調(diào)節(jié)(特別是蛋白質(zhì)活性的抑制)在科學(xué)、醫(yī)學(xué)和技術(shù)的多個(gè)領(lǐng)域中具有重要意義。

在細(xì)胞和組織保存中，對(duì)于相應(yīng)制劑的永久性儲(chǔ)存重要的是使發(fā)揮功能性或催化功能的此類蛋白質(zhì)的活性完全失活，以防止組織降解。同時(shí)，需要保持結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)完整以保存生物材料的完整性和形狀。而且在保存藥物制劑或食品或動(dòng)物飼料產(chǎn)品的領(lǐng)域中，對(duì)功能性或非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的抑制對(duì)于持續(xù)的耐久性是重要的。

功能性蛋白質(zhì)的失活在技術(shù)發(fā)酵和生物過程工程、生命和農(nóng)業(yè)科學(xué)領(lǐng)域以及在醫(yī)學(xué)應(yīng)用(例如與毒素、激素和炎癥介質(zhì)的失活有關(guān))中也起到關(guān)鍵作用。

在現(xiàn)有技術(shù)中，為了調(diào)節(jié)或抑制非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(特別是酶)的活性，使用了醛如甲醛，或?qū)Φ鞍踪|(zhì)顯示出變性作用的去污劑，例如十二烷基硫酸鈉(SDS)、或鏈長為C₁₂的其他離子表面活性劑。然而，醛具有高急性毒性。它們被認(rèn)為是致癌、致突變和強(qiáng)致敏。因此，近來醛類再次成為批評(píng)的對(duì)象。此外，醛不僅對(duì)具有酶促活性的蛋白質(zhì)具有強(qiáng)烈的作用，而且還通過經(jīng)由交聯(lián)改變其結(jié)構(gòu)對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)具有強(qiáng)烈的作用。SDS和鏈長度為C₁₂的離子表面活性劑傾向于沉淀，并因此在電解質(zhì)濃度增加的環(huán)境中，特別是與金屬離子例如Ca⁺⁺、Mg⁺⁺或K⁺有關(guān)的環(huán)境中傾向于損失它們的活性。因此，它們不適合在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中使用。強(qiáng)烈變性作用的去污劑也被認(rèn)為是高度致敏的，因此對(duì)健康有害。非強(qiáng)烈變性的去污劑，例如脂肪醇如Triton X100，不適用于功能性蛋白質(zhì)的失活，正因?yàn)槿绱?，它們被用于蛋白質(zhì)增溶。

針對(duì)這種背景，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新的組合物或新的活性劑，其適合于調(diào)節(jié)非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的活性，但是不包括目前在現(xiàn)有技術(shù)中所使用的組合物或化合物的缺點(diǎn)。

該目的由用于調(diào)節(jié)非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)活性之包含式I的5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物的組合物實(shí)現(xiàn)：

其中

R₁選自：

C₁-C₆的直鏈烷基殘基，

R₂和R₃選自：

H，XH，

在每個(gè)中：

n＝0-20，

m＝1-25，且

X＝O或S。

該目的也通過上述式(I)的5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物來實(shí)現(xiàn)。

如本發(fā)明人所注意到的，5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物具有調(diào)節(jié)非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)活性的優(yōu)異特征。同時(shí)，5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物僅具有顯著小于目前使用的醛或去污劑或表面活性劑的健康問題。

已經(jīng)證明有利的是，所鑒定的效果是劑量依賴性的。因此，非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)可以以靶向方式調(diào)節(jié)到預(yù)期的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，并且開辟了大量的應(yīng)用可能性。

可以根據(jù)本領(lǐng)域中通常已知的方法，例如根據(jù)DE 3 410 956中所述的方法，生產(chǎn)5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物。此外，本發(fā)明人能夠開發(fā)用于生產(chǎn)5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物的新方法，其與甚至更少的生產(chǎn)費(fèi)用相關(guān)聯(lián)。

根據(jù)本發(fā)明，5-氧代-吡咯烷-2-羧酸的“衍生物”是其派生物其可以通過對(duì)5-氧代-吡咯烷-2-羧酸化學(xué)修飾獲得。衍生物仍然包含吡咯烷的雜環(huán)，然而，衍生物特別是它們的烷基殘基方面，可以彼此不同。在衍生物中，吡咯烷的雜環(huán)可以在多個(gè)位置包含官能團(tuán)，例如優(yōu)選在3和4位。根據(jù)本發(fā)明，包括由其形成的S對(duì)映異構(gòu)體和R對(duì)映異構(gòu)體或外消旋體?！?-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物”還包括5-氧代-吡咯烷-2-碳酯衍生物，其也稱為焦谷氨酸酯衍生物。

根據(jù)本發(fā)明，“非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)”是指在生物的組織或細(xì)胞中不起結(jié)構(gòu)材料作用的這些蛋白質(zhì)。因此，非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)特別是具有催化功能的這些蛋白質(zhì)，例如酶，以及肽、肽激素、受體、細(xì)胞因子、肽毒素等。

