本發(fā)明涉及一種降低冷凍保存細(xì)胞凍融后細(xì)胞器損傷的方法。
背景技術(shù)：
：哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的超低溫保存，是指在超低溫(-196℃)條件下抑制細(xì)胞內(nèi)一切新陳代謝活動(dòng)，并使細(xì)胞被長期保存，之后按一定方式解凍，又能恢復(fù)其受精、卵裂等發(fā)育潛能的一種保存技術(shù)。玻璃化冷凍法因使用高濃度的冷凍保護(hù)液在液氮中能形成類似玻璃狀穩(wěn)定而透明的非晶體化固體物質(zhì)狀態(tài)而得名。因?yàn)槔鋬鲆涸谝旱行纬傻氖且环N非晶體物質(zhì)狀態(tài)，因而避免了慢速冷凍過程中細(xì)胞所遭受的機(jī)械損傷，同時(shí)不需要昂貴的程序降溫儀，簡化了步驟，節(jié)省了時(shí)間，逐漸成為胚胎和卵母細(xì)胞冷凍的趨勢(shì)。然而，高濃度冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞有較大的化學(xué)毒性，且產(chǎn)生滲透壓應(yīng)激。研究表明，卵母細(xì)胞暴露于高滲溶液中增加卵母細(xì)胞紡錘體、染色體異常比例，線粒體分布異常(Hotamisligiletal.,1996)，從而降低卵母細(xì)胞受精后的發(fā)育能力。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有高濃度冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞有較大的化學(xué)毒性，導(dǎo)致卵母細(xì)胞紡錘體、染色體異常比例增加，線粒體分布異常的問題，而提供的一種降低冷凍保存卵母細(xì)胞凍融后細(xì)胞器損傷的方法。本發(fā)明降低冷凍保存卵母細(xì)胞凍融后細(xì)胞器損傷的方法，其中用甜菜堿作為卵母細(xì)胞冷凍保存的細(xì)胞器保護(hù)劑。將甜菜堿加入平衡液、冷凍液、解凍液和基礎(chǔ)液。一種降低冷凍保存卵母細(xì)胞凍融后細(xì)胞器損傷的方法：一、冷凍：GV期卵母細(xì)胞在500μl平衡液中平衡3分鐘后移入冷凍液中，迅速將3～5個(gè)卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)轉(zhuǎn)移到冷凍環(huán)上，再投入液氮；二、解凍：液氮冷凍的卵母細(xì)胞先在解凍液Ⅰ中靜置3分鐘后轉(zhuǎn)入解凍液Ⅱ中靜置3分鐘，再移入基礎(chǔ)液中靜置3分鐘。本發(fā)明甜菜堿用于保護(hù)超低溫(-196℃)條件下冷凍保存的卵母細(xì)胞的細(xì)胞器。在甜菜堿的保護(hù)下超低溫冷凍保存的卵母細(xì)胞的紡錘體正常率達(dá)50％以上、染色體正常率達(dá)48％以上，線粒體排布正常率達(dá)56％以上。附圖說明圖1是卵母細(xì)胞正常紡錘體和染色體的分布圖。圖2是卵母細(xì)胞異常紡錘體和染色體的分布圖。圖3是卵母細(xì)胞正常線粒體分布圖。圖4是卵母細(xì)胞異常線粒體分布圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式一種降低冷凍保存卵母細(xì)胞凍融后細(xì)胞器損傷的方法，其中用甜菜堿作為卵母細(xì)胞冷凍保存的細(xì)胞器保護(hù)劑。具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)是：將甜菜堿加入平衡液、冷凍液、解凍液和基礎(chǔ)液。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二的不同點(diǎn)是：解凍液包括解凍液Ⅰ和解凍液Ⅱ。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二相同。具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二或三的不同點(diǎn)是：甜菜堿在平衡液、冷凍液、解凍液和基礎(chǔ)液中的濃度為0.2～1mmol/L。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二或三相同。具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二或三的不同點(diǎn)是：甜菜堿在平衡液、冷凍液、解凍液和基礎(chǔ)液中的濃度為0.5mmol/L。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二或三相同。具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至五之一的不同點(diǎn)是：甜菜堿在卵母細(xì)胞冷凍保存領(lǐng)域的應(yīng)用：一、冷凍：GV期卵母細(xì)胞在500μl平衡液中平衡3分鐘后移入冷凍液中，迅速將3～5個(gè)卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體轉(zhuǎn)移到冷凍環(huán)上，再投入液氮；二、解凍：液氮冷凍的卵母細(xì)胞先在解凍液Ⅰ中靜置3分鐘后轉(zhuǎn)入解凍液Ⅱ中靜置3分鐘，再移入基礎(chǔ)液中靜置3分鐘。