香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。利用香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子構(gòu)建一種表達(dá)Gus基因的植物重組表達(dá)載體pCAMBIA1304：MaPIP1；1-Promoter。本發(fā)明利用啟動(dòng)逆境相關(guān)基因的高效表達(dá)，應(yīng)用于耐旱和耐鹽的轉(zhuǎn)基因植物中，對于解決干旱和鹽害地區(qū)糧食危機(jī)、生態(tài)惡化等問題都有積極意義。
【專利說明】香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是指一種香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子和 在植物中高效表達(dá)的干旱和鹽害的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 水資源短缺以及土壤鹽漬化是目前制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)全球性問題，全球約有 20%的耕地受到鹽害威脅。干旱與鹽害嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育，造成作物減產(chǎn)，并使生態(tài) 環(huán)境日益惡化。在自然條件下，由于環(huán)境脅迫而嚴(yán)重影響了作物生長發(fā)育，其遺傳潛力難以 發(fā)揮，干旱、鹽漬不僅影響了作物的產(chǎn)量，而且限制了植物的廣泛分布，因此，提高作物的抗 旱、耐鹽能力已經(jīng)成為現(xiàn)代植物研究工作中急需解決的關(guān)鍵問題之一。
[0003] 香蕉是熱帶、亞熱帶地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)作物之一，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO)定位為 發(fā)展中國家僅次于水稻、小麥、玉米之后的第四大糧食作物。香蕉前期植株較小，根系淺生， 易受旱、鹽害等脅迫的影響，在栽培生產(chǎn)中，耗水量大，缺水會減少香蕉果實(shí)數(shù)量且使香蕉 變小，掛果期受旱，會影響果實(shí)膨大，在營養(yǎng)生長階段遇上干旱，會使香蕉營養(yǎng)器官生長發(fā) 育不良，從而造成減產(chǎn)。而土壤鹽分過多使根際土壤溶液滲透勢降低，促使植物吸收水分困 難，造成生長速度和生長量顯著下降，嚴(yán)重還可能造成死亡（Van et al.，2011)。解決香蕉 生產(chǎn)中嚴(yán)重的逆境脅迫問題，提高香蕉產(chǎn)量，除了常規(guī)育種技術(shù)以外，基于基因遺傳轉(zhuǎn)化的 生物育種技術(shù)是一個(gè)重要的選擇。在基因工程中，用來控制目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子主要以 CaMV35S等組成型表達(dá)啟動(dòng)子為主。該啟動(dòng)子雖能使目的基因過量表達(dá)，但它是無環(huán)境、組 織和時(shí)間特異性的組成型表達(dá)的啟動(dòng)子。利用組成型表達(dá)啟動(dòng)子控制抗性相關(guān)基因的過量 表達(dá)雖然可以提高植物在逆境條件下的抗逆能力，但正常環(huán)境條件下細(xì)胞內(nèi)也會過量表達(dá) 抗逆蛋白，對植物來說是一種能量浪費(fèi)。因此，利用逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)高效、可控和特 異（定點(diǎn)、定時(shí)、定量）的調(diào)控抗逆基因在改良作物的抗性中成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。
[0004] 對植物在干旱和鹽害等逆境脅迫下大量表達(dá)的抗逆基因啟動(dòng)子研究表明，不同耐 旱和耐鹽基因的啟動(dòng)子往往含有相同的順式作用元件，并受相同的反式作用因子的調(diào)控。
[0005] 非生物脅迫如干旱、高鹽、低溫等，可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 的主要機(jī)制是逆境脅迫有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（調(diào)節(jié)蛋白）與基因上游啟動(dòng)子中關(guān)鍵順式元件 特異結(jié)合，增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性，提高目的基因的表達(dá)量。國內(nèi)外有一些關(guān)于逆境啟動(dòng)子的 報(bào)道，干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，擬南芥erdl (early responsive to dehydration stressl)基因 與干旱脅迫相關(guān)，其啟動(dòng)子區(qū)域存在保守的干旱響應(yīng)順式作用元件（Drought-Responsive cis-Element) CATGTG和CACG模體，融合⑶S檢測其表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，它在鹽脅迫下葉片中特 異性增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄水平（Tran et al·，2004)。SNACl (STRESS-RESPONSIVE NACl)是 NAC 家 族的一員，超表達(dá)植株抗旱性大大增強(qiáng)，在受到干旱脅迫時(shí)能夠正常結(jié)實(shí)，該基因的啟動(dòng) 子驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)情況揭示其受到干旱誘導(dǎo)在保衛(wèi)細(xì)胞中特異性表達(dá)（Hu et al.