根據(jù)本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還適用于調(diào)節(jié)核酸分子(例如核酶、適配體、siRNA等)的催化活性以及類固醇激素的活性。

根據(jù)本發(fā)明，“調(diào)節(jié)”涉及變化。因此，“調(diào)節(jié)非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的活性”應(yīng)理解為蛋白質(zhì)的功能在其天然環(huán)境中的靶向變化。

根據(jù)本發(fā)明的組合物的特征、特性、優(yōu)點(diǎn)和其他開發(fā)也相應(yīng)地適用于5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物。

本發(fā)明的目的隨之完全得到了實(shí)現(xiàn)。

根據(jù)本發(fā)明的組合物或根據(jù)本發(fā)明的5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物的一個(gè)特定實(shí)施方案，所述調(diào)節(jié)是抑制，優(yōu)選失活。

該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：可以以靶向方式減少或甚至關(guān)閉蛋白質(zhì)活性(例如酶促或催化種類的蛋白質(zhì)活性)，而結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)仍然在賦予細(xì)胞其形狀和賦予組織其穩(wěn)定性和彈性的狀態(tài)。這在細(xì)胞和組織保存領(lǐng)域中尤其重要。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是酶。

該方法還具有以下優(yōu)點(diǎn)：根據(jù)本發(fā)明的組合物或根據(jù)本發(fā)明的5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物以靶向方式抑制或關(guān)閉催化活性，而結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)仍然發(fā)揮其生物力學(xué)和物理性質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選所述酶選自：氧化還原酶，例如醇脫氫酶；水解酶，例如堿性磷酸酶、內(nèi)切蛋白酶、RNA酶、DNA酶、脂肪酶；轉(zhuǎn)移酶；裂合酶；異構(gòu)酶；連接酶。

該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：這些酶以靶向方式被抑制或完全關(guān)閉，這在保存或醫(yī)學(xué)意義上是非常重要的。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物是式II的葡糖魚精蛋白(Glucoprotamin)：

通過這種方法，使用了這樣的5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物，其在現(xiàn)有技術(shù)中目前主要在臨床上用作表面消毒劑。葡糖魚精蛋白是由幾種組分組成的物質(zhì)。葡糖魚精蛋白最重要的兩個(gè)組分和主要活性劑是(2S)-吡咯烷-5-氧代-羧酸酰胺，N-3-(十二烷基氨基)-丙基和(2S)-吡咯烷-5-氧代-羧酸酰胺，N-3-(十四烷基氨基)丙基。葡糖魚精蛋白(CAS編號(hào)164907-72-6)也被稱為胺，N-C12-14-烷基亞丙基二-，L-谷氨酸。在式(II)中，括號(hào)表示可存在長鏈或短鏈烷基殘基，特別是C12和C14，其存在于混合物中。對(duì)于C12殘基，葡糖魚精蛋白具有分子式C₂₀H₃₉N₃O₂，且分子量為353.55，對(duì)于C14殘基，其具有分子式C₂₂H₄₃N₃O₂，且分子量為381.61。

葡糖魚精蛋白的特征分別在于其對(duì)高蛋白質(zhì)負(fù)荷的不敏感性、低毒性或生態(tài)毒性，其可以快速和完全降解。其易溶于水，并且長時(shí)間穩(wěn)定。在一項(xiàng)研究中，甚至在儲(chǔ)存8年后也不會(huì)顯示出活性損失。其由例如Ecolab Germany GmbH，Düsseldorf公司銷售。

根據(jù)本發(fā)明的葡糖魚精蛋白的適用性是令人驚訝的并且未預(yù)期到的。在現(xiàn)有技術(shù)中，消毒活性的機(jī)制被假定為破壞細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜和包膜病毒的包膜；Meyer和Kluin(1999)，Efficiency of glucoprotamin-containing desinfectants against different species of atypical microbacteria，J.Hosp.Infect.42(2)，151-154頁。通過與顆粒的蛋白質(zhì)衣殼中親脂基團(tuán)的相互作用來解釋對(duì)裸露親脂性病毒的活性；參見von Rheinbaben和Meyer(2008)，Glucoprotamin.于：Kramer和Assadin(編)，Praxis der Sterilisation，Desinfektion，Antiseptik和Konservierung，第6版，Stuttgart，New York：Georg Thieme Verlag KG，786-787頁。

在現(xiàn)有技術(shù)中葡糖魚精蛋白用于調(diào)節(jié)和抑制非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)活性的適用性既沒有描述也沒有顯而易見。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的組合物或5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物用作防腐劑和/或固定劑。