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一至五之一相同。本實(shí)施方式步驟二解凍過程均在37℃下進(jìn)行。具體實(shí)施方式七：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式六的不同點(diǎn)是：基礎(chǔ)液為添加了血清和甜菜堿的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，基礎(chǔ)液中血清的體積濃度為10％、甜菜堿的濃度為0.5mmol/L；平衡液為基礎(chǔ)液+7.5％v/v乙二醇+7.5％v/vDMSO+0.25M海藻糖；冷凍液為基礎(chǔ)液+15％v/v乙二醇+15％v/vDMSO；解凍液Ⅰ為基礎(chǔ)液+1M海藻糖；解凍液Ⅱ?yàn)榛A(chǔ)液+0.5M海藻糖。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式六相同。本實(shí)施方式中基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)液、TCM199培養(yǎng)液、M16培養(yǎng)液或MEM培養(yǎng)液；血清為小牛血清、胎牛血清或新生牛血清。實(shí)施例1一、冷凍：小鼠GV期卵母細(xì)胞在500μl平衡液中平衡3分鐘后移入冷凍液中，迅速將3～5個(gè)COCs轉(zhuǎn)移到冷凍環(huán)上，再投入液氮；二、解凍：液氮冷凍的卵母細(xì)胞先在解凍液Ⅰ中靜置3分鐘后轉(zhuǎn)入解凍液Ⅱ中靜置3分鐘，再移入基礎(chǔ)液中靜置3分鐘，解凍過程均在37℃下進(jìn)行。三、卵母細(xì)胞體外成熟：卵母細(xì)胞體外成熟液的配制：TCM199培養(yǎng)液(購自GIBCO公司)中加入5ml胎牛血清和5000IU青霉素及5000μg鏈霉素，輕微攪拌混勻，再加入FSH2.5IU、LH2.5IU、17β-雌二醇50μg、丙酮酸鈉1.21mg和EGF500ng，輕輕混勻，靜置2～3小時(shí)后，用0.22μm的過濾器抽濾消毒后，分裝到1.5ml離心管中，4℃下儲(chǔ)存，備用。卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)：將步驟二解凍的小鼠GV期卵母細(xì)胞放入37℃預(yù)熱2小時(shí)的卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中，然后置于CO2體積濃度為5％的環(huán)境內(nèi)成熟培養(yǎng)14小時(shí)或24小時(shí)；本實(shí)施例中基礎(chǔ)液為添加了胎牛血清和甜菜堿的MEM培養(yǎng)液，基礎(chǔ)液中胎牛血清的體積濃度為10％、甜菜堿的濃度為0.5mmol/L；平衡液為基礎(chǔ)液+7.5％v/v乙二醇+7.5％v/vDMSO+0.25M海藻糖；冷凍液為基礎(chǔ)液+15％v/v乙二醇+15％v/vDMSO；解凍液Ⅰ為基礎(chǔ)液+1M海藻糖；解凍液Ⅱ?yàn)榛A(chǔ)液+0.5M海藻糖。圖1是卵母細(xì)胞正常紡錘體和染色體的分布圖，圖2是卵母細(xì)胞異常紡錘體和染色體的分布圖。圖3是卵母細(xì)胞正常線粒體分布圖，圖4是卵母細(xì)胞異常線粒體分布圖。實(shí)施例2與實(shí)施例1的區(qū)別在于基礎(chǔ)液為添加了胎牛血清和甜菜堿的M16培養(yǎng)液。實(shí)施例3與實(shí)施例1的區(qū)別在于基礎(chǔ)液為僅添加了胎牛血清的基本培養(yǎng)液(不含甜菜堿)。實(shí)驗(yàn)線粒體分布檢測(cè)：將各實(shí)施例步驟三中體外成熟的卵母細(xì)胞脫去卵丘細(xì)胞，將卵母細(xì)胞置于包含200μMMitotrackerRed(MitotrackerRedFM；MolecularProbes,Eugene,OR,USA)中37℃條件下孵育30分鐘，清洗過后固定于4％的多聚甲醛中20分鐘，之后用PBS清洗三次，轉(zhuǎn)移到0.5％TritonX-100中20分鐘，轉(zhuǎn)移到DAPI中，壓片觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。紡錘體組裝和染色體排布檢測(cè)：將各實(shí)施例步驟三中體外成熟的卵母細(xì)胞脫去卵丘細(xì)胞后，固定于4％多聚甲醛中60分鐘，PBS清洗3次后，轉(zhuǎn)移到穿透液中(PBS加5％FBS和0.01％TritonX-100)，4℃過夜；之后用anti-a-tubulin(帶有FITC)單克隆抗體(1:500稀釋)孵育60分鐘。PBS洗滌后轉(zhuǎn)移到DAPI中，壓片觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。表1玻璃化冷凍保存后線粒體正常和異常比例正常(％)異常(％)實(shí)施例156.243.8實(shí)施例248.351.7實(shí)施例339.460.6表2玻璃化冷凍保存后紡錘體和染色體正常和異常比例實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā)明甜菜堿的應(yīng)用可以提高冷凍保存卵母細(xì)胞的紡錘體排布正常率、染色體正常排布率、線粒體分布正常比例。當(dāng)前第1頁1 2 3