本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種黑曲霉(Aspergillusnigerxj)泡騰片及其制備方法。
背景技術(shù)：
：黑曲霉是一種常見的真菌，屬于半知類曲霉屬。黑曲霉可以廣泛用于加工蛋白制品，飼料加工和廢物處理。本申請(qǐng)是利用黑曲霉在生長過程中所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物來對(duì)煙草青枯病菌進(jìn)行抑制?，F(xiàn)有技術(shù)中有通過黑曲霉防治煙草情況病的實(shí)例，如中國專利CN103146600A公開了利用黑曲霉(Aspergillusniger)Ty-3防治煙草青枯病。但該申請(qǐng)?jiān)诓≡蛛x以及真菌培養(yǎng)條件方面描述并不清楚，如煙草青枯病菌為細(xì)菌，為單菌落，不可能長出菌絲，而且細(xì)菌的種子培養(yǎng)基一般為NA或NB，培養(yǎng)條件偏堿性，而真菌的種子培養(yǎng)基一般為PDA，培養(yǎng)條件偏酸性。因此，上述文獻(xiàn)中培養(yǎng)細(xì)菌的成分和條件來培養(yǎng)真菌并不合適。黑曲霉發(fā)酵液雖然有良好的抗菌活性，但因其液體的性質(zhì)不宜大量儲(chǔ)存與運(yùn)輸，長期儲(chǔ)存時(shí)如保藏不當(dāng)更會(huì)被雜菌污染，對(duì)生防效果及煙草生長產(chǎn)生未知的危害，因此我們對(duì)黑曲霉發(fā)酵液產(chǎn)品進(jìn)行了進(jìn)一步的加工和優(yōu)化。根據(jù)煙草生長及大田生防的具體情況，將黑曲霉發(fā)酵液加工成生防泡騰片劑。泡騰片劑主要應(yīng)用于煙草育苗期階段，因其崩解快速、攜帶方便，按劑量置入水中后能迅速溶解、起效迅速生物利用度高，與單純的液體制劑相比有著良好的儲(chǔ)存運(yùn)輸優(yōu)勢。本發(fā)明人目的在于提供一種易于生產(chǎn)、劑型加工，又利于存活的拮抗菌制劑，將其用于煙草青枯病的防治。所述拮抗菌為黑曲霉(Aspergillusnigerxj)由貴州大學(xué)真菌資源研究所分離，已經(jīng)于2006年3月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，(地址：中國武漢武漢大學(xué))，保藏號(hào)：CCTCCNO：M206021。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是解決黑曲霉的穩(wěn)定性和藥效最優(yōu)化，并且實(shí)現(xiàn)可控制釋放。本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定的控釋黑曲霉泡騰片。本發(fā)明還提供了所述泡騰片的生產(chǎn)方法。本發(fā)明還提供了所述泡騰片的使用方法。本發(fā)明還提供了所述泡騰片作為殺菌劑的應(yīng)用。本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案解決所述技術(shù)問題：為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種拮抗菌，所述拮抗菌為黑曲霉(Aspergillusnigerxj)由貴州大學(xué)真菌資源研究所分離，已經(jīng)于2006年3月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，(地址：中國武漢武漢大學(xué))，保藏號(hào)：CCTCCNO：M206021。一種黑曲霉泡騰片，其包括下述組分：黑曲霉，檸檬酸，碳酸氫鈉，粘合劑和潤滑劑。