本發(fā)明人證明所述組合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物適合于保存組織、器官和全身制品而不使用醛。對(duì)在組織裂解中起作用的幾類酶的全面和同時(shí)滅活允許對(duì)生物材料的新型保存。本發(fā)明人可以在其實(shí)驗(yàn)中證明，在用根據(jù)本發(fā)明的組合物處理后，器官和全身制品兩者在其結(jié)構(gòu)完整性方面幾乎沒有變化。即使幾個(gè)月后，全身制品也可以以具有真實(shí)觸覺的品質(zhì)保存，這是迄今為止從未達(dá)到的。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的特征使得所述組合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物也預(yù)期用于化妝品、食品或藥物產(chǎn)品的防腐劑。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，配置組合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物以用作藥物組合物。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的抑制活性使得組合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物特別適合用作藥物制劑。根據(jù)本發(fā)明的組合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物可用于以靶向方式抑制激素、抗體、細(xì)胞因子、干擾素、白細(xì)胞介素、趨化因子、生長因子、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、受體、核酶和其他介導(dǎo)疾病的酶的活性。

本發(fā)明可以以靶向方式針對(duì)慢性炎性疾病使用，例如通過產(chǎn)生消炎環(huán)境，例如針對(duì)慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。這可例如通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射根據(jù)本發(fā)明的組合物或5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物或用其灌洗來實(shí)現(xiàn)。另一些實(shí)例是慢性炎性腸病，例如克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎、慢性阻塞性肺病、慢性皮膚和粘膜疾病、或自身免疫病。

此外在急性炎癥過程中，本發(fā)明被用于例如傷口清創(chuàng)術(shù)或灌洗的情況下。

組合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物也可以用于腫瘤學(xué)、免疫學(xué)和變態(tài)反應(yīng)學(xué)領(lǐng)域，例如用于細(xì)胞因子或趨化因子的失活或者用于激素的失活。

在化妝品和個(gè)人護(hù)理或抗衰老領(lǐng)域中，也會(huì)應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的組合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物。它們可用于失活產(chǎn)生氣味的酶，因此可用作除臭劑的組分。此外，通過根據(jù)本發(fā)明的組合物或5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物，可以以靶向方式使彈性蛋白酶和/或膠原酶失活，并且通過這樣做，可以預(yù)防皮膚衰老的跡象。因此，根據(jù)本發(fā)明的組合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物可以用作乳霜、軟膏、洗劑和其他表面應(yīng)用制劑的組分。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，配置組合物或5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物以用作殺生物劑，所述殺生物劑優(yōu)選選自：殺蟲劑、殺卵劑、殺螨劑、殺軟體動(dòng)物劑、殺線蟲劑、驅(qū)腸蟲藥(Anthelminthikum)、除草劑、滅藻劑、殺菌劑(Graminizid)和殺樹劑(Arborizid)。

該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：組合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物可以用于生命和農(nóng)業(yè)科學(xué)中的靶向應(yīng)用中，并且由于它們以靶向方式對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)特別是對(duì)酶的調(diào)節(jié)或抑制活性，因而可以在其中示出作用。通過對(duì)生物體的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的靶向抑制而關(guān)閉其代謝活性，并且因此喪失其損傷作用。

根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，配置根據(jù)本發(fā)明的組合物和根據(jù)本發(fā)明的5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物以用作發(fā)酵助劑。

通過這種方法，實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明在食品和半成品食品生產(chǎn)中的靶向應(yīng)用。通過靶向抑制發(fā)酵酶，可以精確控制發(fā)酵過程。此外，在技術(shù)發(fā)酵和生物過程工程中，特別是在生物乙醇、化學(xué)品或藥物生產(chǎn)、青貯飼料技術(shù)、沼氣工廠或生物反應(yīng)器工廠中的用途也包括在本發(fā)明中。

此外在組織工程領(lǐng)域中，通過產(chǎn)生無酶和抗炎環(huán)境使用根據(jù)本發(fā)明的組合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，配置組合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物為表面涂層劑。

例如OH、SH或光反應(yīng)性基團(tuán)的官能團(tuán)，可以連接在例如吡咯烷環(huán)的3位和4位處。這允許在醫(yī)藥和生物技術(shù)領(lǐng)域的產(chǎn)品開發(fā)和應(yīng)用中，使用根據(jù)本發(fā)明的組合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物作為表面涂層。在該情況中，特別考慮涂覆的醫(yī)療裝置，例如螺紋材料、支架、關(guān)節(jié)植入物和傷口敷料。涂層可以例如通過粘附實(shí)現(xiàn)，但也可以通過5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物的共價(jià)結(jié)合或固定來實(shí)現(xiàn)。

不言而喻，在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下，前面提到的特征和下面要解釋的特征不僅可以在每種情況下所指示的組合中使用，而且可以在其他組合中或在分離的情況下使用。

現(xiàn)在通過更詳細(xì)的實(shí)施方案來解釋本發(fā)明，這將產(chǎn)生其他特征、特性和優(yōu)點(diǎn)。這些實(shí)施方案僅僅是舉例說明，并且不限制本發(fā)明的范圍。

