一種莢果蕨懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明研究了一種莢果蕨懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，包括無菌葉片的獲得、愈傷組織的誘導(dǎo)、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)及條件的優(yōu)化等步驟，本發(fā)明方法所制備的莢果蕨懸浮細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)好，增殖系數(shù)高，生長(zhǎng)周期短，次生代謝物含量高，為莢果蕨藥用成分工業(yè)化開發(fā)提供基礎(chǔ)。
【專利說明】一種莢果蕨懸淳細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及莢果蕨懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快繁方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 莢果藏，ifeiiewccia ￠. ^ Tbt/aro,球子藏科，株高可達(dá) 1 米。根 狀莖直立，連同葉柄基部密被針形葉鱗片。葉杯狀叢生，二型葉，不育葉兩短變小，2回羽狀 裂，新生葉直立向上生長(zhǎng)，展開后則成鳥巢狀?？捎~從葉叢中間長(zhǎng)出，葉柄較長(zhǎng)，粗而硬， 為不育葉的1/2,羽片莢果狀。產(chǎn)黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山西、河南、湖北西部、陜 西、甘肅、四川、新疆、西藏。也廣布于日本、朝鮮、俄羅斯、北美洲及歐洲。生山谷林下或河 岸濕地，海拔80-3000米。原產(chǎn)我國(guó)，多生于海拔900-3200米之間的高山林下。喜涼爽濕 潤(rùn)及半蔭的環(huán)境，也能忍受一定光照。冬季溫度不低于l〇°C。對(duì)土壤要求不嚴(yán)，但以疏松肥 沃的微酸性土壤為宜。目前莢果蕨的利用采取野生采集，關(guān)于其懸浮細(xì)胞的研究更無報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種莢果蕨懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，由該方 法所制備得到的莢果蕨懸浮細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)好，增殖系數(shù)高，生長(zhǎng)周期短，次生代謝物含量高，為 莢果蕨藥用成分的工業(yè)化開發(fā)提供基礎(chǔ)。
[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下方案來實(shí)現(xiàn)的： 取莢果蕨幼嫩葉片，在肥皂水中浸泡15min，流水沖洗15min，超凈工作臺(tái)上0. 1% 氯化汞處理8min，無菌水沖洗5-7遍，吸水紙吸去表面水分，消毒處理過的葉片接入 H+NAAO. 2mg/L+6-BA0. 2mg/L+頭孢噻腭鈉500 mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，附加 7. 5g/L瓊脂，30g/L蔗糖，1501x，溫度25°C，誘導(dǎo)的愈傷組織，選擇生長(zhǎng)良好，健壯的愈傷組 織，稱取〇· 3g加入6, 7-V+ ΚΤ0. 5mg/L+2, 4-Dlmg/L+20-10(^g/mL黑曲霉液體培養(yǎng)基中震蕩 培養(yǎng)，震蕩速度120r/min，每50ml細(xì)胞懸浮液裝入100ml三角瓶中培養(yǎng)，溫度28°C，光照 ΙΟΟΟΙχ，培養(yǎng)一定時(shí)間后，定期取出樣品，過濾出培養(yǎng)物，經(jīng)蒸餾水沖洗，用濾紙吸干細(xì)胞表 面水分，測(cè)定鮮重。
[0005] 采用本發(fā)明制備的莢果蕨懸浮細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)好，成活率高，生長(zhǎng)周期短，次生代謝物含 量高。
[0006] 下面將結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不 局限于下列實(shí)施方式。

【具體實(shí)施方式】 [0007] 實(shí)施例1 取莢果蕨幼嫩葉片，在肥皂水中浸泡15min，流水沖洗15min，超凈工作臺(tái)上0. 1% 氯化汞處理8min，無菌水沖洗5-7遍，吸水紙吸去表面水分，消毒處理過的葉片接入 H+NAAO. 2mg/L+6-BA0. 2mg/L+頭孢噻腭鈉500 mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，附加 7. 5g/L瓊脂，30g/L蔗糖，1501x，溫度25°C，誘導(dǎo)的愈傷組織，選擇生長(zhǎng)良好，健壯的愈傷 組織，稱取〇· 3g加入6, 7-V+ KTO. 5mg/L+2, 4-Dlmg/L+2(^g/mL黑曲霉液體培養(yǎng)基中震蕩 培養(yǎng)，震蕩速度120r/min，每50ml細(xì)胞懸浮液裝入100ml三角瓶中培養(yǎng)，溫度28°C，光照 ΙΟΟΟΙχ，培養(yǎng)一定時(shí)間后，定期取出樣品，過濾出培養(yǎng)物，經(jīng)蒸餾水沖洗，用濾紙吸干細(xì)胞表 面水分，成活率為93%。
