本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是涉及枯草芽孢桿菌HMB19198制劑在防治香蕉巴拿馬病的方法。

背景技術(shù)：

香蕉(學(xué)名：Musa nana Lour.)芭蕉科芭蕉屬植物。熱帶地區(qū)廣泛栽培食用。香蕉味香、富含營養(yǎng)，終年可收獲，在溫帶地區(qū)也很受重視。植株為大型草本，從根狀莖發(fā)出，由葉鞘下部形成高3～6公尺(10～20尺)的假桿；葉長圓形至橢圓形，有的長達(dá)3～3.5公尺(10～11.5尺)，寬65公分(26寸)，10～20枚簇生莖頂。穗狀花序大，由假桿頂端抽出，花多數(shù)，淡黃色；果序彎垂，結(jié)果10～20串，約50～150個。植株結(jié)果后枯死，由根狀莖長出的吸根繼續(xù)繁殖，每一根株可活多年。原產(chǎn)亞洲東南部：中國臺灣、海南、廣東、廣西等地區(qū)均有栽培。

香蕉巴拿馬病(Panama disease)，又名：香蕉枯萎病，是一種通過土壤傳播的香蕉傳染病，染病香蕉逐步巴拿馬死亡，且因?yàn)橥寥肋z留，發(fā)病地區(qū)30年以上不能種植香蕉，是香蕉的“不治之癥”，也是威脅全球香蕉種植業(yè)的最大殺手。

香蕉巴拿馬病在我國南方數(shù)省香蕉產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生的毀滅性病害，其表現(xiàn)在成株期病株先在下部葉片及靠外的葉鞘呈現(xiàn)特異的黃色，初期在葉片邊緣發(fā)生，然后逐部向中肋擴(kuò)展，與葉片的深綠部分對比顯著。也有整片葉子發(fā)黃的，感病葉片迅速凋萎，由黃變褐而干枯，其最后一片頂葉往往遲抽出或不能抽出，最后病株枯死。有個別雖然不隨即枯死，但果實(shí)發(fā)育不良，品質(zhì)低劣。母株發(fā)病，在地上部(即假莖)枯死后，其地下部(即球莖)不立即枯死，仍能長出新芽，繼續(xù)生長，要到生長中后期才顯現(xiàn)癥狀。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，香蕉巴拿馬病是一種侵染香蕉植株維管束的真菌引起的土傳病。是一種毀滅性病害，是國際植物檢疫對象，由尖孢鐮刀菌古巴?；颓秩疽稹Ｔ谥袊戏綌?shù)省香蕉產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生。主要有布1號和4號小種，1 號小種主要為害粉蕉，4號小種為害粉蕉和香蕉。一般減產(chǎn)達(dá)到20％以上，嚴(yán)重的田塊甚至絕收。

香蕉巴拿馬病的病原菌在土壤里面可以殘存30年以上，沒有任何的農(nóng)藥可以去把它根除掉，所以雖然有一些簡單的水稻輪作，或者是用一些有機(jī)質(zhì)，土壤的改進(jìn)內(nèi)有效，但那都是局部性的，還是需要以用抗病的，或耐病的品種為主。

在目前的香蕉巴拿馬病防治中，本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員還沒有找到“特效藥”。在本領(lǐng)域內(nèi)，技術(shù)人員也正在不斷的試驗(yàn)摸索中尋找能更好防治香蕉巴拿馬病的制劑，其中依然是靠綜合防治為主：1、嚴(yán)格執(zhí)行檢疫制度嚴(yán)格限制蕉苗和馬尼拉麻苗及其所附帶的土壤由病區(qū)輸入；2、選栽無病種苗和抗病品種為確保蕉園無巴拿馬病，應(yīng)選栽無病蕉苗，基本方法是從沒有香蕉巴拿馬病的地區(qū)引種。此外，盡可能選用抗巴拿馬病的品種；3、封鎖病區(qū)，防止病害擴(kuò)散。蕉園發(fā)現(xiàn)零星病株，要立即連根拔起并把病株斬碎，裝入塑料袋內(nèi)，加入石灰并密封袋口，移出且遠(yuǎn)離蕉園讓其腐爛；4、病土處理為了清除侵染來源，杜絕傳播機(jī)會，病土處理是一項(xiàng)很重要的措施；5、加強(qiáng)栽培管理增施肥料，開溝排水，增強(qiáng)植株抗病力。平地重病蕉園有條件的可淹水休閑半年或與水稻輪作。6、配合化學(xué)藥劑進(jìn)行相應(yīng)防治。但由于化學(xué)藥劑其存在根本性的弊端，如藥性單一，易造成高毒、高殘、導(dǎo)致香蕉品質(zhì)降低，同時易產(chǎn)生抗藥性。因?yàn)樵谕坏貐^(qū)長期，連續(xù)使用一種農(nóng)藥，或使用作用機(jī)理相同的農(nóng)藥，害蟲、病菌或雜草對農(nóng)藥抵抗力就會的提高，進(jìn)而產(chǎn)生一定的抗藥性。

