動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根的方法，1）初始培養(yǎng)基與營養(yǎng)添加液體積比為2～3﹕1；初始培養(yǎng)基為 3/4SH培養(yǎng)基+ IBA 3mg/L+蔗糖20-35g/L；營養(yǎng)添加液為3/4SH培養(yǎng)基+蔗糖90-120g/L；2）將初始培養(yǎng)基加入鼓泡式生物反應(yīng)罐中，接種；3）通氣培養(yǎng)；4）培養(yǎng)到第5～10天，滴加營養(yǎng)添加液，3-5天滴完；5）繼續(xù)培養(yǎng)到第30～42天，收獲不定根?？筛鶕?jù)需要實時滴加營養(yǎng)成份，鼓泡式生物反應(yīng)罐在上升的氣泡作用下，實現(xiàn)了氣動攪拌，可以將營養(yǎng)添加液充分混合到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，可定向獲得縮短培養(yǎng)時間、提高不定根的產(chǎn)量、總皂苷的含量或提高目標皂苷單體在組份中的含量。
【專利說明】動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種生物反應(yīng)器培養(yǎng)人參不定根的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 人參（/--?: g/ase/?# C. A. Meyer)系五加科（Araliacede)人參屬（Panax L.) 植物，是聞名遐邇的"東北三寶"之一，更是我國傳統(tǒng)的名貴中草藥，馳名中外。我國明代偉 大的醫(yī)學(xué)家、藥學(xué)家李時珍在其史詩性巨著《本草綱目》一書中，對人參的功效作了詳盡的 介紹，奠定了人參"百草之王"的美譽。人參多生長于晝夜溫差小、海拔為500?1100米的 針葉林或混交林的山坡中，其主產(chǎn)區(qū)主要分布在40°?45° (N)，117.5°?134° (E)之 間，在我國主要分布在東北三省及河北北部的山地地區(qū)，尤以吉林長白山地區(qū)為主產(chǎn)區(qū)。我 國是研究人參最早的國家之一，現(xiàn)存最早的藥物學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中詳細記載了人參具 有"補五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、除邪氣、明目益智，久服輕身延年"之功效 [7]?，F(xiàn)代藥 理學(xué)研究表明，人參具有大補元氣、復(fù)脈固脫、補脾益肺、生津安神之功效，同時人參具有抗 心律失常、抗溶血、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等諸多藥理學(xué)活性 [8]。人參中含有的 化學(xué)組分比較復(fù)雜，除了含有人參皂苷外，人參中還含有多種非皂苷的活性成分，如含有糖 類(單糖、寡糖、低聚糖、多糖等)、氨基酸、脂肪酸、黃銅、維生素（VB1、VB2、VB12、煙酸、泛酸 等）及揮發(fā)油等組分。隨著近年來現(xiàn)代藥理學(xué)、藥代動力學(xué)研究的不斷深入，人參的藥用價 值及其保健功效進一步得到了認證，人參的價格和地位不斷飆升，如今人參不僅作為我國 的名貴中草藥，更是得到了世界人民的廣泛認可。
[0003] 人參皂苷具有良好的藥理活性及保健功效，經(jīng)藥理學(xué)研究表明人參皂苷對于心腦 血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等具有良好的藥理學(xué)活性。而對于單體人參皂苷 藥理學(xué)活性的研究極為活躍，特別是一些含量甚微的稀有人參皂苷，具有極高的藥用價值。
[0004] 由于長期以來人參被視為珍品，野生資源已枯竭，人工栽培占用林地，造成水土流 失，周期長、管理成本高、病害嚴重。
[0005] 人參細胞培養(yǎng)、根培養(yǎng)的優(yōu)勢在于其具有原始植物根所具有的巨大生物合成能 力，根培養(yǎng)中細胞的高度分化使得次生代謝產(chǎn)物的合成能力明顯提高，同時表出明顯的代 謝穩(wěn)定性。
[0006] 人參不定根的誘導(dǎo)培養(yǎng)技術(shù)已日趨成熟，普遍應(yīng)用的是，將多年生人參的鮮根洗 凈、消毒、切割后在含有2, 4_D、KT和蔗糖的MS固體培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導(dǎo)。再將誘導(dǎo) 出的愈傷組織移至IBA和蔗糖的MS中誘導(dǎo)、增殖不定根。