，2006)。 rd29A啟動(dòng)子受ΑΒΑ、干旱、高鹽及低溫等逆境誘導(dǎo)，是目前抗逆植物基因工程中應(yīng)用最 廣泛的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（李新玲等，2007 ;楊春霞等，2008 ;吳梅花等，2005 ;Yamaguehi - shinOZakiandshinOZaki，1993)。Yamaguehi - shinozaki 等（2001)分別利用 CaMV355 組成型啟動(dòng)子和rd29A逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子獲得了 DREBIA的轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果顯示 rd29A: =DREBIA轉(zhuǎn)基因植株的脅迫耐性明顯高于355: =DREBIA的轉(zhuǎn)基因植株，表明rd29A啟 動(dòng)子能更有效地提高植物對低溫、干旱和高鹽等逆境脅迫的適應(yīng)性。Brown等（2001)首次 在冬麥中發(fā)現(xiàn)了受低溫誘導(dǎo)的bltlOl. 1基因啟動(dòng)子，并通過漸變?nèi)笔цb定到了一個(gè)高度 保守的T-Iike元件（TCATCTTCTT)，表明該元件與誘導(dǎo)目的基因在低溫脅迫下高效表達(dá)密 切相關(guān)。Takumi等（2003)在小麥種分離到一個(gè)低溫應(yīng)答基因 WC0rl5上游I. 7kb的啟動(dòng)子 序列，結(jié)果顯示該區(qū)段內(nèi)包含有4個(gè)CRT/DRElike序列，包括CCGAC核心基序，實(shí)驗(yàn)證明該 啟動(dòng)子受低溫和光誘導(dǎo)。
[0006] 利用逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗逆基因的高效表達(dá)，從而改良作物對逆境脅迫的適 應(yīng)性已成為目前的研究熱點(diǎn)。然而，目前能應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子仍然很少。因 此，對于新的逆境相關(guān)啟動(dòng)子的克隆、順式作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作 用，以及與這些元件互作的轉(zhuǎn)錄因子的研究仍然是今后啟動(dòng)子研究的重點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題就是提供一種香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子，其核苷酸 序列如SEQ IDN0. 1所示。該序列長度為841bp。通過對該啟動(dòng)子序列中的順式作用元件進(jìn) 行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子具有響應(yīng)干旱和高鹽的元件，含有1個(gè)響應(yīng)干旱元件CBFHV，1個(gè) ABA和干旱響應(yīng)元件DRE2C0REZMRAB17,1個(gè)干旱、高鹽響應(yīng)元件DRECRTCOREAT，1個(gè)早期響 應(yīng)干旱元件MYCATERD1。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種用于獲得香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子的引物對，所述引物對 為：
[0009] 正向兼并引物：5' -NTCGASTWTSGWGTT-3'（5, -NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T) GTT-3，）；
[0010] 三輪反向引物：
[0011] 第一輪反向引物prl:
[0012] 5'-AAACAGTGTAGACGAGGATGAAGGTG-3' ；
[0013] 第二輪反向引物pr2:
[0014] 5,-GGTACAGTAGACCAAGGCAAAGAT-3，；
[0015] 第三輪反向引物pr3:
[0016] 5'-CCTGTAGAAGGACCAAGAGGTGAGC-3' 。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子的獲得方法，該方法以具有香蕉 水通道蛋白基因的香蕉基因組DNA為模板，采用以下引物對：
[0018] 正向兼并引物：5'-NTCGASTWTSGWGTT-3' ；
[0019] 三輪反向引物：
[0020] 第一輪反向引物prl
[0021] :5'-AAACAGTGTAGACGAGGATGAAGGTG-3' ；
[0022] 第二輪反向引物pr2:
[0023] 5,-GGTACAGTAGACCAAGGCAAAGAT-3，；
[0024] 第三輪反向引物pr3:
[0025] 5'-CCTGTAGAAGGACCAAGAGGTGAGC-3' 。
[0026] 進(jìn)行三輪PCR擴(kuò)增，其所獲得的香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子為SEQ IDN0. 1。
[0027] 本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，它含有權(quán)利要求1所述香蕉水通道蛋白基因 啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體為PCAMBIA1304。該表達(dá)載體可使外源目的基 因的高效表達(dá)。
