一種組織樣本保存液及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種組織樣本保存液，用來保存采集后到分離前的脂肪、臍帶、胎盤等組織樣本，主要成分為高糖DMEM干粉培養(yǎng)基、碳酸氫鈉、DMSO、地塞米松、胰島素、青霉素、鏈霉素、兩性霉素，肝素鈉注射液，其中高糖DMEM和碳酸氫鈉是維持組織內(nèi)外細(xì)胞的滲透平衡、維持PH值，保持組織濕潤狀態(tài)和提供營養(yǎng)成分；DMSO是凍存保護(hù)劑，可防止組織樣本凍傷；地塞米松抑制免疫，保護(hù)組織樣本中干細(xì)胞活性；胰島素促進(jìn)組織樣本對(duì)糖的吸收和利用；青霉素、鏈霉素、兩性霉素可防止細(xì)菌、霉菌等污染，并可消除已發(fā)生的污染；肝素鈉注射液防止標(biāo)本中血液凝固，提高干細(xì)胞得率。本發(fā)明組織樣本保存液配比簡單，成本低廉、使用方便，可以保持脂肪、臍帶、胎盤等組織樣本內(nèi)干細(xì)胞的活性，大大減少了組織樣本從采集到制備的時(shí)間限制。
【專利說明】-種組織樣本保存液及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種保存采集后的組織樣本如脂肪、廝帶、胎 盤等的保存液。

【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs)是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，在胚胎發(fā)育中來源于 中胚層，之后幾乎分布于機(jī)體的所有器官與組織中。MSCs具有分化為多種中胚層細(xì)胞系的 潛能，包括成骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，肌膊細(xì)胞等。在機(jī)體正 常的損傷修復(fù)過程中，MSCs可W在趨化因子的誘導(dǎo)下，招募至損傷部位，在局部增殖、分化， 并通過旁分泌作用參與損傷修復(fù)與組織再生。MSCs來源廣泛且沒有倫理限制，易于分離和 體外擴(kuò)增，在經(jīng)過多次分裂傳代后仍保持多向分化潛能，至今為止的臨床試驗(yàn)研究未發(fā)現(xiàn) MSCs有嚴(yán)重副作用，因此，MSCs是一種非常理想的細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)的種子細(xì)胞。
[0003] MSCs來源主要有脂肪、廝帶、胎盤等組織樣本，間充質(zhì)干細(xì)胞制備過程包括組織樣 本的采集、運(yùn)輸、交接、檢測(cè)、分離、凍存、復(fù)蘇、原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)等諸多步驟，在組織樣 本采集后到分離前需要運(yùn)輸、交接和檢測(cè)H個(gè)步驟，實(shí)際操作中需要存放較長的時(shí)間。組織 樣本一旦采集，脫離了原有的體內(nèi)環(huán)境，其中的間充質(zhì)干細(xì)胞的活性會(huì)受很多的因素的影 響，諸如時(shí)間、溫度、滲透壓等。目前組織樣本很多情況需要異地采集，運(yùn)輸、交接和檢測(cè)H 個(gè)步驟所用的時(shí)間就更長，組織樣本需存放的時(shí)間較長，影響因素就更加的復(fù)雜。
[0004] 國內(nèi)的組織樣本保存多采用直接裝瓶或者補(bǔ)加基礎(chǔ)培養(yǎng)基的方法。直接裝瓶組 織樣本的保存時(shí)間一般少于24小時(shí)，給組織樣本的運(yùn)輸、交接和檢測(cè)帶來了不小的時(shí)間壓 力，迫切需要改進(jìn)組織樣本的保存方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有【技術(shù)領(lǐng)域】存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于，提供一種組織樣本 保存液及其制備方法，該組織樣本保存液配比簡單，成本低廉，使用方便。利用本發(fā)明組織 樣本保存液可W保存脂肪、廝帶、胎盤等組織樣本內(nèi)干細(xì)胞的活性，在0?8C的情況下有 效保存至少96小時(shí)，分離出的干細(xì)胞活性受時(shí)間的影響很小，大大減少了組織樣本從采集 到制備的時(shí)間限制，并能有效降低污染概率。
[0006] 組織樣本保存液，在1L組織樣本保存液中含有；高糖DMEM干粉培養(yǎng)基13. 4g、碳 酸氨軸2. 438g、DMS0 5?20mg、地塞米松39. 25?117. 7加g、膜島素2?lOmg、青霉素 100?200mg、鏈霉素100?200mg、兩性霉素2. 5?5mg、肝素軸注射液0. 5?1. 5g，余量為 注射用水。
[0007] 所述的一種組織樣本保存液的制備方法，包括W下步驟：
[0008] (a)將高糖DMEM干粉培養(yǎng)基13. 4g倒入一容器中，用少量注射用水將袋內(nèi)殘留培 養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至950ml，輕微攬拌溶解；