參考示出以下內(nèi)容的附圖：

圖1：醇脫氫酶(ADH)反應(yīng)的反應(yīng)過程。ADH被葡糖魚精蛋白完全抑制(正方形；n＝3；誤差條＝SEM)。無葡糖魚精蛋白的對(duì)照的動(dòng)力學(xué)(圓圈；n＝3；誤差條＝SEM)示出，在測(cè)試中所使用的底物/輔酶以飽和濃度存在。

圖2：葡糖魚精蛋白對(duì)堿性磷酸酶(ALP)的濃度依賴性調(diào)節(jié)。與不含葡糖魚精蛋白的陽性對(duì)照(ALP陽性)相比，與葡糖魚精蛋白(glucoprotamin，GP)孵育20分鐘導(dǎo)致ALP依賴于其濃度的失活(n＝3；誤差條＝SEM)。

圖3：與福爾馬林和醇/甘油相比，葡糖魚精蛋白對(duì)內(nèi)切蛋白酶的失活。用葡糖魚精蛋白處理多種大鼠器官(Wistar大鼠；出生后3天)導(dǎo)致內(nèi)切蛋白酶的失活；沒有歸一化的相對(duì)熒光活性(RFU/分鐘/mg蛋白質(zhì))可如在用福爾馬林的處理中測(cè)量。在用醇/甘油處理中，仍然可以檢測(cè)腎臟和結(jié)腸中內(nèi)切蛋白酶的活性(n＝3)。

圖4：實(shí)時(shí)檢測(cè)葡糖魚精蛋白對(duì)RNA酶的失活。(A)與未處理的RNA酶A(圓圈，n＝3，誤差條＝SEM)相比，用葡糖魚精蛋白處理導(dǎo)致RNA酶A的失活(正方形；n＝3，誤差條＝SEM)。(B)葡糖魚精蛋白使污染的工作區(qū)域的RNA酶失活(正方形，n＝3，誤差條＝SEM)(陽性對(duì)照；圓圈，n＝3，誤差條＝SEM)。這種失活可以與市售溶液的去污效果相比較：(C)RNAseZap(三角形，n＝3，誤差條＝SEM)和(D)RNase-ExitusPlus(三角形，n＝3，誤差條＝SEM)。(B)-(D)用無核酸酶的水處理的陽性對(duì)照(圓圈)工作區(qū)。

圖5：實(shí)時(shí)檢測(cè)葡糖魚精蛋白對(duì)脂肪酶的失活。(A)葡糖魚精蛋白使牛脂蛋白脂肪酶失活(正方形，n＝3，誤差條＝SEM)；而在陽性對(duì)照中，脂肪酶活性隨時(shí)間相對(duì)地提高(圓圈，n＝3，誤差條＝SEM)。(B)葡糖魚精蛋白使來自皮下脂肪組織的人脂肪酶失活(正方形，n＝3，誤差條＝SEM)。從人脂肪組織獲得的脂肪酶的活性隨時(shí)間相對(duì)地提高(圓圈，n＝3，誤差條＝SEM)。

圖6：與用福爾馬林保存相比，用葡糖魚精蛋白保存來自大鼠(Wistar，出生后，31天)的器官。

圖7：死亡后7個(gè)月，經(jīng)動(dòng)脈輸注葡糖魚精蛋白后身體供體之打開的胸部位置。

圖8：死亡后7個(gè)月，經(jīng)動(dòng)脈輸注葡糖魚精蛋白后身體供體之打開的左心室。

實(shí)施方案

1.生產(chǎn)5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物

在DE 34 10 956中通過葡糖魚精蛋白的實(shí)例描述了5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物的生產(chǎn)，該文件的內(nèi)容被并入本文并且作為本申請(qǐng)的主題。

此外，本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了用于生產(chǎn)5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物的改進(jìn)方法。

所述反應(yīng)用以下起始物質(zhì)進(jìn)行

I.5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物(優(yōu)選S對(duì)映異構(gòu)體，但也可以是R對(duì)映異構(gòu)體或外消旋體)和

II.N取代的單胺(2.3)和/或二胺(2.2)和/或脂肪酰胺(2.3)。

a)用N取代的單酰胺轉(zhuǎn)化5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物

殘基的定義：

R₁＝C_1-6，優(yōu)選C₁的直鏈烷基殘基；

R₂＝鏈長為C_2-22的直鏈烷基殘基，其中包括單不飽和和多不飽和的烷基殘基。

方案1：用N取代的單酰胺轉(zhuǎn)化5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物

該反應(yīng)僅需要60℃的優(yōu)選溫度，60分鐘的優(yōu)選反應(yīng)時(shí)間，和300-350mbar的優(yōu)選壓力。蒸餾除去甲醇。