[0007] 比起人參細胞培養(yǎng)，根培養(yǎng)的優(yōu)勢在于其具有原始植物根所具有的巨大生物合成 能力，根培養(yǎng)中細胞的高度分化使得次生代謝產(chǎn)物的合成能力明顯提高，同時表出明顯的 代謝穩(wěn)定性和活力的穩(wěn)定性。
[0008] 人參不定根生物反應(yīng)器培養(yǎng)，普遍應(yīng)用蔗糖提供碳源，隨著蔗糖濃度的增加，人參 不定根的產(chǎn)量也隨之增加，而培養(yǎng)基中蔗糖的濃度在60g\L以上，對不定根的生長有抑制 作用。
[0009]目前對于生物反應(yīng)器培養(yǎng)增殖人參不定根，大多采用將配制好培養(yǎng)基一次性加入 反應(yīng)器中，接種不定根，培養(yǎng)至營養(yǎng)耗盡為止。收獲不定根。而生物反應(yīng)器培養(yǎng)不定根的過 程中，是一個動態(tài)的生長過程，生長各個階段對營養(yǎng)的需求不盡相同，從理論上培養(yǎng)基的營 養(yǎng)成份是一個逐漸減少的過程。一次性加入培養(yǎng)基，不能具體適應(yīng)各生長階段的需要。 [0010] 有報道采用同樣的培養(yǎng)基，分兩次或三次加入反應(yīng)器中，次數(shù)越多，增殖系數(shù)越 小。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是為解決生物反應(yīng)器培養(yǎng)人參不定根，各階段營養(yǎng)不均衡的問題， 提高人參不定根的產(chǎn)量及次生代謝產(chǎn)物的含量，而提供動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定 根的方法。
[0012] 動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根的方法，它包括： 1) 初始培養(yǎng)基與營養(yǎng)添加液體積比為2?3 : 1;初始培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ IBA 3?5mg/L+蔗糖20?35g/L ;營養(yǎng)添加液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基+蔗糖90?120g/L，滅菌；所述 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為3/4?4/4 SH或3/4?4/4 MS培養(yǎng)基； 2) 將初始培養(yǎng)基加入鼓泡式生物反應(yīng)罐中，接種； 3) 通氣培養(yǎng)； 4) 培養(yǎng)到第5?10天，滴加營養(yǎng)添加液； 5) 繼續(xù)培養(yǎng)到第30?42天，收獲不定根； 所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為3/4SH培養(yǎng)基； 所述的IBA為吲哚丁酸鉀； 所述的初始培養(yǎng)基的蔗糖為20?30g/L ; 最佳濃度為30g/L ; 所述的營養(yǎng)添加液還包括：萘乙酸1. 5?2. 7mg /L和/或茉莉酸甲酯150?240mg/L 和/或水楊酸150?240mg/L ; 所述的培養(yǎng)溫度為23±2°C。
[0013] 本發(fā)明另一個目的是提供動態(tài)均衡營養(yǎng)法培養(yǎng)人參不定根的生物反應(yīng)器，它包 括：初始培養(yǎng)基反應(yīng)罐4、空氣壓力泵5和營養(yǎng)添加液罐6 ;初始培養(yǎng)基反應(yīng)罐4為鼓泡式生 物反應(yīng)罐，其底部設(shè)有氣動裝置，氣動裝置的噴頭為多微孔噴頭405,反應(yīng)罐蓋403還設(shè)有 營養(yǎng)添加液滴加口 401 ;空氣壓力泵5與氣動裝置相連；所述的營養(yǎng)添加液罐6底部設(shè)有帶 調(diào)節(jié)閥出料口 64、頂部設(shè)有罐蓋62和帶過濾器進氣口 61，進氣口 61設(shè)在罐蓋62上，營養(yǎng) 添加液滴加口 401通過管道7與出料口 64相連； 所述的營養(yǎng)添加液滴加口 401的直徑為2. 0?0. 2mm ; 所述的營養(yǎng)添加液罐6的進氣口 61與空氣壓力泵5通過進氣調(diào)節(jié)裝置相連。