[0009] 化）加入2. 438g碳酸氨軸；
[0010] (C)輕微攬拌溶解，加注射用水至IL ;
[0011] (d)用Imol/L氨氧化軸溶液或者Imol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH值至中性；
[001引 （e)依次分別加入DMS0 5?20mg、地塞米松39. 25?117. 7加g、膜島素2?lOmg、 青霉素100?200mg、鏈霉素100?200mg、兩性霉素2. 5?5mg、肝素軸注射液0. 5?1. 5g， 充分混勻；
[0013] (f)〇. 22um濾膜過濾除菌，分裝，0?8C保存，即為組織樣本保存液。
[0014] 所述組織保存液，其中高糖DMEM和碳酸氨軸是維持組織內(nèi)外細(xì)胞的滲透平衡、維 持PH值，保持組織濕潤狀態(tài)和提供營養(yǎng)成分；DMS0是凍存保護(hù)劑，可防止組織樣本凍傷； 地塞米松抑制免疫，保護(hù)組織樣本中干細(xì)胞活性；膜島素促進(jìn)組織樣本對(duì)糖的吸收和利用； 青霉素、鏈霉素、兩性霉素可防止細(xì)菌、霉菌等污染，并可消除已發(fā)生的污染；肝素軸注射液 防止標(biāo)本中血液凝固，提高干細(xì)胞得率。
[0015] 本發(fā)明的一種組織樣本保存液及其制備方法，其有益效果在于配比簡單，成本低 廉、使用方便，使采集后的組織樣本在運(yùn)輸、交接、分離前檢測(cè)等過程中，能夠在較長時(shí)間內(nèi) 有效保持其中干細(xì)胞的活性，并能防止和去除污染，提高效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1示經(jīng)本發(fā)明組織樣本保存液保存96小時(shí)的脂肪組織分離培養(yǎng)出的間充質(zhì)干 細(xì)胞，P2代，100X;
[0017] 圖2示經(jīng)本發(fā)明組織樣本保存液保存96小時(shí)的廝帶組織分離培養(yǎng)出的間充質(zhì)干 細(xì)胞，P1代，40X。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面參照附圖，結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明提供的一種組織樣本保存液及其制備方法， 進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[001引 實(shí)施例
[0020] 參照?qǐng)D1-圖2,本實(shí)施例的一種組織樣本保存液及其制備方法，在1L組織樣本保 存液中含有；高糖DMEM干粉培養(yǎng)基13. 4g、碳酸氨軸2. 438g、DMS0 lOmg、地塞米松lOOug、 膜島素8mg、青霉素200mg、鏈霉素200mg、兩性霉素5mg、肝素軸注射液Ig，余量為注射用水。
[0021] 該組織樣本保存液的制備方法如下：
[00過 （a)將高糖DMEM干粉培養(yǎng)基（品牌；GIBC0,貨號(hào)12100-046) 13. 4g倒入一容器中， 用少量注射用水將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至950ml，輕微攬拌溶解； [002引 化）加入2. 43地碳酸氨軸；
[0024] (C)輕微攬拌溶解，加注射用水至1L ;
[0025] (d)用Imol/L氨氧化軸溶液或者Imol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH值至中性；
[0026] (e)依次分別加入DMS0 lOmg (品牌sigma,貨號(hào)D2650)、地塞米松lOOug (品 牌Sigma,貨號(hào)D4902-25MG)、膜島素8mg (品牌Sigma,貨號(hào)10908)、青霉素200mg (品 牌Amresco,貨號(hào)0242)、鏈霉素200mg(品牌Amresco,貨號(hào)0382)、兩性霉素5mg(品牌 Amresco,貨號(hào)E437)、肝素軸注射液Ig (廠家：成都市海通藥業(yè)有限公司，規(guī)格2ml ;5000單 位），充分混勻；
[0027] (f) 0. 22um濾膜過濾除菌，分裝，0?8°C保存，即為組織樣本保存液。
[002引實(shí)施例二
[0029] -種組織樣本保存液，在1L組織樣本保存液中含有；高糖DMEM干粉培養(yǎng)基 13.4g、碳酸氨軸2.438g、DMS0 5mg、地塞米松40ug、膜島素2mg、青霉素lOOmg、鏈霉素 lOOmg、兩性霉素2. 5mg、肝素軸注射液0. 5g，余量為注射用水。
[0030] 該組織樣本保存液的制備方法如下：
[003。 （a)將高糖DMEM干粉培養(yǎng)基13. 4g倒入一容器中，用少量注射用水將袋內(nèi)殘留培 養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至950ml，輕微攬拌溶解；
[00礎(chǔ) 化）加入2. 43地碳酸氨軸；
