本發(fā)明涉及林果樹領(lǐng)域，尤其是一種嘉寶果組織培養(yǎng)體系的建立方法。
背景技術(shù)：
嘉寶果的特有性狀終年常綠，生長(zhǎng)緩慢，樹形優(yōu)美，又不會(huì)寄生介殼蟲、蚜蟲。果實(shí)既可食用，亦可供人觀賞，應(yīng)用在陽臺(tái)盆植、庭園景觀或盆栽玩賞都極為合適。果實(shí)可鮮食，亦可加工為水果酒、果汁、冰淇淋及糕餅餡料等。惟鮮果容易失水，存放于一般室溫下2-3天即會(huì)發(fā)酵，不耐貯放，大大限制了其鮮果市場(chǎng)的拓展，因此雖然嘉寶果果皮堅(jiān)硬，但在采收過程中應(yīng)注意避免碰撞及造成傷口，以免果實(shí)損傷、失水或感染病菌而加速腐爛。國外研究出于果表涂布果臘或包塑料膜置于低溫環(huán)境下，可延長(zhǎng)嘉寶果果實(shí)的貯藏壽命，本場(chǎng)初步的試驗(yàn)結(jié)果為將采后的果實(shí)散除田間熱后，盡速放入聚乙烯塑料袋內(nèi)，于低溫下可減少失水及發(fā)酵作用，延長(zhǎng)貯藏壽命為2周，顯示改進(jìn)包裝材料與適當(dāng)?shù)馁A藏溫度可有效延長(zhǎng)嘉寶果的鮮果壽命，若能將此采后處理法納入生產(chǎn)體系中，相信嘉寶果應(yīng)能更加普及于臺(tái)灣的水果市場(chǎng)中。嘉寶果每百克果實(shí)可食用部分含熱量45.7Ka。水87.1g，蛋白質(zhì)0.1lg，脂肪0.01g，碳水化合物12.58g，纖維0.08g，灰分0.20g，鈣6.3mg，磷9.2mg，鐵0.49rag，硫胺素0.2mg，維生素Bz 0.02rag，煙酸0.21rrg，維生素C22.7mg，色氨酸lmg，賴氨酸7mg。高營養(yǎng)成份、珍貴、稀有、其果肉透明、柔軟多汁、風(fēng)味特殊、氣味芬芳、果肉富含水分、維他命C、高鈣、磷、鐵、纖維、碳水化合物、維他命B1、卡路里、核黃素、色氨基酸、灰分、脂肪、蛋白質(zhì)等15種以上之高營養(yǎng)成份。新鮮水果除了可以生吃以外，還可以做成果凍、蜜餞、果醬以及風(fēng)味極佳嘉寶果酒——經(jīng)常食用有利于預(yù)防心血管疾病，增強(qiáng)抵抗力，尤其對(duì)女性的活力年輕、皮膚亮麗有著顯著促進(jìn)作用。成熟果其果肉呈多汁半透明，全熟時(shí)甘甜無比，口味特殊。成熟果其果肉透明、柔軟多汁，風(fēng)味特殊、氣味芬芳，甜度平均可達(dá)13至18度，香甜可口，口感獨(dú)特，味似山竹、香芭樂、釋迦、鳳梨等多種風(fēng)味，食用入口后口感將經(jīng)歷4種不同之獨(dú)特口味。陽光：嘉寶果為常綠果樹，性喜溫暖，耐高溫。溫度：秋至春季為生長(zhǎng)盛期,最適溫度22℃~35℃。土壤：嘉寶果適合栽培在偏酸性土壤中成長(zhǎng)最好。施肥：可用水溶性肥料或長(zhǎng)效性肥料。修枝：盆栽視造形需求每修分；一般則不需要。水份：植地植株宜在地表周圍加高土提，以利灌水灌溉。繁殖方法，播種或捍插。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種嘉寶果組織培養(yǎng)方法，本發(fā)明以嘉寶果莖尖為外植體，經(jīng)過外植體消毒、啟動(dòng)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗及移栽等過程有效地提高了芽的誘導(dǎo)率、繼代系數(shù)及生根率，進(jìn)而建立了完整的嘉寶果組織培養(yǎng)體系，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。具有工藝方法簡(jiǎn)單易行，可操作性強(qiáng)，誘導(dǎo)率提高，生根多果特點(diǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是這樣的，一種嘉寶果組織培養(yǎng)體系建立的方法，其特征在于包括以下步驟：
步驟1，外植體消毒：取健壯嘉寶果當(dāng)年生的莖尖，刷洗干凈后，用洗衣粉溶液浸泡12min后用毛刷刷洗外植體表面將其表面的塵土和部分菌體去除，然后用自來水沖洗5h后超凈工作臺(tái)中，先用75%乙醇消毒32s后用無菌水洗8次，再用0.1%升汞溶液消毒28min，用無菌水沖洗8次再用無菌濾紙擦干表面的水珠后備用;
步驟2，啟動(dòng)培養(yǎng)：將經(jīng)步驟（1）處理后的莖尖接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基進(jìn)行芽誘導(dǎo)，接種后先在30℃條件下全暗培養(yǎng)9天后統(tǒng)計(jì)污染率和存活率，然后每天光照15小時(shí)，光照強(qiáng)度為3200lx條件下培養(yǎng)32天，統(tǒng)計(jì)組培苗的萌動(dòng)率及生長(zhǎng)情況;