優(yōu)選地，所述黑曲霉為發(fā)酵濃縮液粗提物粉劑，粘合劑選自質(zhì)量分?jǐn)?shù)50％～70％的蔗糖溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的淀粉漿、PVP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的乙醇溶液中的一種或幾種；潤滑劑選自硬脂酸鎂、滑石粉、微粉硅膠、聚乙二醇6000中的一種或幾種；其中使用的乙醇的體積分?jǐn)?shù)為75％。優(yōu)選地，黑曲霉為8～20重量份，檸檬酸為30～50重量份，碳酸氫鈉為30～45重量份，粘合劑為0.5～5重量份，潤滑劑為0.5～10重量份。優(yōu)選地，所述黑曲霉發(fā)酵濃縮液粗提物粉劑是通過下述方法制備得到：A.取滅菌發(fā)酵液過濾，濃縮至相對(duì)密度為1.12(25℃)，噴霧干燥，干燥條件為：進(jìn)風(fēng)溫度150℃；排氣溫度95℃；流速20mL/s；或B.取滅菌發(fā)酵液過濾，濃縮至相對(duì)密度為1.12(25℃)，置70℃烘箱中，鼓風(fēng)干燥36h，取出后使用高速粉碎機(jī)粉碎，過100目篩既得。優(yōu)選地，所述泡騰片含有黑曲霉發(fā)酵濃縮液粗提物粉劑12重量份、NaHCO339.5重量份、檸檬酸45重量份、聚乙二醇60002重量份、PVP1.5重量份；所述泡騰片的發(fā)泡容量為15mL/g，崩解時(shí)間為1.2min，硬度在7.2Kg-7.7Kg之間。本發(fā)明所述泡騰片可以防治煙草青枯病。附圖說明圖1是浸膏粉及其與不同輔料配伍配方吸濕性的樹狀圖；圖2是粗提粉劑與輔料1∶1時(shí)，不同時(shí)間的吸濕率圖；圖3是三種輔料混合后的臨界吸濕曲線圖。實(shí)施例本發(fā)明根據(jù)下述實(shí)施例做進(jìn)一步的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以明了的是，下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明僅僅起到說明的作用。在不背離本發(fā)明精神的前提下，對(duì)本發(fā)明所做的任意改進(jìn)和替代均在本發(fā)明保護(hù)的范圍之內(nèi)。實(shí)施例1：泡騰片的制備儀器與試劑(如無特別說明，所有儀器與試劑均為常規(guī)市售產(chǎn)品)：電熱真空干燥箱、電熱恒溫干燥箱、天平；LYO-1冷凍干燥設(shè)備(上海東富龍有限公司)、CS101-2A電熱干燥箱(重慶銀河實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、水浴鍋(北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠)、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、循環(huán)水多用真空泵(鄭州杜甫儀器廠)、傾斜式高速萬能粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)、TDP1單沖壓片機(jī)(上海天凡藥機(jī)制造廠)、78X-Z型片劑四用測定儀(上海黃海藥檢儀器廠)。乳糖、甘露醇、MCC、β環(huán)糊精、磷酸氫、鈣糊精、可溶性淀粉、羧甲基纖維素鈉、羧丙甲基纖維素鈉、乙基纖維素、交聯(lián)聚維酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、丙烯酸樹脂、NaHCO3、檸檬酸、發(fā)酵液粗提物、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇6000(PEG6000)、乙醇。黑曲霉發(fā)酵液粗提粉劑的制備：濃縮液制備：將滅菌后的黑曲霉發(fā)酵液過濾后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至相對(duì)密度為1.12(25℃)，無菌條件下裝瓶即用。發(fā)酵液粗提粉劑：A.取滅菌發(fā)酵液過濾，濃縮至相對(duì)密度為1.12(25℃)，噴霧干燥(干燥條件為：進(jìn)風(fēng)溫度150℃；排氣溫度95℃；流速20mL/s)，即得。