng)度1％以下根段數(shù))/總根段數(shù)*100

相對(duì)菌根強(qiáng)度即根段中的菌根侵染強(qiáng)度(％m)＝M*總根段數(shù)/有根段數(shù)

(相對(duì)叢枝率)根段叢枝率(％a)＝(100*mA3+50mA2+10mA1)/100,其中mA3,mA2,mA1分別是A3，A2，A1所對(duì)應(yīng)的菌根侵染強(qiáng)度，A3，A2，A1為圖1所示。

(絕對(duì)叢枝率)根系叢枝率(A％)＝a*(M/100)

2、濕篩傾析法測(cè)定AM真菌的孢子量

將上述一獲得的AM真菌菌劑根系附近的干土壤稱(chēng)取g，放在容器內(nèi)用水浸泡20-30min，使土壤松散，選用一套具有孔徑為0.5-0.034mm的土壤篩，依次重疊，底層用一物體墊著(如木塊)，使篩面稍?xún)A。用玻璃棒攪動(dòng)浸泡的水溶液，停置幾秒使大的雜物沉淀，即將懸浮慢倒在最上一層孔徑最大的土壤篩上。傾倒時(shí)，倒在篩面的一個(gè)點(diǎn)上，用清水依次輕輕沖洗停留在篩面上的篩出物，用洗瓶將停留在篩面上的篩出物輕輕沖洗到一個(gè)清潔的培養(yǎng)皿里面，再將濾液通過(guò)細(xì)篩并用水沖洗，沖下來(lái)的篩出物中就含有AM菌根真菌的不同直徑的孢子，將含有篩出物的培養(yǎng)皿放在雙目體式解剖顯微鏡下觀察(Gerdemann J W，Nicolson T H，1963.)。

實(shí)施例2、AM真菌自繁菌劑的接種

一、AM真菌接種

1、培養(yǎng)基質(zhì)配比：與實(shí)施例1相同，基質(zhì)包括S配比、Z配比和W配比；

2、宿主植物種子催芽：與實(shí)施例1相同；宿主植物為玉米，得到催芽后玉米種子。

3、接種：與實(shí)施例1相同；

容器的消毒：75％的乙醇溶液擦拭18cm×24cm的塑料花盆。

接種：每個(gè)花盆中先分別填充2/3的上述1的3種培養(yǎng)基質(zhì)，采用條施法添加50g下面叢枝菌根真菌菌劑，接著每盆分別撒3粒催芽后玉米種子，盆中用剩余基質(zhì)填充，澆水至最大持水量，培養(yǎng)3-5個(gè)月。

叢枝菌根真菌菌劑分別為摩西管柄囊霉菌劑和根內(nèi)球囊霉菌劑；

供試菌劑：上述摩西管柄囊霉菌劑為用純沙土作為培養(yǎng)基質(zhì)，玉米為宿主植物，

接種摩西管柄囊霉(Glomus mosseae,簡(jiǎn)寫(xiě)Gm,記載在“崔衛(wèi)東,龍宣杞,侯新強(qiáng)等.黃萎病原菌脅迫對(duì)叢枝菌根化棉花幼苗根部防御性酶及超微結(jié)構(gòu)的影響.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,46(6):1235-1244”一文)后培養(yǎng)3個(gè)月，收集培養(yǎng)后宿主植物的根系及培養(yǎng)基質(zhì)得到的摩西管柄囊霉菌劑。

根內(nèi)球囊霉菌劑為用純沙土作為培養(yǎng)基質(zhì)，玉米為宿主植物，接種根內(nèi)球囊霉(Glomus intraradices,簡(jiǎn)寫(xiě)Gi,記載在Kuhn G,Hijri M,Sanders IR,Evidence for the evolution of multiple genomes in arbuscular mycorrhizal fungi.Nature,2001,414:745～748)后培養(yǎng)3個(gè)月，收集培養(yǎng)后宿主植物的根系及培養(yǎng)基質(zhì)得到的根內(nèi)球囊霉菌劑。

3種培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)3個(gè)月后，采集培養(yǎng)后玉米的侵染根系及帶有繁殖體的根際土，即得到擴(kuò)繁后的AM真菌菌劑Gm-Z(菌種為Gm，基質(zhì)為Z)、Gm-W(菌種為Gm，基質(zhì)為W)、Gm-S(菌種為Gm，基質(zhì)為S)、Gi-Z(菌種為Gi，基質(zhì)為Z)、Gi-W(菌種為Gi，基質(zhì)為W)、Gi-S(菌種為Gi，基質(zhì)為S)。

二、菌劑質(zhì)量分析

1、采用葉綠素儀測(cè)定的葉色值

采用SPAD-502葉綠素儀測(cè)定(浙江托普生產(chǎn))在收獲前對(duì)每株植物的葉色值進(jìn)行測(cè)定，得到數(shù)據(jù)如表2所示，Gm-W的葉色值與比Gm-Z相有顯著提高，Gi-Z的葉色值與Gm-W相比也有所提高，但差異不顯著。

表2玉米的葉色值

2、臺(tái)盼藍(lán)改良染色法測(cè)定侵染程度

臺(tái)盼藍(lán)改良染色法測(cè)定本發(fā)明方法擴(kuò)繁得到的擴(kuò)繁后的AM真菌菌劑Gm-Z、Gm-W、Gm-S、Gi-Z、Gi-W、Gi-S的侵染強(qiáng)度，方法與實(shí)施例1相同。

結(jié)果如表3所示，可以看出，根內(nèi)球囊霉對(duì)玉米的菌根侵染強(qiáng)度均在72％以上，摩西管柄囊霉對(duì)玉米的菌根侵染強(qiáng)度均在91％以上，基質(zhì)Z摩西管柄囊霉、根內(nèi)球囊霉對(duì)玉米的菌根侵染強(qiáng)度比以往研究純沙土的分別提高了6.64％、15.51％，基質(zhì)W摩西管柄囊霉、根內(nèi)球囊霉對(duì)玉米的菌根侵染強(qiáng)度比以往研究純沙土的分別提高了6.72％、8.19％。

表3玉米的侵染程度

3、濕篩傾析法測(cè)定AM真菌的孢子量

擴(kuò)繁的玉米AM真菌孢子密度結(jié)果如表4所示，3種基質(zhì)對(duì)摩西管柄囊霉、根內(nèi)球囊霉2種AM真菌培養(yǎng)基質(zhì)中的真菌孢子密度超過(guò)70個(gè)/g，與純沙土孢子密度相比，Gm-W、Gi-W對(duì)玉米的菌根侵染強(qiáng)度比以往研究純沙土的分別提高了20個(gè)/g、4個(gè)/g，基質(zhì)Gm-Z、Gi-Z對(duì)玉米的菌根侵染強(qiáng)度比以往研究純沙土的分別提高了32個(gè)/g、10個(gè)/g(表3)。

表4擴(kuò)繁的AM真菌菌劑的孢子密度評(píng)價(jià)/個(gè)

結(jié)合圖5、6和表1-4表證明，篩選出的W配方(風(fēng)化煤(2):沙土(1):蛭石(1):珍珠巖(1))是Gm菌劑的最佳擴(kuò)繁基質(zhì)，Z配方(沙土(2):蛭石(1):珍珠巖(1))是Gi菌劑的最佳擴(kuò)繁基質(zhì)，在此條件下，侵染程度、孢子密度和葉色值最佳。