步驟3，增殖培養(yǎng)：將步驟（2）培養(yǎng)得到的生長(zhǎng)正常、有明顯莖、葉結(jié)構(gòu)的叢生芽切下并轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，接種后先在29℃條件下全暗培養(yǎng)5天，然后每天光照15小時(shí)，光照強(qiáng)度為3000lx，培養(yǎng)溫度為29℃的條件下培養(yǎng)32天后觀察生長(zhǎng)情況和芽增殖情況，多次反復(fù)切割芽體進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以得到更多的叢生芽;
步驟4，壯苗培養(yǎng)：將經(jīng)步驟（3）增殖培養(yǎng)的叢生苗切成適當(dāng)大小，接種到壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，以利于生根，接種后先在29℃條件下全暗培養(yǎng)5天，然后每天光照15小時(shí)，光照強(qiáng)度為3200lx，培養(yǎng)溫度為29℃的條件下培養(yǎng)至組培苗生長(zhǎng)到4cm以上;
步驟5，生根培養(yǎng)：將步驟（2）、（3）或（4）過程獲得的高度4.0cm以上的組培苗接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在29℃條件下全暗培養(yǎng)5天，然后每天光照16小時(shí)，光照強(qiáng)度為3200lx，培養(yǎng)溫度為29℃的條件下培養(yǎng)1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)生根情況;
步驟6，煉苗移栽：將步驟（5）獲得的高約9cm的生長(zhǎng)良好且健壯的生根試管苗去瓶蓋自然光照下煉苗9天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由營養(yǎng)土：珍珠巖＝4:1混合成的基質(zhì),光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天以1/4MS大量元素營養(yǎng)液給幼苗澆水，保持濕度 ,待幼苗成活后再移栽大田。
步驟（2）所述的啟動(dòng)培養(yǎng)基為：MS+2mg/L6-BA+0.7mg/L NAA+32g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH為5.9。
步驟（3）所述的增殖培養(yǎng)基為：MS+1.2mg/LNAA+7mg/L 6-BA+32g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂，pH為5.9。
步驟（4）所述的壯苗培養(yǎng)基為：MS+0.8mg/L 6-BA+1.2mg/L GA3+32g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂，pH為5.9。
步驟（5）所述的生根培養(yǎng)基為：1/2MS+6.5mg/L IBA+32g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH為5.9。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)短時(shí)間內(nèi)快速獲得大量嘉寶果優(yōu)良品種試管苗的方法。本發(fā)明以嘉寶果莖尖為外植體，經(jīng)過外植體消毒、啟動(dòng)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗及移栽等過程有效地提高了芽的誘導(dǎo)率、繼代系數(shù)及生根率，進(jìn)而建立了完整的嘉寶果組織培養(yǎng)體系，以便進(jìn)行嘉寶果種苗工廠化生產(chǎn)。果子可做成果凍、果醬、果酒，有保健作用，預(yù)防心血管病，增加抵抗力，護(hù)膚亮膚。
具體實(shí)施方式
下面實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1
（一）種子繁殖：此為嘉寶果目前最主要的繁殖方法，每果有種子1至4粒，呈不規(guī)則棱型，為多胚性。新鮮種子發(fā)芽較佳，一般將果皮壓破后擠出種子，待1-2日后果肉酸化腐爛，再以清水洗除果肉，即可播種。果實(shí)采收后貯藏于塑料袋，于5-8℃下冷藏，欲播種時(shí)再取出種子洗凈后播種，冷藏可維持1-2個(gè)月，仍有一定的發(fā)芽率。種子于播種20-40天后發(fā)芽，氣溫低時(shí)發(fā)芽較慢。
（二）嫁接法：多數(shù)嘉寶果品種的實(shí)生苗木需6-10年方能開始結(jié)果，利用嫁接法可提早結(jié)果，嫁接后約3年可結(jié)果，選用二年生苗木作為砧木，由結(jié)果母樹剪取一年生枝條為接穗，于秋冬季切接或靠接成活率較高，3-4月以后接活率較差，夏季嫁接不易成功。