[0008] 實(shí)施例2 取莢果蕨幼嫩葉片，在肥皂水中浸泡15min，流水沖洗15min，超凈工作臺(tái)上0. 1% 氯化汞處理8min，無菌水沖洗5-7遍，吸水紙吸去表面水分，消毒處理過的葉片接入 H+NAAO. 2mg/L+6-BA0. 2mg/L+頭孢噻腭鈉500mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，附加7. 5g/ L瓊脂，30g/L蔗糖，1501x，溫度25°C，誘導(dǎo)的愈傷組織，選擇生長(zhǎng)良好，健壯的愈傷組織，稱 取0· 3g加入6, 7-V+ ΚΤ0. 5mg/L+2, 4-Dlmg/L+5(^g/mL黑曲霉液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，震蕩 速度120r/min，每50ml細(xì)胞懸浮液裝入100ml三角瓶中培養(yǎng)，溫度28°C，光照ΙΟΟΟΙχ，培養(yǎng) 一定時(shí)間后，定期取出樣品，過濾出培養(yǎng)物，經(jīng)蒸餾水沖洗，用濾紙吸干細(xì)胞表面水分，成活 率為92%。
[0009] 實(shí)施例3 取莢果蕨幼嫩葉片，在肥皂水中浸泡15min，流水沖洗15min，超凈工作臺(tái)上0. 1% 氯化汞處理8min，無菌水沖洗5-7遍，吸水紙吸去表面水分，消毒處理過的葉片接入 H+NAAO. 2mg/L+6-BA0. 2mg/L+頭孢噻腭鈉500 mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，附加 7. 5g/L瓊脂，30g/L蔗糖，1501x，溫度25°C，誘導(dǎo)的愈傷組織，選擇生長(zhǎng)良好，健壯的愈傷 組織，稱取〇· 3g加入6, 7-V+ ΚΤ0. 5mg/L+2, 4-Dlmg/L+10(^g/mL黑曲霉液體培養(yǎng)基中震蕩 培養(yǎng)，震蕩速度120r/min，每50ml細(xì)胞懸浮液裝入100ml三角瓶中培養(yǎng)，溫度28°C，光照 ΙΟΟΟΙχ，培養(yǎng)一定時(shí)間后，定期取出樣品，過濾出培養(yǎng)物，經(jīng)蒸餾水沖洗，用濾紙吸干細(xì)胞表 面水分，成活率為91%。
【權(quán)利要求】
1. 一種莢果蕨懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，包括無菌葉片的獲得、愈傷組織的誘 導(dǎo)、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，其主要步驟如下： (1) 取莢果蕨幼嫩的葉片，在超凈工作臺(tái)上對(duì)其進(jìn)行消毒處理； (2) 取步驟（1)消毒處理過的葉片接入H+NAAO. 2mg/L+6-BA0. 2mg/L+頭孢噻腭鈉500 mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，附加7. 5g/L瓊脂，30g/L蔗糖，1501x，溫度25°C ; (3) 取步驟（3)誘導(dǎo)的愈傷組織，選擇生長(zhǎng)良好，健壯的愈傷組織，稱取0.3g加入 6, 7-V+ ΚΤ0. 5mg/L+2, 4-Dlmg/L+20-10(^g/mL黑曲霉液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時(shí) 間后，定期取出樣品，過濾出培養(yǎng)物，經(jīng)蒸餾水沖洗，用濾紙吸干細(xì)胞表面水分。
2. 按照權(quán)利要求1所述的一種莢果蕨懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，其特征在于：步 驟（1)中所述莢果蕨無菌葉片的獲得為，取莢果蕨幼嫩葉片，在肥皂水中浸泡15min，流水 沖洗15min，超凈工作臺(tái)上0. 1%氯化萊處理8min，無菌水沖洗5-7遍，吸水紙吸去表面水 分。
3. 按照權(quán)利要求1所述的一種莢果蕨懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，其特征在于：步 驟（2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中附加了頭孢噻腭鈉500mg/L，可以消除生長(zhǎng)過程中內(nèi)生菌的出現(xiàn)。
4. 按照權(quán)利要求1所述的一種莢果蕨懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，其特征在于：步 驟（3)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中附加了黑曲霉，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)量和次生代謝物質(zhì)的含量均有顯著的影 響。
5. 按照權(quán)利要求1所述的一種莢果蕨懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，其特征在于：步 驟（3 )懸浮細(xì)胞培養(yǎng)采用水平震蕩培養(yǎng)，震蕩速度120r/min，每50ml細(xì)胞懸浮液裝入100ml 三角瓶中培養(yǎng)，溫度28°C，光照ΙΟΟΟΙχ。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104186342SQ201410463169
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】楊存 申請(qǐng)人:南京通澤農(nóng)業(yè)科技有限公司