b)用N取代的二胺轉(zhuǎn)化5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物

殘基的定義：

n＝1-6，

R₁＝C_1-6，優(yōu)選C₁的直鏈烷基殘基；

R₂＝鏈長為C_2-22的直鏈烷基或?；鶜埢?，其中包括單不飽和和多不飽和烷基和?；鶜埢?。

方案2：用N-取代的二胺轉(zhuǎn)化5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物

該反應(yīng)僅需要60℃的優(yōu)選溫度，60分鐘的優(yōu)選反應(yīng)時(shí)間，和300-350mbar的優(yōu)選壓力。蒸餾除去甲醇。

c)用N取代的脂肪酰胺轉(zhuǎn)化5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物

殘基的定義：

R₁＝C_1-6，優(yōu)選C₁的直鏈烷基殘基；

R₂＝鏈長為C_2-24的直鏈烷基殘基，其中包括單不飽和和多不飽和的烷基殘基。

方案3：用N取代的脂肪酰胺轉(zhuǎn)化5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物

該反應(yīng)僅需要60℃的優(yōu)選溫度，60分鐘的優(yōu)選反應(yīng)時(shí)間，300-350mbar的優(yōu)選壓力。蒸餾除去甲醇。

用這種新方法，本發(fā)明人成功地生產(chǎn)了稱為葡糖魚精蛋白的5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物。

在根據(jù)本發(fā)明的方法中，歸屬于活性劑葡糖魚精蛋白的兩種活性物質(zhì)，即(2S)-吡咯烷-5-氧代-羧酸酰胺，N-3-(十二烷基氨基)丙基，和(2S)-吡咯烷-5-氧代-羧酸酰胺，N-3-(十四烷基氨基)丙基，不是通過直鏈起始物質(zhì)L-谷氨酸或其酯衍生物與脂肪胺混合物十二烷基/十四烷基亞丙基二胺(也稱為椰油基丙烯-1，3-二胺)的反應(yīng)產(chǎn)生的，而是通過已經(jīng)是環(huán)狀的起始產(chǎn)物5-氧代-吡咯烷-2(S)-羧酸甲酯(也稱為L-焦谷氨酸甲酯)與椰油基丙烯-1，3-二胺的反應(yīng)，僅在約60℃、約60分鐘和約300至350mbar下產(chǎn)生，并通過蒸餾除去甲醇。

方案4：從5-氧代-吡咯烷-2(S)-羧酸甲酯和椰油基丙烯-1，3-二胺合成葡糖魚精蛋白

以此目的，在60℃的水浴中將251g(1mol)椰油基丙烯-1，3-二胺(CAS編號(hào)6171-63-7)(70mol％十二烷基亞丙基二胺，30mol％十四烷基亞丙基二胺)熔化。然后添加143.14g(1mol)5-氧代-吡咯烷-2(S)-羧酸甲酯，并在330mbar的減壓下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中在60℃下進(jìn)行反應(yīng)1小時(shí)。將反應(yīng)中產(chǎn)生的甲醇(32g)蒸餾掉。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在60℃下是液體粘膠，并在室溫下凝固成米黃色蠟狀糊狀物。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的熔化溫度為60-70℃。

對(duì)合成產(chǎn)物的分析證實(shí)了葡糖魚精蛋白物質(zhì)。高分辨率質(zhì)譜法的結(jié)果顯示，測(cè)試物質(zhì)的質(zhì)量偏差僅為[M+H]+＝253g/mol(2S)-吡咯烷-5-氧代-羧酸酰胺，N-3-(十二烷基氨基)丙基，和[M+H]+＝286g/mol(2S)-吡咯烷-5-氧代-羧酸酰胺，N-3-(十四烷基氨基)丙基的理論質(zhì)量的0.01至0.04ppm。

1H和13C NMR結(jié)構(gòu)分析示出了與理論上預(yù)測(cè)的光譜(Scifinder/ChemDraw 13.0)的對(duì)應(yīng)性。

由于其溫和的反應(yīng)條件，新的生產(chǎn)方法允許使用長鏈和/或不飽和的且因此易損的碳鏈，而在合成反應(yīng)的情況下不會(huì)具有分解或氧化的風(fēng)險(xiǎn)。此外，在新的生產(chǎn)方法中，可以使用“化學(xué)組裝”的起始物質(zhì)。此外，復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)成為可能，而不影響合成反應(yīng)。

d)修飾5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物

起始物質(zhì)5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物和N取代的單胺、二胺和脂肪酰胺衍生物應(yīng)當(dāng)被修飾，其目的是對(duì)合成產(chǎn)物的活性劑的動(dòng)力學(xué)、活性劑的動(dòng)態(tài)和活性劑的性能產(chǎn)生影響。

可以在吡咯烷環(huán)的3和4位修飾起始物質(zhì)5-氧代-吡咯烷-2-羧酸。

在吡咯烷環(huán)的3位和/或4位處例如被保護(hù)的羥基或巰基的連接允許將活性物質(zhì)與多種材料的表面偶聯(lián)。這允許將所產(chǎn)生的活性劑用作表面涂層。