[0028] 本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0029] 1)以香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子SEQ IDN0. 1為模板設(shè)計(jì)引物對，且引物對分別 上加 ECORI、SPeI酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基：
[0030] 正向引物Pl:
[0031] 5'-CGGAATTCATCGAGTATGGTGTTCCTATGCT-3' ，
[0032] 反向引物P2:
[0033] 5'-GGACTAGTCTATCACTATCTATCTCCCCTGT-3' ；
[0034] 2)以香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子SEQ IDN0. 1為模板進(jìn)行PCR，PCR擴(kuò)增條件如 下：
[0035] 94°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 40s、55°C退火 40s、72°C延伸 40s，共 35 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸8min ;獲得PCR產(chǎn)物；
[0036] 3)用ECORI、SPeI將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，純化回收；同時(shí)，用ECORI、SPeI將 PCAMBIA1304載體進(jìn)行雙酶切，去除CaMV35S啟動(dòng)子，酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳檢測并回 收大片段；
[0037] 4)在IOul體系中，將回收的pCAMBIA1304載體大片段和回收的PCR產(chǎn)物用T4 連接酶4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，將篩選得到的陽性克隆 用ECORI、SPeI進(jìn)行酶切驗(yàn)證，獲得得到表達(dá)Gus基因的植物重組表達(dá)載體pCAMBIA1304 : MaPIPl "-Promoter。
[0038] 本發(fā)明還提供了一種含有權(quán)利要求4和5所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述宿 主細(xì)胞為農(nóng)桿菌EHA105。
[0039] 本發(fā)明還提供了一種下述各項(xiàng)之一在培養(yǎng)干旱性和鹽害性植物中的應(yīng)用，
[0040] (1)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子；
[0041] (2)權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體；
[0042] (3)權(quán)利要求7所述的農(nóng)桿菌EHA105。
[0043] 作為優(yōu)選方案，所述的植物為擬南芥。
[0044] 本發(fā)明還提供了一種培育具有干旱性和鹽害性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括以下步 驟：
[0045] 1)啟動(dòng)子克??；
[0046] 2)植物表達(dá)載體構(gòu)建；
[0047] 3)受體的遺傳轉(zhuǎn)化；
[0048] 4)陽性轉(zhuǎn)基因植株的鑒定；
[0049] 5)抗旱性和耐鹽性表型及生理分析。
[0050] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0051] 本發(fā)明利用啟動(dòng)逆境相關(guān)基因的高效表達(dá)，應(yīng)用于耐旱和耐鹽的轉(zhuǎn)基因植物中， 對于解決干旱和鹽害地區(qū)糧食危機(jī)、生態(tài)惡化等問題都有積極意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0052] 圖1為本發(fā)明的利用TAIL-PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子三輪PCR產(chǎn)物鑒定電泳圖；
[0053] 圖2為本發(fā)明的MaPIPl ;1啟動(dòng)子連接pCAMBIA1304質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖；
[0054] 圖3為本發(fā)明的植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖；
[0055] 圖4為本發(fā)明pCAMBIA1304:MaPIPl ; I-Promoter轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌PCR鑒定電泳圖；
[0056] 圖5為本發(fā)明的MaPIPl ;1啟動(dòng)子序列中含有的順式作用元件的分析結(jié)果圖；
[0057] 圖6為本發(fā)明的35S啟動(dòng)子和MaPIPl ;1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥干旱和鹽脅迫處理 表型圖；
[0058] 圖7為本發(fā)明的35S啟動(dòng)子和MaPIPl ;1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中⑶S酶活定 量分析結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0059] 為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但 本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。