近年來，生物防治方法由于高效、環(huán)保、無污染、無殘留等優(yōu)點(diǎn)越來越受到重視。因此，如何尋找到能夠防治香蕉巴拿馬病生物菌劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員目前亟需解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防或治療香蕉巴拿馬病的方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種預(yù)防或治療香蕉巴拿馬病的方法，包括：為香蕉施用枯草芽孢桿菌HMB19198制劑。

為香蕉施用枯草芽孢桿菌HMB19198制劑。

優(yōu)選的，所述枯草芽孢桿菌HMB19198制劑的活芽孢含量為：10億活芽孢/克枯草芽孢桿菌可濕性粉劑。

優(yōu)選的，所述枯草芽孢桿菌HMB19198的用量為50g/株-200g/株。

優(yōu)選的，所述施用為灌根法。

本發(fā)明的枯草芽孢桿菌制劑是一種利用生物防治香蕉巴拿馬病的解決辦法，該菌劑對香蕉巴拿馬病有較好的防治效果，同時還是一種微生物菌劑，這樣就更保證了香蕉巴拿馬病的防治是高效環(huán)保，無污染的；同時制作方法也非常簡單，成本也非常低，使用技術(shù)非常成熟，是防治香蕉巴拿馬病的一種更佳手段。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的核心是提供一種預(yù)防或治療香蕉巴拿馬病的方法，能夠有效的防治香蕉巴拿馬病。

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例一：枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對香蕉苗的安全性測試。

本實(shí)施例的目的是測定枯草芽孢桿菌可濕性粉劑防治香蕉的安全性，為其防治香蕉巴拿馬病提供依據(jù)。

本實(shí)施例的供試作物為香蕉，其中作物品種分別為高腳頓地雷，屬于高干型香牙蕉，為廣東省高州市優(yōu)良品種之一；畦田大蕉，屬大蕉類型，為廣東新會的地方品種之一；中山大粉蕉，屬粉蕉類型，為廣東中山的地方品種之一，以上香蕉苗均從廣東省農(nóng)科院購買供試。

本實(shí)施例的供試藥劑為利用枯草芽孢桿菌HMB19198生產(chǎn)的微生物菌劑，該微生物菌劑的活性成分為枯草芽孢桿菌HMB19198芽孢和它的胞外代謝產(chǎn)物。本實(shí)施例使用科綠豐生化科技有限公司以枯草芽孢桿菌HMB19198芽孢生產(chǎn)的10億活芽孢/克枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，其用量一般最高為50g/株，按其 1，2，3倍的梯度設(shè)計試驗(yàn)劑量，即50、100、200g/株。對照藥劑為100億孢子/克枯草芽孢桿菌，按照試驗(yàn)藥劑的設(shè)計濃度，根據(jù)有效成分等量原則，確定為5g/株。以不含藥劑清水處理作為空白對照。

本實(shí)施例的培養(yǎng)條件是在室內(nèi)進(jìn)行，將上述3個香蕉品種的組培苗栽種于營養(yǎng)缽中，以未種香蕉的肥沃田土加適量腐熟有機(jī)肥作為培養(yǎng)基質(zhì)，常規(guī)管理，培養(yǎng)至香蕉5葉期備用。

本實(shí)施例的施藥方法為灌根法，將藥液稀釋后均勻澆灌到盆栽香蕉根部土層，澆灌量以土層有明顯澆灌濕潤但無積水為止。

本實(shí)施例的試驗(yàn)方法如下：挑選葉片數(shù)5葉，假莖高度基本一致的香蕉苗，沿香蕉苗根周邊挖深約10cm溝，進(jìn)行穴施處理。以清水對照、本供試農(nóng)藥10億孢子/克枯草芽孢桿菌WP制劑50、100、200g/株，對照藥100億孢子/克枯草芽孢桿菌WP制劑5g/株，施藥后蓋薄土層。每處理4重復(fù)，每重復(fù)5株香蕉苗，即每處理共20株香蕉苗。置于室內(nèi)，常規(guī)用水管理，試驗(yàn)期間不另施肥料。