方案5：通過連接(a)羥基和/或(b)巰基來修飾5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物。示出了4位處的羥基和3位處的巰基的實(shí)例。R₁代表C_1-6，優(yōu)選C₁的直鏈烷基殘基。

例如光反應(yīng)性基團(tuán)的連接可以允許對(duì)活性物質(zhì)的條件性修飾

方案6：通過連接光反應(yīng)性基團(tuán)來修飾5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物。示出3位和4位處的兩個(gè)實(shí)例。R₁代表C_1-6，優(yōu)選C₁的直鏈烷基殘基。

溫和的新生產(chǎn)方法還允許例如使用具有多個(gè)鏈長并且也處于不飽和狀態(tài)的烷基殘基。鏈長的修飾可導(dǎo)致活性劑譜的變化。

(1)二胺，(2)單胺，(3)脂肪酰胺

其中R₂＝

·鏈長為C_2-22的直鏈烷基殘基

·單不飽和和/或多不飽和烷基殘基

·在(1)中還包括單不飽和和/或多不飽和?；鶜埢?/p>

·n＝1-6

方案7：表示經(jīng)修飾的單胺、二胺和脂肪酰胺基團(tuán)。

2.通過葡糖魚精蛋白調(diào)節(jié)/失活多種酶類的代表

2.1氧化還原酶(1類酶；EC1)

醇脫氫酶(ADH；EC1.1.1.1)的失活

測(cè)量原理：酶醇脫氫酶(ADH)催化乙醇向乙醛的可逆轉(zhuǎn)化，并同時(shí)催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)還原成NADH。雖然醇向醛的轉(zhuǎn)化不能被直接檢測(cè)，但是NADH的形成可以在光度計(jì)上進(jìn)行光學(xué)監(jiān)測(cè)。在340nm處的吸收的增加是醇轉(zhuǎn)化的直接量度，并且因此是ADH活性的直接量度。為了測(cè)試葡糖魚精蛋白對(duì)ADH的失活，向可商購的NAD-ADH試劑(NAD-ADH試劑多重測(cè)試小瓶；Sigma Aldrich；德國)添加2.6％的葡糖魚精蛋白，并在37℃下孵育10分鐘。然后將1％乙醇添加至混合物作為底物，并立即在Infinite M200微板讀數(shù)器(Tecan，瑞士)中在340nm下測(cè)定ADH活性。將得到的ADH動(dòng)力學(xué)相對(duì)于沒有葡糖魚精蛋白的對(duì)照進(jìn)行作圖(圖1)。在比色分析的ADH動(dòng)力學(xué)中顯示的結(jié)果示出葡糖魚精蛋白使ADH完全失活。

2.2水解酶(3類酶；EC3)

堿性磷酸酶(EC3.1.3.1)的失活

測(cè)量原理：堿性磷酸酶(ALP)在堿性條件下催化磷酸酯水解成有機(jī)自由基和無機(jī)磷酸鹽。通過磷酸對(duì)硝基苯酯(pNPP)的裂解進(jìn)行ALP活性的檢測(cè)。黃色硝基苯酚鹽的形成可以通過測(cè)量405nm下的吸收直接監(jiān)測(cè)。

為了測(cè)試葡糖魚精蛋白對(duì)ALP的失活，使用了市售的測(cè)試系統(tǒng)(堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒；Abcam，美國)。為此目的，將試劑盒系統(tǒng)中包含的ALP在37℃下與2.6％、5.2％、7.8％和10.4％葡糖魚精蛋白孵育20分鐘。同時(shí)，使用沒有葡糖魚精蛋白的相同酶濃度的陽性對(duì)照，并像其他樣品一樣孵育并測(cè)量。在添加1mM pNPP后，將樣品再孵育30分鐘，然后在Infinite M200微板讀數(shù)器中測(cè)定405nm下的吸收(圖2)。該終末時(shí)間測(cè)量的值示出葡糖魚精蛋白對(duì)ALP的失活，其是濃度依賴性的。

內(nèi)切蛋白酶的失活

測(cè)量原理：還通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET)肽文庫測(cè)量內(nèi)切蛋白酶的活性，所述文庫含有超過250萬種肽(Kapprell等(2011)，Assay and Drug Development Technologies)。該蛋白酶檢測(cè)的原理基于作為供體的MCA熒光團(tuán)和作為淬滅劑的2，4-二硝基苯基殘基，其與肽偶聯(lián)。一旦蛋白酶切割肽，供體和淬滅劑就彼此分離，并發(fā)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。因此，蛋白酶活性與相對(duì)熒光強(qiáng)度的提高成正比。