[0060] 實(shí)施例1香蕉水通道蛋白基因 MaPIPl ;1啟動(dòng)子的分離
[0061] 1、香蕉基因組DNA的制備
[0062] 取生長1個(gè)月的香蕉組培苗，采用CTAB法提取基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測 后于-20°C進(jìn)行保存。
[0063] 2、MaPIPl ;1啟動(dòng)子的克隆和序列分析
[0064] 以香蕉基因組DNA為模板，通過TAIL-PCR法設(shè)計(jì)三輪引物對，該引物對為：
[0065] 正向兼并引物：5' -NTCGASTWTSGWGTT-3'（5, -NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T) GTT-3，）；
[0066] 三輪反向引物：
[0067] 第一輪反向引物prl:
[0068] 5'-AAACAGTGTAGACGAGGATGAAGGTG-3' ；
[0069] 第二輪反向引物pr2:
[0070] 5'-GGTACAGTAGACCAAGGCAAAGAT-3' ；
[0071] 第三輪反向引物pr3:
[0072] 5'-CCTGTAGAAGGACCAAGAGGTGAGC-3' 。
[0073] 第一輪PCR反應(yīng)體系為：模板為香蕉基因組DNAl μ?，正向簡并引物 0· 5μ 1(10μΜ/μ 1)，第一輪反向引物 prio. 5μ 1(10μΜ/μ 1)，Ex Taq by ffer2. 5μ 1，Ex TaqO. 25μ 1，dNTP4y 1，（ΜΗ2017μ I 共 25μ 1。
[0074] 第一輪PCR反應(yīng)條件為92°C預(yù)變性3min，95°C變性lmin，1個(gè)循環(huán)；94°C變性30s， 65°〇退火111^11，721：延伸21^11，5個(gè)循環(huán) ；941：變性3〇8,251：退火21^11，721：延伸21^11，1 個(gè)循環(huán)；94°C變性 30s，65°C退火 lmin，72°C延伸 2min，94°C變性 30s，65°C退火 2min，72°C 延伸211^11，941：變性3〇8,441：退火11^11，721：延伸21^11，15個(gè)循環(huán)；721：延伸51^11，1個(gè)循 環(huán)。
[0075] 第二輪PCR反應(yīng)體系為：模板為第一輪反應(yīng)產(chǎn)物稀釋50倍取1 μ 1，正向簡并引物 0· 5μ 1(10μΜ/μ 1)，第二輪反向引物 pr20. 5μ 1(10μΜ/μ 1)，Ex Taq by ffer2. 5μ 1，Ex TaqO. 25 μ I，dNTP4 μ I，ddH2017 μ I 共 25 μ I。
[0076] 第二輪PCR反應(yīng)條件為94°C變性30s，65°C退火lmin，72°C延伸2min，94°C變性 30s，65°C退火 lmin，72°C延伸 2min，94°C變性 30s，45°C退火 lmin，72°C延伸 2min，12 個(gè)循 環(huán)；72°C延伸5min，1個(gè)循環(huán)。
[0077] 第三輪PCR反應(yīng)體系為：模板為第二輪反應(yīng)產(chǎn)物取Ιμ?，正向簡并引物 0· 5μ 1(10μΜ/μ 1)，第三輪反向引物 pr30. 5μ 1(10μΜ/μ 1)，Ex Taq by ffer2. 5μ 1，Ex TaqO. 25μ 1，dNTP4y 1，（ΜΗ2017μ I 共 25μ 1。
[0078] 第三輪PCR反應(yīng)條件為94°C變性40s，45°C退火lmin，72°C延伸2min，20個(gè)循環(huán)； 72°C延伸5min，l個(gè)循環(huán)。
[0079] 將第三輪PCR產(chǎn)物檢測并回收測序，獲得長度為841bp的MaPIPl ;1啟動(dòng)子，其 序列為 SEQ ID NO :1，使用 PLACE 軟件(http://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/),圖 5 為 MaPIPl ;1啟動(dòng)子含有的順式作用元件的分析結(jié)果，香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子序列中的 順式作用元件進(jìn)行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子含有真核生物啟動(dòng)子的基本保守元件TATA-box 和 CAAT-box。
[0080] 實(shí)施例2表達(dá)載體的構(gòu)建
[0081] 1)以實(shí)施例1中回收的第三輪PCR產(chǎn)物為模板設(shè)計(jì)引物，引物上加 EC0RI、SPeI酶 切位點(diǎn)和保護(hù)堿基：
[0082] 正向引物Pl:
[0083] 5'-CGGAATTCATCGAGTATGGTGTTCCTATGCT-3' ，
[0084] 反向引物P2:
[0085] 5'-GGACTAGTCTATCACTATCTATCTCCCCTGT-3' ；
[0086] 2)?0?擴(kuò)增條件為：941：預(yù)變性31^11;941：變性4〇8、551：退火4〇8、721：延伸4〇8， 共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸8min。
[0087] 3)用EC0RI、SPeI將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，純化回收。同時(shí)，用EC0RI、SPeI將 PCAMBIA1304載體進(jìn)行雙酶切，去除CaMV35S啟動(dòng)子，酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳檢測并回 收大片段。在10 μ 1體系中，將回收的PCAMBIA1304載體大片段和回收的PCR產(chǎn)物用T4連 接酶4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，