B.取滅菌發(fā)酵液過濾，濃縮至相對(duì)密度為1.12(25℃)，置70℃烘箱中，鼓風(fēng)干燥36h。取出后使用高速粉碎機(jī)粉碎，過100目篩既得。配方的制作：將所制得的發(fā)酵液粗提物粉劑分別與乳糖、甘露醇、MCC、β環(huán)糊精、磷酸氫、鈣糊精、可溶性淀粉、羧甲基纖維素鈉、羧丙甲基纖維素、乙基纖維素、交聯(lián)聚維酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、丙烯酸樹脂按1∶1混合過100目篩，取適量，作為實(shí)驗(yàn)用的制劑配方。吸濕百分率的測定：將底部盛有氯化鈉過飽和溶液的玻璃干燥器放入25℃，烘箱中恒溫48h，此時(shí)干燥器內(nèi)的相對(duì)濕度為75％，在已恒重的稱量瓶底部放入2g的藥粉，準(zhǔn)確稱重后置于氯化鈉過飽和溶液的干燥器中(稱量瓶蓋打開)，于25℃的恒溫箱中保存，定時(shí)取樣稱重，平行做3份，按下式計(jì)算吸濕百分率：吸濕百分率(％)＝(m吸濕后-m吸濕前)/m吸濕前×100％，取均值。制片：將檸檬酸粉碎，各原輔材料均過80目篩備用。檸檬酸加入粘合劑，用造粒機(jī)造粒，過12目篩；NaHCO3同法造粒。顆粒于45℃鼓風(fēng)干燥4h后，用14目篩整粒。將所得酸粒、堿粒與潤滑劑混合均勻，送入壓片機(jī)壓片，于45℃烘干，得成品。具體配方：黑曲霉發(fā)酵濃縮液粗提物粉劑12重量份、NaHCO339.5重量份、檸檬酸45重量份、聚乙二醇60002重量份、PVP1.5重量份。實(shí)施例2：泡騰片的制備按照實(shí)施例1所述的方法，按照黑曲霉發(fā)酵濃縮液粗提物粉劑20重量份、NaHCO339.5重量份、檸檬酸45重量份、聚乙二醇60002重量份、PVP1.5重量份。實(shí)施例3：泡騰片的制備按照實(shí)施例1所述的方法，按照黑曲霉發(fā)酵濃縮液粗提物粉劑18重量份、NaHCO345重量份、檸檬酸50重量份、聚乙二醇60005重量份、PVP5重量份。實(shí)施例4：各組分選擇的影響因素粘合劑的選擇：為了防止檸檬酸和NaHCO3提前反應(yīng)，需將其分開制粒。制粒所需的粘合劑主要有質(zhì)量分?jǐn)?shù)50％～70％的蔗糖溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％淀粉漿、PVP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的乙醇溶液(乙醇的體積分?jǐn)?shù)為75％)，分別進(jìn)行制粒，考察結(jié)果。片劑粘合劑以物料可操作性、片劑溶解性為評(píng)判指標(biāo)，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)50％～70％的蔗糖溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的淀粉漿、PVP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的乙醇溶液(乙醇體積分?jǐn)?shù)為75％)等不同粘合劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，用PVP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的乙醇溶液作為粘合劑，檸檬酸在制粒過程中不易結(jié)塊，顆粒干燥后不易吸潮，且溶于水后無混濁感，用量約為0.15mL/g。潤滑劑的選擇：在制好的顆粒中分別添加PEG6000、硬脂酸鎂和微粉硅膠進(jìn)行壓片，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。常用的片劑潤滑劑有硬脂酸鎂、滑石粉、微粉硅膠、聚乙二醇6000(PEG6000)等。