為了測(cè)定葡糖魚精蛋白對(duì)內(nèi)切蛋白酶的失活，將大鼠(Wistar大鼠，出生后3天)的9種(每種3次)不同器官與2.6％葡萄糖胺，4％福爾馬林，或與醇/甘油溶液(70％醇/30％甘油)孵育。然后將這些器官在Tris緩沖液(pH 7.4)中均化。將未固定的、新鮮制備的大鼠器官(n＝3)用作陽性對(duì)照。在測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(Qubit Protein Assay，Life Technologies，德國)后，將混合物離心，并將10μl上清液添加至80μl Tris緩沖液和10μl基于FRET的肽文庫。立即通過Infinite M200微板讀數(shù)器測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度(RFU)。以蛋白質(zhì)濃度歸一化的每時(shí)間單位的相對(duì)熒光強(qiáng)度(梯度)示出葡糖魚精蛋白使內(nèi)切蛋白酶失活，其類似于福爾馬林對(duì)內(nèi)切蛋白酶的失活。腎臟和結(jié)腸中的醇/甘油固定不導(dǎo)致內(nèi)切蛋白酶的完全失活，而僅導(dǎo)致蛋白酶活性的降低(圖3)。在所有器官的陽性對(duì)照中，均可以鑒定到內(nèi)切蛋白酶的活性。

RNA酶的失活

測(cè)量原理：可以根據(jù)FRET原理(RNaseAlert實(shí)驗(yàn)室測(cè)試試劑盒；Applied Biosystems，德國)，通過可切割的熒光標(biāo)記的RNA酶底物來確定RNA酶的活性。底物是經(jīng)修飾的RNA寡核苷酸，當(dāng)其被RNA酶切割時(shí)發(fā)射綠色熒光。因此，RNA酶活性與熒光強(qiáng)度的提高成正比。

為了測(cè)定葡糖魚精蛋白對(duì)RNA酶的失活，選擇了兩種不同的方法。首先根據(jù)制造商的信息將來自商業(yè)測(cè)試系統(tǒng)(RNaseAlert實(shí)驗(yàn)室測(cè)試試劑盒)的5μl RNA酶A(約2pg)添加至2.6％葡糖魚精蛋白，并在37℃下孵育10分鐘。對(duì)于陽性對(duì)照，添加無核酸酶的水來代替葡糖魚精蛋白，而其余的以相同的方式處理。添加熒光標(biāo)記的底物后，通過Infinite M200微板讀數(shù)器實(shí)時(shí)測(cè)定RNA酶活性。在20分鐘的測(cè)量時(shí)間段內(nèi)，在用葡糖魚精蛋白處理的混合物中沒有檢測(cè)到相對(duì)熒光強(qiáng)度(RFU)的提高，其因而示出葡糖魚精蛋白使RNA酶A失活(圖4A)。在陽性對(duì)照中，可以鑒定到持續(xù)的底物飽和的RNA酶活性。

在另一種方法中，實(shí)驗(yàn)室工作場(chǎng)所被人汗液和唾液污染。然后將工作區(qū)分離為相同大小的四個(gè)區(qū)域，并且它們各自進(jìn)行不同處理：無核酸酶水(陽性對(duì)照)，2.6％葡糖魚精蛋白(圖4B)，RNaseZap(Blyde Biosystems的商售RNA酶去污溶液；圖4C)和RNase exitusPlus(德國AppliChem的商售RNA酶去污溶液；圖4D)。孵育10分鐘后，用500ml無核酸酶的水潤洗處理過的區(qū)域兩次。區(qū)域干燥后，將500μl不含核酸酶的水分別均勻分布在工作區(qū)域上，孵育1分鐘并通過移液管除去。將熒光標(biāo)記的底物添加至45μl的這四種不同混合物，并通過Infinite M200微板讀數(shù)器(Tecan，瑞士)實(shí)時(shí)測(cè)定熒光強(qiáng)度的變化，從而測(cè)定RNA酶活性(圖4B-D)。用葡糖魚精蛋白處理工作場(chǎng)所導(dǎo)致汗液和唾液中含有的RNA酶失活，并因此使工作區(qū)域去污。這種完全去污可以與迄今為止的商用去污溶液相比較。然而，在僅用無核酸酶水處理的工作場(chǎng)所(陽性對(duì)照)上，可以確定依賴于時(shí)間的熒光強(qiáng)度的提高，因此可以確定高RNA酶活性。

脂肪酶的失活

測(cè)量原理：脂肪酶將花生酰-1-硫代甘油水解成花生四烯酸和硫代甘油。硫代甘油與硫熒光檢測(cè)器(thiolfluorometrischen Detektor)反應(yīng)成強(qiáng)熒光產(chǎn)物，可以在380至390nm的激發(fā)波長和510至520nm的發(fā)射波長下對(duì)其進(jìn)行分析。