（三）扦插法：嘉寶果不易扦插存活，國內(nèi)研究其為一典型難發(fā)根物種，可于每年五月份以半硬枝插（2節(jié)4片葉），速浸NAA 2000 ppm，以泥炭土為生根介質(zhì)，發(fā)根率可達(dá)九成。而國外研究則是以10公分長(zhǎng)插穗，帶3-4對(duì)成熟葉，于砂混合泥炭土（比例1：1）的介質(zhì)中扦插為佳，插穗基部縱切4條加IBA 1000 ppm處理可促進(jìn)發(fā)根。（四）修剪：因嘉寶果生育緩慢，平時(shí)無須強(qiáng)剪，但為控制株高及盆栽樹型，宜適時(shí)修剪頂端生長(zhǎng)旺盛的枝條，通常栽培上建議修剪低處及內(nèi)部細(xì)短枝條，以塑造通風(fēng)且枝干優(yōu)美之樹型，另秋冬季可修剪密生或徒長(zhǎng)枝條。
（四）苗期管理：一是抹芽定梢，萌芽后抹去雙芽、多頭芽、過弱芽。形成新梢后,往兩邊鐵絲引縛,按15～20cm間距定梢并及時(shí)噴施促花王3號(hào)，可有效控梢狂長(zhǎng)，促多抽花枝，促花芽分化?？捎行Ь獯笮』ㄋ?，省去疏花疏果之煩。要根據(jù)生長(zhǎng)階段適時(shí)追肥，即花果肥、果膨肥、著色肥以及采后催生肥。特別要注意做到NPK等各種肥素的合理匹配，確保營養(yǎng)的均衡供給。
（五）病蟲害管理：嘉寶果為淺根性、灌叢果樹，此樹種對(duì)病蟲害抗力強(qiáng)，病蟲害少，管理上甚少使用農(nóng)藥，是極為好栽植照顧之樹種。嘉寶果在國內(nèi)栽培發(fā)生的病蟲害少，管理上甚少使用農(nóng)藥，是極為好栽植照顧之樹種。惟在結(jié)果期間容易受鳥害，可在植株外圍覆蓋黑網(wǎng)或搭設(shè)網(wǎng)室防止鳥食，亦可用雙層報(bào)紙?zhí)状员Ｗo(hù)果實(shí)。若有毒蛾類幼蟲危害葉片，可施用植物保護(hù)手冊(cè)推薦用藥防治。在國外，濕熱季節(jié)容易發(fā)生銹病，可藉由修剪提高植株內(nèi)部光線及改善通風(fēng)來預(yù)防，發(fā)生時(shí)可噴施殺菌劑以降低病原密度。另外蚜蟲、果實(shí)蠅、介殼蟲及甲蟲類國外都有發(fā)生的紀(jì)錄，國內(nèi)栽培時(shí)應(yīng)一并注意這些病蟲害。
實(shí)施例2
（1）外植體消毒：取健壯嘉寶果當(dāng)年生的莖尖，刷洗干凈后，用洗衣粉溶液浸泡6min后用軟毛刷輕輕刷洗外植體表面將其表面的塵土和部分菌體去除，然后用自來水沖洗1h后置于超凈工作臺(tái)中，先用75%乙醇消毒6s后用無菌水洗4次，再用0.1%升汞溶液消毒10min，用無菌水沖洗5次再用無菌濾紙擦干表面的水珠后備用。
（2）啟動(dòng)培養(yǎng)：將經(jīng)步驟（1）處理后的莖尖接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基進(jìn)行芽誘導(dǎo)，接種后先在26℃條件下全暗培養(yǎng)5天后污染率低至3%，存活率達(dá)78%。然后每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為1600x條件下培養(yǎng)32天，組培苗的萌動(dòng)率為70%。所述的啟動(dòng)培養(yǎng)基為：MS+0.6mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.5g/L瓊脂，pH為5.9。
（3）增殖培養(yǎng)：將步驟（2）培養(yǎng)得到的生長(zhǎng)正常、有明顯莖、葉結(jié)構(gòu)的叢生芽切下并轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，接種后先在28℃條件下全暗培養(yǎng)1天，然后每天光照10小時(shí)，光照強(qiáng)度為1000lx，培養(yǎng)溫度為28℃的條件下培養(yǎng)30天后芽增殖系數(shù)為4.89。多次反復(fù)切割芽體進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以得到更多的叢生芽。所述的增殖培養(yǎng)基為：MS+0.5mg/LNAA+3mg/L 6-BA+15g/L蔗糖+4.0g/L瓊脂，pH為5.8。
（4）壯苗培養(yǎng)：將經(jīng)步驟（3）增殖培養(yǎng)的叢生苗切成適當(dāng)大小，接種到壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，以利于生根。接種后先在28℃條件下全暗培養(yǎng)1天，然后置于每天光照10小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000lx，培養(yǎng)溫度為28℃的條件下培養(yǎng)15天組培苗即可生長(zhǎng)到2cm以上。所述的壯苗培養(yǎng)基為：MS+0.3mg/L 6-BA+0.05/L GA3+15g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂，pH為5.8。