[0014] 本發(fā)明又一個目的是動態(tài)均衡營養(yǎng)法培養(yǎng)人參不定根系統(tǒng)，它包括：1個營養(yǎng)添 加液罐6和3個初始培養(yǎng)基反應(yīng)罐4,營養(yǎng)添加液罐6的出料口 64與3個初始培養(yǎng)基反應(yīng) 罐4的養(yǎng)添加液滴加口 401連接。
[0015] 所述的初始培養(yǎng)基反應(yīng)罐4進氣裝置、營養(yǎng)添加液罐6的進氣口 61通過管道與空 氣壓力泵相連接。
[0016] 所述的鼓泡式生物反應(yīng)罐4和營養(yǎng)添加液罐6均為18L，初始培養(yǎng)基添加量為 8-10L，營養(yǎng)添加液的添加量為12-15L。
[0017] 本發(fā)明提供了動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根的方法，1)初始培養(yǎng)基與營養(yǎng) 添加液體積比為2?3 : 1;初始培養(yǎng)基為3/4SH培養(yǎng)基+ IBA 3mg/L+蔗糖20-35g/L;營 養(yǎng)添加液為3/4SH培養(yǎng)基+蔗糖90-120g/L ; 2)將初始培養(yǎng)基加入鼓泡式生物反應(yīng)罐中， 接種；3)通氣培養(yǎng)；4)培養(yǎng)到第5?10天，滴加營養(yǎng)添加液，3-5天滴完；5)繼續(xù)培養(yǎng)到第 30?42天，收獲不定根。可根據(jù)需要實時滴加營養(yǎng)成份，鼓泡式生物反應(yīng)罐在上升的氣泡 作用下，實現(xiàn)了氣動攪拌，可以將營養(yǎng)添加液充分混合到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，可定向獲得縮短培 養(yǎng)時間、提高不定根的產(chǎn)量、總皂苷的含量或提高目標皂苷單體在組份中的含量。特別是 可用高濃度蔗糖的培養(yǎng)基，動態(tài)平衡反應(yīng)罐的蔗糖濃度，可加大蔗糖的添加量提高不定根 產(chǎn)量，解決了蔗糖濃度高抑制不定根生長的問題。初始培養(yǎng)基反應(yīng)罐和營養(yǎng)添加液罐均為 18L，初始培養(yǎng)基添加量為8-10L，營養(yǎng)添加液的添加量為12-15L的培養(yǎng)系統(tǒng)，為人參不定 根提供了最佳的生長環(huán)境。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根的生物反應(yīng)器的初始培養(yǎng)基反應(yīng)罐 示意圖； 圖2為動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根的生物反應(yīng)器的營養(yǎng)添加液罐不意圖； 圖3、4為動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根系統(tǒng)示意圖。

【具體實施方式】
[0019] 實施例1人參不定根的獲得 選取長白山區(qū)（吉林省通化市集安縣)6年生園參，切塊，用MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織，將 誘導(dǎo)的愈傷組織用3\4 SH培養(yǎng)基+IBA5. Omg/L+蔗糖30g/L，誘導(dǎo)不定根，繼代培養(yǎng)。
[0020] 實施例2初始培養(yǎng)基及營養(yǎng)添加液的配制 1、培養(yǎng)基的配制 1) 初始培養(yǎng)基 3/4SH培養(yǎng)基+吲哚丁酸鉀（K-IBA ) 3mg/L+蔗糖30g/L 2) 營養(yǎng)添加液 營養(yǎng)添加液（1): 在每升3/4SH培養(yǎng)基中，加入萘乙酸（C12HltlO2) 2. 7mg /L，茉莉酸甲酯（C13H2tlO3) 240mg/ L，水楊酸 240 mg/L，蔗糖（C12H22O11) 90g X 3/L。
[0021] 營養(yǎng)添加液（2): 在每升3/4SH培養(yǎng)基中，加入萘乙酸（C12HltlO2 )2. 7mg/L，茉莉酸甲酯（C13H2tlO3)204mg/L， 水楊酸 240mg/L，蔗糖（C12H22O11) 120g/L。