[0088] 4)將篩選得到的陽性克隆用EC0RI、SPeI進(jìn)行酶切驗(yàn)證（圖2)，獲得重組質(zhì)粒，從 而使香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子取代載體PCAMBIA1304上的CaMV35S啟動(dòng)子，與Gus基因 融合，得到表達(dá)Gus基因的植物重組表達(dá)載體pCAMBIA1304 :MaPIPl ; I-Promoter (圖3)。
[0089] 實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因植株的獲得
[0090] 通過電擊轉(zhuǎn)化法，將在實(shí)施例2中構(gòu)建的表達(dá)Gus基因的植物重組表達(dá)載體 PCAMBIA1304 :MaPIPl ;l-Promoter轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中EHA105中，提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定 (圖4)，確定質(zhì)粒真正的轉(zhuǎn)入到了農(nóng)桿菌中。
[0091] 將擬南芥野生型種子撒播在花缽中，并在表面鋪一層細(xì)砂，將其放置在2?4°C， 濕潤、黑暗條件下春化處理1?3天，保濕待種子萌發(fā)。于人工氣候箱中培養(yǎng)，以蛭石為基 質(zhì)，溫度控制在21?23°C，營養(yǎng)生長期每日光照時(shí)間為8h，生殖生長期每日為光照為16h， 光照強(qiáng)度為20001x，培養(yǎng)室相對濕度為70?90%。當(dāng)幼苗長出真葉后，可進(jìn)行移植。移栽 后保濕一星期左右，直至幼苗長出新葉。每隔4d澆適量的擬南芥營養(yǎng)液，待花苔長至5? IOcm及側(cè)苔抽出時(shí)，可用于轉(zhuǎn)化。
[0092] 將已轉(zhuǎn)化有pCAMBIA1304 :MaPIPl ;l-Promoter的農(nóng)桿菌，加到含有Kan和Rif抗 生素的LB培養(yǎng)基中，28°C振蕩10h，加入擬南芥轉(zhuǎn)基因浸潤液（l/2MS，50g/L Sucrose)中， 將擬南芥倒置浸染到菌液中，采用花序浸染法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[0093] 將晾干的種子以75%乙醇+0. 02% Triton XlOO溶液浸泡lOmin，移除乙醇溶液， 重復(fù)2-3次，將種子吹打到無菌濾紙上，風(fēng)干；將晾干的種子撒播在選擇培養(yǎng)基（1/2MS， L 5% Sucrose，0. 7%Agra，25y g/mL hygromycin B)上進(jìn)行抗性篩選,收獲T3代種子進(jìn)行 后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。
[0094] 實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因植株干旱和鹽脅迫處理表型分析
[0095] 將生長4周的轉(zhuǎn)基因擬南芥控水20天進(jìn)行干旱脅迫，20天后，具有35S啟動(dòng)子的 轉(zhuǎn)基因株系葉片大部分失綠，存活率已降至16%，而MaPIPl ; 1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植株還保持較 強(qiáng)生命力，存活率為81 %，證明該轉(zhuǎn)基因植株具有更強(qiáng)的抗旱能力。同時(shí)，將生長4周的轉(zhuǎn) 基因擬南芥用350mM NaCl溶液澆灌15天進(jìn)行鹽脅迫，15天后，具有35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因株 系葉片大部分萎蔫，存活率下降至12%，而MaPIPl ;1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植株仍保持較高的存活 率為76%，證明該轉(zhuǎn)基因植株具有更強(qiáng)的耐鹽能力（圖6)。
[0096] 實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因植株Gus表達(dá)活性分析
[0097] 取對照及進(jìn)行干旱和鹽脅迫處理的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片，在液氮中研磨成粉末，力口 入⑶S蛋白提取緩沖液（50mM磷酸鈉緩沖液、Ph = 7. OlOmM Na. EDTA、0. 1% Triton X-100、 ΙΟΟπιΜβ-巰基乙醇）混勻。4°C 13000rpm離心10分鐘，取上清用于⑶S酶活分析。⑶S酶 活高低用GUS蛋白粗提液催化底物4-甲基傘形酮-β -D-葡糖醛酸苷（4-MUG)生成產(chǎn)物四 甲基傘形酮（4-MU)的量進(jìn)行測定。用多功能酶標(biāo)儀Varioskan Flash(Thermo公司）測定 熒光值，用酶標(biāo)儀Model680 (Bio-Rad公司）以考馬斯亮藍(lán)法測定GUS蛋白粗提液中總蛋白 含量。測定結(jié)果顯示：香蕉MaPIPl ;1啟動(dòng)子能夠增強(qiáng)基因的表達(dá)，同時(shí)該啟動(dòng)子也受干旱 和高鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。
[0098] 其它未詳細(xì)說明的部分均為現(xiàn)有技術(shù)。盡管上述實(shí)施例對本發(fā)明做出了詳盡的描 述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，人們還可以根據(jù)本實(shí)施例在不經(jīng) 創(chuàng)造性前提下獲得其他實(shí)施例，這些實(shí)施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子，其特征在于；其核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示。