[0033] (C)輕微攬拌溶解，加注射用水至1L ;
[0034] (d)用Imol/L氨氧化軸溶液或者Imol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH值至中性；
[00巧](e)依次分別加入DMS0 5mg、地塞米松40ug、膜島素2mg、青霉素lOOmg、鏈霉素 lOOmg、兩性霉素2. 5mg、肝素軸注射液0. 5g，充分混勻；
[0036] (f)0. 22um濾膜過濾除菌，分裝，0?8C保存，即為組織樣本保存液。
[0037] 實(shí)施例H
[0038] -種組織樣本保存液，在1L組織樣本保存液中含有；高糖DMEM干粉培養(yǎng)基 13.4g、碳酸氨軸2.438g、DMS0 20mg、地塞米松40ug、膜島素8mg、青霉素200mg、鏈霉素 200mg、兩性霉素2. 5mg、肝素軸注射液1. 5g，余量為注射用水。
[0039] 該組織樣本保存液的制備方法如下：
[0040] (a)將高糖DMEM干粉培養(yǎng)基13. 4g倒入一容器中，用少量注射用水將袋內(nèi)殘留培 養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至950ml，輕微攬拌溶解；
[0041] 化）加入2. 438g碳酸氨軸；
[0042] (C)輕微攬拌溶解，加注射用水至1L ;
[0043] (d)用Imol/L氨氧化軸溶液或者Imol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH值至中性；
[0044] (e)依次分別加入DMS0 20mg、地塞米松40ug、膜島素8mg、青霉素200mg、鏈霉素 200mg、兩性霉素2. 5mg、肝素軸注射液1. 5g，充分混勻；
[0045] (f) 0. 22um濾膜過濾除菌，分裝，0?8C保存，即為組織樣本保存液。
[004引 實(shí)施例四
[0047] 脂肪組織的采集及保存；用本發(fā)明的組織樣本保存液保存吸脂后到分離前的人脂 肪組織，即無菌采集脂肪后，吸棄膨脹液，將采集的脂肪組織放入裝有本發(fā)明的組織樣本保 存液的脂肪采集瓶中，掙緊瓶蓋并密封，放入恒溫箱中0?8C恒溫保存至分離。
[0048] 保存液的保存效果對(duì)比；將采集的脂肪組織均分為5份，分別保存在本發(fā)明的組 織樣本保存液、磯酸鹽緩沖液PBS、生理鹽水和高糖DMEM培養(yǎng)基（液體）中，最后一份直接 將脂肪組織單獨(dú)放置，在0?8C恒溫保存24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)后膠原酶消化 分離，取相同克數(shù)脂肪組織塊分離獲得的有核細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)9天后，消化計(jì)數(shù)。同時(shí)留一份 新鮮脂肪組織不保存作為對(duì)照，直接膠原酶消化分離后取相同克數(shù)脂肪組織塊獲得的有核 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)9天，消化后計(jì)數(shù)為6. 20 X 107。
[0049] 保存結(jié)果顯示如下：
[0050]

【權(quán)利要求】
1. 一種組織樣本保存液，其特征在于，在1L組織樣本保存液中含有：高糖DMEM干粉 培養(yǎng)基13. 4g、碳酸氫鈉2. 438g、DMS05?20mg、地塞米松39. 25?117. 75ug、胰島素2? 10mg、青霉素100?200mg、鏈霉素100?200mg、兩性霉素2. 5?5mg、肝素鈉注射液0. 5? 1.5g，余量為注射用水。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種組織樣本保存液的制備方法，包括以下步驟： (a) 將高糖DMEM干粉培養(yǎng)基13. 4g倒入一容器中，用少量注射用水將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基 洗下，并入容器。加注射用水至950ml，輕微攪拌溶解； (b) 加入2. 438g碳酸氫鈉； (c) 輕微攪拌溶解，加注射用水至1L ; (d) 用lmol/L氫氧化鈉溶液或者lmol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH值至中性； (e) 依次分別加入DMS05?20mg、地塞米松39. 25?117. 75ug、胰島素2?10mg、青霉 素100?200mg、鏈霉素100?200mg、兩性霉素2. 5?5mg、肝素鈉注射液0. 5?1. 5g，充 分混勻； (f) 0. 22um濾膜過濾除菌，分裝，0?8°C保存，即為組織樣本保存液。
【文檔編號(hào)】A01N1/02GK104396940SQ201410545305
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月11日
【發(fā)明者】張炳強(qiáng) 申請(qǐng)人:張炳強(qiáng)