[0022] 實施例3生物反應(yīng)器動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根 1) 將初始培養(yǎng)基12L加入18L鼓泡式生物反應(yīng)罐中，營養(yǎng)添加液6L加入補液器中，生 物反應(yīng)器和補液器在溫度120°C、壓力0. 08Mpal條件下滅菌； 2) 不定根切Icm塊，接種到生物反應(yīng)罐中； 3) 通氣，23±2°C培養(yǎng)； 4) 培養(yǎng)到第10天，滴加營養(yǎng)添加液（I) 6L，3-5天滴完； 5) 繼續(xù)培養(yǎng)42天，收獲不定根。
[0023] 實施例4生物反應(yīng)器動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根 1) 將初始培養(yǎng)基IOL加入18L鼓泡式生物反應(yīng)罐中，營養(yǎng)添加液5L加入填料罐中，生 物反應(yīng)器和填料罐在溫度120°C、壓力0. 08Mpal條件下滅菌； 2) 不定根切Icm塊，接種到生物反應(yīng)罐中； 3) 通氣量，23±2°C培養(yǎng)； 4) 培養(yǎng)到第5天，向生物反應(yīng)罐滴加營養(yǎng)添加液（2) 2L，滴加1天，培養(yǎng)到第10天，滴 加營養(yǎng)添加液（2) 3L，4天滴完；滴加時加大通氣量。
[0024] 5)繼續(xù)培養(yǎng)42天，收獲不定根。
[0025] 實施例5動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根的生物反應(yīng)器 請參見圖1、2,動態(tài)均衡營養(yǎng)法培養(yǎng)人參不定根的的生物反應(yīng)器，它包括：初始培養(yǎng)基 反應(yīng)罐4、空氣壓力泵5和營養(yǎng)添加液罐6 ;初始培養(yǎng)基反應(yīng)罐4為鼓泡式生物反應(yīng)罐，其 底部設(shè)有氣動裝置，氣動裝置包括多微孔噴頭405、反應(yīng)罐氣動裝置接口 406,、空氣過濾器 407、空氣流量計408、進氣控制閥409,頂部設(shè)反應(yīng)罐蓋403和帶過濾器排氣口 402,帶過濾 器排氣口 402設(shè)在反應(yīng)罐蓋403上，反應(yīng)罐蓋403還設(shè)有營養(yǎng)添加液滴加口 401 ;空氣壓力 泵5與氣動裝置相連； 所述的營養(yǎng)添加液罐6底部設(shè)有帶調(diào)節(jié)閥出料口 64、頂部設(shè)有罐蓋62和帶過濾器進氣 口 61，進氣口 61設(shè)在罐蓋62上，營養(yǎng)添加液滴加口 401通過管道7與出料口 64相連； 所述的營養(yǎng)添加液滴加口 401的直徑為2. 0?0. 2mm ; 所述的營養(yǎng)添加液罐6的進氣口 61與空氣壓力泵5通過進氣調(diào)節(jié)裝置相連。
[0026] 使用時，關(guān)閉各進出口閥，將IOL初始培養(yǎng)基加入初始培養(yǎng)基反應(yīng)罐4中，營養(yǎng)添 加液罐6加入5L營養(yǎng)添加劑，營養(yǎng)添加液罐6的出料口 64與反應(yīng)罐營養(yǎng)添加液滴加口 401 連接，放入高壓滅菌鍋內(nèi)高壓滅菌，在無菌室內(nèi)接種于鼓泡式生物反應(yīng)罐4內(nèi)，移至培養(yǎng) 室，啟動空氣壓力泵，打開帶過濾器排氣口 402和空氣控制閥，過濾后的空氣經(jīng)多微孔噴頭 405噴出，不定根懸浮于培養(yǎng)基中，空氣經(jīng)排氣口 42排出，23±2°C培養(yǎng)，培養(yǎng)5-10天內(nèi)，打 開營養(yǎng)添加液罐6的帶過濾器進氣口 61和帶調(diào)節(jié)閥出料口 64,調(diào)節(jié)進氣流量和出料口調(diào)節(jié) 閥，控制滴加速度，滴加營養(yǎng)添加液，在3-5日內(nèi)滴完。
[0027] 實施例6動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根系統(tǒng) 請參見圖1、2、3、4,動態(tài)均衡營養(yǎng)法培養(yǎng)人參不定根系統(tǒng)，它包括：1個營養(yǎng)添加液罐6 和3個初始培養(yǎng)基反應(yīng)罐4,營養(yǎng)添加液罐6的出料口 64與3個初始培養(yǎng)基反應(yīng)罐4的養(yǎng) 添加液滴加口 401連接。
[0028] 初始培養(yǎng)基反應(yīng)罐4進氣裝置、營養(yǎng)添加液罐6的進氣口 61通過管道與空氣壓力 泵相連接； 所述的鼓泡式生物反應(yīng)罐4和營養(yǎng)添加液罐6均為18L，初始培養(yǎng)基添加量為8-10L， 營養(yǎng)添加液的添加量為12-15L。