2. 用于獲得權(quán)利要求1所述香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子的引物對，其特征在于；所述 引物對為： 正向兼并引物：5'-階11^5了'^56161'1'-3'； 三輪反向引物： 第一輪反向引物prl : 5' -AAACAGTGTAGACGAGGATGAAGGTG-3'； 第二輪反向引物pr2 : 5,-GGTACAGTAGACCAAGGCAAAGAT-3，； 第三輪反向引物pr3 : 5'-CCTGTAGAAGGACCAAGAGGTGAGC-3' 。
3. -種權(quán)利要求1或2所述香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子的獲得方法，其特征在于：以 具有香蕉水通道蛋白基因的香蕉基因組DNA為模板，采用以下引物對： 正向兼并引物：5'-階11^5了'^56161'1'-3'； 三輪反向引物： 第一輪反向引物prl : 5' -AAACAGTGTAGACGAGGATGAAGGTG-3'； 第二輪反向引物pr2 : 5,-GGTACAGTAGACCAAGGCAAAGAT-3，； 第三輪反向引物pr3 : 5'-CCTGTAGAAGGACCAAGAGGTGAGC-3' 。 進(jìn)行三輪PCR擴(kuò)增，其所獲得的香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子為SEQ IDNO. 1。
4. 一種重組表達(dá)載體，其特征在于：它含有權(quán)利要求1所述香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng) 子的植物表達(dá)載體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，所述植物表達(dá)載體為pCAMBIA1304。
6. -種權(quán)利要求4或5所述重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 以香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子SEQ IDNO. 1為模板設(shè)計(jì)引物對，且引物對分別上加 ECORI、SPeI酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，如下： 正向引物Pl : 5'-CGGAATTCATCGAGTATGGTGTTCCTATGCT-3' ， 反向引物P2 : 5'-GGACTAGTCTATCACTATCTATCTCCCCTGT-3' ； 2) 以香蕉水通道蛋白基因啟動(dòng)子SEQ IDNO. 1為模板進(jìn)行PCR，PCR擴(kuò)增條件如下： 94°C預(yù)變性3min ;94°C變性40s、55°C退火40s、72°C延伸40s，共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸 8min ;獲得PCR產(chǎn)物； 3) 用ECORI、SPe I將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，純化回收；同時(shí)，用ECORI、SPe I將pCAMB IA1304 載體進(jìn)行雙酶切，去除CaMV35S啟動(dòng)子，酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收大片段； 4) 在10 ill體系中，將回收的pCAMBIA1304載體大片段和回收的PCR產(chǎn)物用T4連接酶 4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，將篩選得到的陽性克隆用EC0RI、 SPeI進(jìn)行酶切驗(yàn)證，獲得得到表達(dá)Gus基因的植物重組表達(dá)載體pCAMBIA1304 :MaPIPl ; l-Promoter。
7. 含有權(quán)利要求4和5所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其特征在于：所述宿主細(xì)胞為 農(nóng)桿菌EHA105。
8. 下述各項(xiàng)之一在培養(yǎng)干旱性和鹽害性植物中的應(yīng)用，其特征在于： (1) 權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子； (2) 權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體； (3) 權(quán)利要求7所述的農(nóng)桿菌EHA105。
9. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的植物為擬南芥。
10. -種培育具有干旱性和鹽害性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 啟動(dòng)子克??； 2) 植物表達(dá)載體構(gòu)建； 3) 受體的遺傳轉(zhuǎn)化； 4) 陽性轉(zhuǎn)基因植株的鑒定； 5) 抗旱性和耐鹽性表型及生理分析。
【文檔編號】A01H5/00GK104313026SQ201410488543
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】許奕, 金志強(qiáng), 徐碧玉, 劉菊華, 賈彩紅, 張建斌, 胡偉, 苗紅霞, 王卓, 王甲水, 李羽佳, 王安邦, 宋順 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站