為了測(cè)試葡糖魚精蛋白對(duì)脂肪酶的失活，根據(jù)制造商的信息使用商售測(cè)試系統(tǒng)(脂肪酶活性測(cè)定，Cayman Chemical Company，美國)。進(jìn)行了兩種不同的測(cè)試過程。首先用2.6％的葡糖魚精蛋白補(bǔ)充10μl牛乳脂蛋白脂肪酶，并根據(jù)制造商的信息添加測(cè)定緩沖液和硫醇檢測(cè)器。在陽性對(duì)照中，省略了葡糖魚精蛋白。將這兩種溶液混合物在37℃下孵育15分鐘。然后添加脂肪酶底物，并通過實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光強(qiáng)度(RFU)的變化來測(cè)定脂肪酶活性(圖5A)。葡糖魚精蛋白使牛乳脂蛋白脂肪酶失活。在第二種測(cè)試方法中，在死后取出200mg人的臀部皮下脂肪組織，并用冰冷的PBS通過Precellys陶瓷試劑盒1.4/2.1mm(PeqLab，德國)在微量裂解工作均化器中(PeqLab)于5,000rpm下均化4×10秒。然后將均漿以10,000×g離心10分鐘，移出10μl中間相。該樣品補(bǔ)充有2.6％的葡糖魚精蛋白，或直接添加至硫醇檢測(cè)器的測(cè)定緩沖液(陽性對(duì)照)。將這兩種溶液混合物在37℃下孵育15分鐘，并且如上所述實(shí)時(shí)測(cè)量熒光強(qiáng)度(圖5B)。葡糖魚精蛋白使來自皮下脂肪組織的人脂肪酶失活。

3.保存來自大鼠的器官

為了檢測(cè)葡糖魚精蛋白的防腐活性，從成年Wistar大鼠(出生后，31天)取出器官并進(jìn)行照片存檔。然后將器官在2.6％葡糖魚精蛋白或4％福爾馬林中孵育7天。然后將器官在沒有防腐溶液的情況下另外儲(chǔ)存25天，在室溫下未覆蓋，然后再次進(jìn)行照片存檔和評(píng)估(圖6)。葡糖魚精蛋白保存的器官示出與福爾馬林固定的器官相當(dāng)?shù)谋４?，但它們保持其組織彈性。

4.人全身制品的保存

在根據(jù)解剖身體捐贈(zèng)的實(shí)踐(倫理委員會(huì)表決237/2007B01和1970年7月21日的巴登-符騰堡州的殯葬法)，與福爾馬林固定類似地檢查在單個(gè)酶水平上的結(jié)果和動(dòng)物模型中的器官固定的結(jié)果(器官摘除后的浸入固定)的可用性之后，向身體供體的尸體經(jīng)由股動(dòng)脈(A.femoralis)動(dòng)脈內(nèi)輸注17l的2.5％葡糖魚精蛋白/20％乙醇溶液，泵性能為1bar。

將全身制品用帶有上述溶液的濕布包裹并密封在箔中。在2周、1個(gè)月、3個(gè)月和7個(gè)月后進(jìn)行組織的一致性和組織狀態(tài)的控制。

2周和1個(gè)月后的檢查

沒有發(fā)現(xiàn)裂解的跡象，組織結(jié)構(gòu)保持未改變，與福爾馬林固定相反，觸覺接近真實(shí)情況。

3個(gè)月后的侵入性檢查

進(jìn)行診斷性腹腔鏡檢查，然后通過中位剖腹術(shù)進(jìn)行開放手術(shù)檢查。結(jié)果：胃腸道是完整的，沒有發(fā)生裂解的跡象。進(jìn)行的微生物涂片測(cè)試示出腹腔內(nèi)的隱窩和結(jié)腸區(qū)域的腹膜內(nèi)空間無菌。

在骨科手術(shù)的情況中，進(jìn)行肩關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)鏡檢查。關(guān)節(jié)空間保存接近真實(shí)，對(duì)于觸覺而言，韌帶和軟骨的結(jié)構(gòu)接近真實(shí)。

7個(gè)月后的侵入性檢查

7個(gè)月后，進(jìn)行解剖學(xué)的覆蓋原位制備(圖7和8)以打開并檢查整個(gè)腹部區(qū)域。所有的器官都保存下來。此外，本身具有高含量消化酶的器官(例如胰腺)也保持其形態(tài)完整性。打開左心，檢查心內(nèi)膜空間(圖8)。甚至精細(xì)的結(jié)構(gòu)(例如房室瓣、腱索)也保存的接近真實(shí)。

同樣在7個(gè)月后，可以發(fā)現(xiàn)良好保存的結(jié)構(gòu)，而沒有發(fā)生裂解的跡象。

5.結(jié)論

本發(fā)明人提供了5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物形式的活性物質(zhì)，例如葡糖魚精蛋白，其可以有多種應(yīng)用，并且通過其可以調(diào)節(jié)(優(yōu)選抑制)非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的活性。該物質(zhì)與目前使用的醛、去污劑和表面活性劑相比具有顯著較小的健康問題。