本實(shí)施例采用的調(diào)查方法如下：本試驗(yàn)中，施藥后5天，觀察香蕉葉片，比對各藥劑處理對葉片是否有藥害，如有藥害，記錄藥害產(chǎn)生的時間、癥狀和嚴(yán)重程度，根據(jù)NY/T 1965.1-2010中藥害分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級，培養(yǎng)至施藥后21天，觀察有無畸形，徒長等情況，如有藥害，繼續(xù)觀察其發(fā)展程度，是否能恢復(fù)以及恢復(fù)情況等，分別計算其葉片數(shù)，測量其假莖高度(cm)，比較處理與CK之間的差異性，按下式計算安全系數(shù)I，評價對香蕉苗生長的影響。

安全系數(shù)I＝藥劑對作物的最大無影響試驗(yàn)劑量/藥劑田間最高推薦使用劑量

本實(shí)施例在試驗(yàn)處理后5天目測，供試10億孢子/克枯草芽孢桿菌WP制劑50、100、200g/株，以及對照藥劑100億孢子/克枯草芽孢桿菌WP制劑5g/株穴施處理后，3種受試驗(yàn)香蕉均是安全無藥害，葉片均表現(xiàn)為濃綠色，無黃化、白化、褪綠、銹斑、枯斑等變色、壞死現(xiàn)象，葉緣正常，與清水對照CK無明顯差異。施藥處理后21天觀察，各處理香蕉無徒長、葉片異常卷曲等畸形現(xiàn)象，假莖無縊縮，葉片數(shù)、假莖高度目測與CK無差異，說明供試在一般最高用量以及2倍、4倍條件下均對目標(biāo)作物香蕉苗安全無藥害。

測試結(jié)果見下表：

表1、供試10億孢子/克枯草芽孢桿菌WP灌根對香蕉苗的安全性評價

注：相同品種同列數(shù)據(jù)后小寫字母相同者，表示經(jīng)DMRT法統(tǒng)計比較差異不顯著(p-0.05)

從本實(shí)施例結(jié)果的數(shù)據(jù)可知，試驗(yàn)藥劑10億孢子/克枯草芽孢桿菌WP制劑50、100、200g/株穴施，對“高腳頓地雷”、“畦頭大蕉”和“中山大粉蕉”香蕉苗灌根處理后21天，葉片數(shù)分別為6.5-7.1、5.6-6.1、5.0-5.6葉/株，假莖高度方面分別為67.6-40.7、32.67-33.8、31.8-33.4cm均與對照藥劑100億孢子/克枯草芽孢桿菌WP制劑5g/株穴施以及清水對照CK區(qū)的葉片數(shù)無顯著差異或略優(yōu)于CK，但均與對照藥劑、CK的差異在“±10％”以內(nèi)，且無其他癥狀，按照NY/T1965.1-2010規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，說明本試驗(yàn)劑量和方法下，10億孢子/克枯草芽孢桿菌WP對3種供試香蕉品種安全。

原始數(shù)據(jù)如下：

表2 10億孢子/克枯草芽孢桿菌WP對香蕉秒葉片數(shù)的影響(穴施法，藥后21天，葉/株)

表3 10億孢子/克枯草芽孢桿菌WP對香蕉苗假莖高度的影響(穴施法，藥后21天，單位：cm)

實(shí)施例二：芽孢桿菌可濕性粉劑防治香蕉巴拿馬病室內(nèi)生物活性測定。

本實(shí)施例的目的是測定200億孢子/克枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對香蕉巴拿馬病室內(nèi)生物活性，確定藥劑的最佳使用劑量和合理的使用技術(shù)。

本實(shí)施例的供試靶標(biāo)為香蕉巴拿馬病菌，是尖孢鐮刀菌古巴?；虵usarium o×ysporum f.sp.cubense4號生理小種B2菌株，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)系真菌研究室提供，活化供試。

本實(shí)施例的供試藥劑為利用枯草芽孢桿菌HMB19198生產(chǎn)的微生物菌劑，該微生物菌劑的活性成分為枯草芽孢桿菌HMB19198芽孢和它的胞外代謝產(chǎn)物。本實(shí)施例使用科綠豐生化科技有限公司以枯草芽孢桿菌HMB19198芽孢生產(chǎn)的200億活芽孢/克枯草芽孢桿菌可濕性粉劑；對照藥劑選用由湖北省武漢天惠生物工程有限公司提供的2000億孢子/克枯草芽孢桿菌；并選用乳化劑0203B作為其他溶劑使用。