[0029] 實施例7生物反應(yīng)器動態(tài)均衡定向營養(yǎng)法培養(yǎng)人參不定根產(chǎn)量及阜苷含量的測 定 1、以實施例4、5為實驗組，以3/4SH培養(yǎng)基+IBA5mg/L+蔗糖50g/L為培養(yǎng)基常規(guī)方式 培養(yǎng)為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 對照組從培養(yǎng)開始到第10天，不定根增長緩慢，但10-20天增長迅速，20-30天也呈增 長趨勢，但較緩慢；30-40天幾乎沒發(fā)現(xiàn)增長。
[0030] 按實施例4生物反應(yīng)器動態(tài)均衡營養(yǎng)法培養(yǎng)人參不定根方法培養(yǎng)不定根，從培養(yǎng) 開始到第10天，第10 -20天比對照組增長顯著加快，第20-25天略高于對照組，25-40天與 幾乎不增長。
[0031] 按實施例5生物反應(yīng)器動態(tài)均衡營養(yǎng)法培養(yǎng)人參不定根方法培養(yǎng)不定根，各階段 較對照和實施例4增長顯著提高，直至35天都有增長趨勢，35天-42天幾乎不增長。
[0032] 實施例4較對照組干重略有提高，近5%，實施例5提高了 20%。
[0033] 2、將按實施例4方法培養(yǎng)6周人參不定根，送吉林省人參檢測中心檢測，結(jié)果見 表2

【權(quán)利要求】
1. 動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根的方法，它包括： 1) 初始培養(yǎng)基與營養(yǎng)添加液體積比為2?3 : 1;初始培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ IBA 3?5mg/L+蔗糖20?35g/L ;營養(yǎng)添加液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基+蔗糖90?120g/L，滅菌；所述 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為3/4?4/4 SH或3/4?4/4 MS培養(yǎng)基； 2) 將初始培養(yǎng)基加入鼓泡式生物反應(yīng)罐中，接種； 3) 通氣培養(yǎng)； 4) 培養(yǎng)到第5?10天，滴加營養(yǎng)添加液； 5) 繼續(xù)培養(yǎng)到第30?42天，收獲不定根。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根的方法，其特征在于： 所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為3/4SH培養(yǎng)基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根的方法，其特征在于： 所述的IBA為吲哚丁酸鉀。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根的方法，其特征 在于：所述的初始培養(yǎng)基的蔗糖為20?30g/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根的方法，其特征在于： 所述的初始培養(yǎng)基的蔗糖為30g/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根的方法，其特征在于： 所述的營養(yǎng)添加液還包括：萘乙酸1. 5?2. 7mg /L和/或茉莉酸甲酯150?240mg/L和/ 或水楊酸150?240mg/L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的動態(tài)均衡營養(yǎng)法定向培養(yǎng)人參不定根的方法，其特征在于： 所述的培養(yǎng)溫度為23±2°C。
【文檔編號】A01H4/00GK104509442SQ201410811320
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2014年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月24日
【發(fā)明者】金秀蓮, 柳青, 桂英, 叢凡華 申請人:吉林省綠色食品工程研究院