硬脂酸鎂、滑石粉、微粉硅膠為水不溶性潤滑劑，影響產(chǎn)品的感官質(zhì)量，不宜采用。水溶性潤滑劑PEG6000潤滑性及抗粘性優(yōu)良，且對(duì)泡騰片在水中溶解后的澄清度無影響，宜選用，其添加量為1.5％～2％。泡騰片發(fā)泡容量的測定：取一只燒杯，加200mL熱水，投入泡騰片1片(0.7g)，立即將所產(chǎn)生的氣體導(dǎo)入一倒立的充滿水的100mL量筒中，至不再有氣體產(chǎn)生時(shí)，記錄量筒中氣體的體積，即為發(fā)泡容量。CO2是形成泡騰片發(fā)泡效果的主要成分，發(fā)泡成因源于片中含有的NaHCO3與檸檬酸溶于水后發(fā)生酸堿中和反應(yīng)，產(chǎn)生CO2所致，同時(shí)還產(chǎn)生檸檬酸鈉。檸檬酸鈉為偏堿性的鹽，如生成量過多則抑制發(fā)酵液粗提物的抑菌活性，為使泡騰片表現(xiàn)出一定的起泡效果，泡騰片中NaHCO3與檸檬酸添加量就要適量。泡騰片CO2發(fā)泡量以溶解量計(jì)一般為液體體積的1～1.5倍，經(jīng)測定，泡騰片的發(fā)泡容量為15mL/g。崩解時(shí)限檢查：取泡騰片1片，置250mL燒杯中加入20～55℃水200mL，有大量氣泡放出，當(dāng)氣體停止逸出時(shí)，片劑應(yīng)溶解或分散于水中，無聚集的顆粒殘留。此泡騰片的崩解時(shí)間約為1.2min，滿足大田施用條件，能迅速的溶解在常溫的水中，其溶液清澈透明，無雜質(zhì)沉淀。該泡騰片劑在30d內(nèi)，硬度變化不大，在7.2Kg-7.7Kg之間。符合國家標(biāo)準(zhǔn)，投入水中自溶即可。硬度考察：將各試驗(yàn)條件下制得的泡騰片進(jìn)行鋁塑泡罩包裝，分別于第0日和第30日取樣，測定徑向硬度。輔料吸濕百分率的測定：最短距離聚類法是聚類分析中較簡便常用的方法，適用于中藥領(lǐng)域內(nèi)使用。將下表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照如下步驟，用最短距離聚類法對(duì)發(fā)酵液粗提粉劑及其與不同輔料配伍的吸濕性進(jìn)行分類。全浸膏粉及其與其他13種輔料配伍配方，共計(jì)14種配方為14個(gè)樣品，未聚類前它們自成一類(初始類)，用Gi(i＝1，2，......14)表示，取樣品的吸濕率為指標(biāo)，指標(biāo)值間之差稱為樣品問的距離(相似度)，計(jì)算14個(gè)樣品兩兩間的距離dij(ij分別為1，2......14)得初始距離矩陣D0(對(duì)稱矩陣)。選擇D0中非對(duì)角線上的最小數(shù)，設(shè)為dpq，于是將Gp與GQ合并，得一新GY即GY{Gp，GQ}。計(jì)算新類GY與其他類Gk(k≠p，q)的距離：DYk＝min{dh1/h∈GY，1∈Gk}＝min{Dpk，Dqk}將D0中的p，q行與p，q列劃去，增加構(gòu)成一個(gè)新行和新列，得一個(gè)新矩陣。在新的矩陣中重復(fù)(2)，(3)的工作，最后可把所有樣品都聚成一類。將整個(gè)聚類過程用聚類樹枝圖表示，選定一個(gè)相似度(距離)的臨界水平(閾值)T，并規(guī)定距離比T大的不再聚類，在此水平上可得若干類。由不同時(shí)間的吸濕率圖的結(jié)果可看出，如取相似度的臨界水平T＝2.64，則可分為五類：交聯(lián)羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、交聯(lián)聚維酮為一類，吸濕性最大，粗提粉劑為一類，前期吸濕性較小，后期變化較大，羧丙甲基纖維素、糊精、乙基纖維素、丙烯酸樹脂2、丙烯酸樹脂3可溶性淀粉為一類，吸濕性其次，β環(huán)糊精、甘露醇、MCC、乳糖為一類，前期吸濕性較小，后期小幅度升高。磷酸氫鈣為一類，吸濕性最差。如下表所示。粗提粉劑∶輔料＝1∶1時(shí)，48h內(nèi)吸濕率變化表輔料加入全浸膏藥粉后，吸濕特性都有所改變使用最短距離聚類分析法分析數(shù)據(jù)，借助統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19操作，做出不同類配方的吸濕率關(guān)于時(shí)間變化的折線規(guī)律(如上圖)?？