（5）生根培養(yǎng)：將步驟（2）、（3）或（4）過程獲得的高度2.0cm以上的組培苗接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在28℃條件下全暗培養(yǎng)1天，然后置于每天光照10小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000lx，培養(yǎng)溫度為26℃的條件下培養(yǎng)1個(gè)月后生根率達(dá)93.5%。所述的生根培養(yǎng)基為：1/2MS+2mg/L IBA+15g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂，pH為5.8。
（6）煉苗移栽：將步驟（5）獲得的高約5.5cm的生長(zhǎng)良好且健壯的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗4天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由營養(yǎng)土：珍珠巖＝3:1混合成的基質(zhì),光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天以1/4MS大量元素營養(yǎng)液給幼苗澆水，保持濕度。待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率為96%以上。
實(shí)施例3：
（1）外植體消毒：取健壯嘉寶果當(dāng)年生的莖尖，刷洗干凈后，用洗衣粉溶液浸泡8min后用軟毛刷輕輕刷洗外植體表面將其表面的塵土和部分菌體去除，然后用自來水沖洗3h后超凈工作臺(tái)中，先用75%乙醇消毒12s后用無菌水洗5次，再用0.1%升汞溶液消毒14min，用無菌水沖洗6次再用無菌濾紙擦干表面的水珠后備用。
（2）啟動(dòng)培養(yǎng)：將經(jīng)步驟（1）處理后的莖尖接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基進(jìn)行芽誘導(dǎo)，接種后先在28℃條件下全暗培養(yǎng)4天后污染率低至5%，存活率達(dá)81.6%。然后每天光照13小時(shí)，光照強(qiáng)度為1400x條件下培養(yǎng)29天，組培苗的萌動(dòng)率為79%。所述的啟動(dòng)培養(yǎng)基為：MS+0.8mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.5g/L瓊脂，pH為5.7。
（3）增殖培養(yǎng)：將步驟（2）培養(yǎng)得到的生長(zhǎng)正常、有明顯莖、葉結(jié)構(gòu)的叢生芽切下并轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，接種后先在28℃條件下全暗培養(yǎng)3天，然后每天光照10小時(shí)，光照強(qiáng)度為1500lx，培養(yǎng)溫度為28℃的條件下培養(yǎng)30天后芽增殖系數(shù)5.13。多次反復(fù)切割芽體進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以得到更多的叢生芽。所述的增殖培養(yǎng)基為：MS+0.3mg/LNAA+5mg/L 6-BA+25g/L蔗糖+4.5g/L瓊脂，pH為5.8。
（4）壯苗培養(yǎng)：將經(jīng)步驟（3）增殖培養(yǎng)的叢生苗切成適當(dāng)大小，接種到壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，以利于生根。接種后先在28℃條件下全暗培養(yǎng)2天，然后每天光照11小時(shí)，光照強(qiáng)度為2500lx，培養(yǎng)溫度為28℃的條件下培養(yǎng)17天組培苗即可生長(zhǎng)到3cm以上。所述的壯苗培養(yǎng)基為：MS+0.4mg/L 6-BA+0.1/L GA3+15g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂，pH為5.8。
（5）生根培養(yǎng)：將步驟（2）、（3）或（4）過程獲得的高度2cm以上的組培苗接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在26℃條件下全暗培養(yǎng)1天，然后每天光照10小時(shí)，光照強(qiáng)度為2500lx，培養(yǎng)溫度為28℃的條件下培養(yǎng)29天后生根率達(dá)96%。所述的生根培養(yǎng)基為：1/2MS+4mg/L IBA+18g/L蔗糖+3.7g/L瓊脂，pH為5.8。
（6）煉苗移栽：將步驟（5）獲得的高約2cm的生長(zhǎng)良好且健壯的生根試管苗去瓶蓋自然光照下煉苗5天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由營養(yǎng)土：珍珠巖＝3:1混合成的基質(zhì),光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天以1/4MS大量元素營養(yǎng)液給幼苗澆水，保持濕度。待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率為93%以上。