本實(shí)施例的藥劑配制如下：

根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)，設(shè)計試驗(yàn)藥劑和對照藥劑枯草芽孢桿菌的試驗(yàn)濃度為1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸cfu/mL(抑菌率約20％-90％，PDA培養(yǎng)基中含藥濃度，下同)。

取試驗(yàn)藥劑200億孢子/克枯草芽孢桿菌(R31)原粉和對照藥劑2000億孢子/克枯草芽孢桿菌母藥，分別用含0.05％0203B乳化劑的清水配制枯草芽孢桿菌成2×10⁹cfu/mL，其他濃度的藥液，均由上一級濃度藥液稀釋而來。

本實(shí)施例的藥劑處理如下：在無菌操作條件下，根據(jù)試驗(yàn)處理將預(yù)先融化的滅菌PDA培養(yǎng)基定量加入無菌錐形瓶中，按藥液與培養(yǎng)基體積比1∶19比例，從低濃度到高濃度依次定量吸取藥液，分別加入上述錐形瓶中，制成上述濃度的含藥PDA培養(yǎng)基，然后倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿，每皿培養(yǎng)基20mL，制成相應(yīng)濃度的含藥平板。每濃度設(shè)4個重復(fù)，每重復(fù)1個培養(yǎng)皿。

本實(shí)施例接種與培養(yǎng)：將活化培養(yǎng)7d的香蕉巴拿馬病原菌，在無菌條件下用直徑5mm的滅菌打孔器，自菌落邊緣且取菌餅，用接種器將菌餅接種于含藥平板中央，菌絲面朝上，蓋上皿蓋，置于溫度25±1℃，濕度80％-90％培養(yǎng)箱黑暗連續(xù)培養(yǎng)7d后調(diào)查。

調(diào)查過程如下：培養(yǎng)7d后，對照培養(yǎng)皿中病菌已覆蓋培養(yǎng)皿90％以上，用直尺以十字交叉法垂直測量菌落直徑各一次，單位為cm。

本實(shí)施例的統(tǒng)計與分析方法如下：每處理4重復(fù)，取其平均值D，按如下公式計算各處理對供試香蕉巴拿馬病菌菌絲生長抑制率，單位為百分比(％)

D＝D₁-D₂(其中D：菌落增長直徑；D1：菌落直徑；D2：菌餅直徑)

I＝(D₀-D_t)/D₀×100

I：菌絲生長抑制率；D₀＝空白對照菌落增長直徑，D_t＝藥劑處理菌落增長 直徑

根據(jù)各藥劑濃度對數(shù)值及對應(yīng)的防效幾率值作線性回歸分析，求毒力回歸方程，計算各單劑及其各配比的抑制中濃度EC₅₀、EC₉₀及其95％置信限(mg/L)。

本實(shí)施例結(jié)果分析：

各處理菌落直徑數(shù)據(jù)見表1，EC₅₀值等做指標(biāo)計算結(jié)果見表2，。結(jié)果顯示，培養(yǎng)后7d，CK菌落直徑增加7.81cm，供試藥劑200億孢子/克枯草芽孢桿菌原粉抑制供試香蕉巴拿馬病菌菌絲生長的EC50值和EC90值分別為1.64×105CFU/mL和156.78×105CFU/mL，對照藥劑2000億孢子/克枯草芽孢桿菌母藥對同種香蕉巴拿馬病菌的EC50和EC90值分別為1.81×105CFU/mL和128.40×105CFU/mL，EC50值與供試枯草芽孢桿菌原粉基本一致(±10％以內(nèi))，符合此類產(chǎn)品的常規(guī)活性特征。

表4枯草芽孢桿菌對香蕉巴拿馬病菌的室內(nèi)生物活性測定數(shù)據(jù)(cm，平皿法)

注：菌落直徑增加值＝菌落直徑值(0.5cm)抑菌率(％)(CK增加值-處理增加值)/CK增加值×100％

表5枯草芽孢桿菌對香蕉巴拿馬病菌的毒力(平皿法)

注：EC50/EC90機(jī)器95％置信限濃度單位均為×10⁵CFU/mL

本實(shí)施例結(jié)論為枯草芽孢桿菌原粉對香蕉巴拿馬病菌抑制活性為EC50值和EC90值分別為1.64CFU/mL和1.56.78CFU/mL，與使用的同類產(chǎn)品的母藥的生物活性差異不明顯，即達(dá)到了其防治水平。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。