紤]到微丸的脆度及崩解速率，選取了防潮性較好的MCC、乳糖、羥丙基甲基纖維素(HPMCK4M)作為本次實(shí)驗(yàn)的輔料。三種輔料混合后的臨界吸濕度為85％，其臨界吸濕曲線見附圖3。經(jīng)過對(duì)泡騰片劑的發(fā)泡量、崩解時(shí)限、硬度等指標(biāo)進(jìn)行測定后，確定了配方為發(fā)酵濃縮液粗提物粉劑12重量份、NaHCO339.5重量份、檸檬酸45重量份、聚乙二醇60002重量份、PVP1.5重量份。經(jīng)測定，泡騰片的發(fā)泡容量為15mL/g，崩解時(shí)間為1.2min，硬度在7.2Kg-7.7Kg之間。實(shí)施例5：防治煙草青枯病實(shí)施地點(diǎn)：2012年在畢節(jié)市黔西縣對(duì)拮抗真菌進(jìn)行小區(qū)濃度篩選實(shí)驗(yàn)。小區(qū)濃度篩選實(shí)驗(yàn)顯示：拮抗真菌xj菌株的無菌發(fā)酵液5000倍稀釋，相對(duì)防效為58.5％，優(yōu)于化學(xué)藥農(nóng)藥鏈霉素的防效(52.6％)，當(dāng)無菌發(fā)酵液1000倍稀釋(10-3)，田間相對(duì)防效達(dá)到了86.8％，當(dāng)無菌發(fā)酵液100倍稀釋(10-2)，田間相對(duì)防效達(dá)到了95.7％?？梢姡卓拐婢鷛j菌株的防治效果突出，但從節(jié)約生產(chǎn)成本考慮，我們?cè)谶M(jìn)行大田推廣時(shí)，僅發(fā)病嚴(yán)重的地塊，采用100倍稀釋，其余的采用1000倍稀釋。2013年在畢節(jié)市的大方縣響水鎮(zhèn)和七星關(guān)區(qū)燕子口鎮(zhèn)進(jìn)行拮抗菌的推廣應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。在自然感病的情況下，拮抗真菌的防效都達(dá)到了90％以上。苗期施用方法：將黑曲霉xj發(fā)酵液滅菌后(無菌發(fā)酵液)與基質(zhì)按1∶10攪拌混勻，然后植苗，所述基質(zhì)為煙草基質(zhì)育苗標(biāo)準(zhǔn)YC/T310-2009中所用基質(zhì)，另外，所述比例為：1ml發(fā)酵液加到10g基質(zhì)中。將實(shí)施例1中的沸騰片與基質(zhì)按1∶10攪拌混勻?；|(zhì)：特指由有機(jī)物料(包括草炭、腐熟植物秸稈)及天然礦物(珍珠巖、蛭石)為主配制的、用于煙草漂浮育苗生產(chǎn)的人造土壤。最常用的基質(zhì)配方為：泥炭、珍珠巖、園藝蛭石(按體積)1∶1∶1。或7份泥炭+3份蛭石。煙草漂浮育苗基質(zhì)理化指標(biāo)項(xiàng)目要求pH值5.0～7.01-5mm粒徑％≥40容重g/cm30.10～0.35總孔隙度％80～95有機(jī)質(zhì)含量％≥15腐植酸％10～40電導(dǎo)率μs/cm≤1000有效鐵離子含量mg/kg≤1000水分％20～45大田施用方法：將無菌發(fā)酵液按比例1∶100(體積比)與水沖兌后，采用灌根的方式進(jìn)行田間施用2次，每株灌根20毫升。將實(shí)施例1中的沸騰片與水按1∶100(體積比)與水沖兌。病情調(diào)查：病情指數(shù)的調(diào)查共分3次，第1次調(diào)查在大田移栽前，第2次和第3次調(diào)查分別在施藥后7～14天。方法為每塊試驗(yàn)地采用對(duì)角線取樣，取5點(diǎn)，每點(diǎn)100株煙株，記錄下煙株的為害級(jí)數(shù)，并計(jì)算病情指數(shù)。病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T39-1996規(guī)定執(zhí)行。各種形式的黑曲霉防治煙草青枯病的效果如下表所示。當(dāng)前第1頁1 2 3